UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA SAN FERNANDO ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

BIOQUMICA Informe de Prctica de Laboratorio N3

Digestin enzimtica del almidn Profesor: Lic. T. M. Miguel Sandoval Grupo: C 2 Mesa: 4 Integrantes: Chirinos Quispe, Jos Luis(N38) Sosa Carmelo Claudia (N164) Isuhuaylas Aguirre Daniel (N80) Campo Victor Quispe 2012 I

I.INTRODUCCIN

La amilasa es una enzima que tiene por sustrato al glucgeno y el almidn, y es producida principalmente por las glndulas salivales y el pncreas. El almidn es un polisacrido constituido por amilosa y amilopectina. La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan. La -amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y liberando productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. La -amilasa hidroliza al almidn en maltosa; la enzima acta primero solo sobre los extremos no reductores. La hidrlisis de amilosa por la -amilasa es casi completa, pero la degradacin de amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificacin. La amilosa, que tiene pocas ramificaciones, se degrada casi por completo, por eliminacin repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. Las -amilasa de los mamferos necesitan la presencia de aniones para su actividad. En nuestro caso veremos como la presencia del in cloruro potencia la accin de la enzima. En esta prctica trabajaremos con la -amilasa salival en diferentes medios de reaccin y compararemos grado de hidrlisis del sustrato entre ellos. Para tal efecto comprobaremos la presencia de los productos de la digestin enzimtica utilizando los reactivos de lugol para reconocer polisacridos y de Benedict para reconocer la presencia de azcares reductores. Los fundamentos de los mismos sern analizados en los resultados del presente informe.

II.MARCO TERICO -Amilasa salival. La saliva es una mezcla derivada de la secrecin de 3 pares de glndulas, las partidas, submaxilar y sublingual, como tambin de pequeas glndulas mucosas ubicadas difusamente sobre la mucosa de la boca.

La cantidad normal secretada en una persona adulta es de 1 a 1,5 Iitros en 24 horas. La composicin de la saliva es un 99,5% H2O y 0,5 % de slidos orgnicos e

inorgnicos, el pH oscila entre 6,2 y 7,4. Los principales componentes orgnicos son las glicoprotenas, protenas (albmina, globulinas) y carbohidratos. Los componentes inorgnicos principales son calcio, sodio, potasio, magnesio y fsforo. La enzima -amilasa, presente en la saliva, inicia la degradacin del almidn, la principal fuente de carbohidratos de la dieta humana. Esta enzima hidroliza al azar los enlaces (1,4) que unen residuos de glucosa en el almidn, a excepcin de los enlaces cercanos a los extremos y a los puntos de ramificacin de las cadenas. Por la accin de esta enzima activada por iones cloruro, en la boca la longitud de la cadena del almidn se reduce de varios miles a unas ocho unidades de glucosa. La alta concentracin de protones del estmago inactiva la -amilasa salival. La digestin del almidn contina en el intestino delgado por la accin de la -amilasa pancretica, como producto se forma una mezcla del disacrido maltosa, el trisacrido maltotriosa y oligosacridos conocidos como dextrinas que poseen ramificaciones (1,6). Almidn + amilasa maltosa + maltotriosa + dextrinas El almidn y dextrinas complejas al ser tratados con una solucin de yodo dan un complejo de coloracin azul, mientras que las dextrinas ms simples, la maltotriosa y maltosa no dan una reaccin positiva. As, la accin de la -amilasa sobre polisacridos puede ser seguida midiendo la decoloracin del complejo azul hasta alcanzar el punto acrmico (solucin incolora).

La maltosa y otros carbohidratos reductores producidos en la reaccin pueden ser detectados por el test de Benedict. Este mtodo es cualitativo, consiste en una solucin alcalina de Cu2+ que se encuentra formando un complejo con citrato. El in cprico es reducido a Cu1+ por compuestos reductores con formacin de hidrxido cuproso amarillo o de xido cuproso rojo. El cambio de coloracin o la formacin de un precipitado rojo-ladrillo (Cu2O) indican la presencia de un compuesto reductor. Carbohidratos reductores tambin pueden detectarse y cuantificarse por los ensayos de Somogyi-Nelson y de la o-toluidina.

III.OBJETIVOS

1. Demostrar la actividad enzimtica (cataltica) de la amilasa salival sobre el almidn, determinando: La presencia del almidn no transformado (sustrato residual) mediante el reactivo de Lugol La presencia de carbohidratos reductores (productos de la reaccin) mediante el reactivo de Benedict. 2. Evaluar el efecto del in cloruro del cloruro de sodio sobre la actividad enzimtica de la amilasa 3.- Evaluar de forma experimental el efecto del pH sobre la actividad enzimtica de la amilasa

IV.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTALY RESULTADOS MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla Beaker Pipetas Tubos de ensayo Cocinilla elctrica Vaso de precipitacion para bao a 100C 1 pinza gruesa de madera Solucin de almidn 1% Buffer fosfato pH 6.8 Solucin de cido Clorhdrico 0.5 N Solucin de Cloruro de Sodio Solucin de Lugol Solucin de Benedict Agua destilada

METODOS Preparar una batera de tubos como sigue:

TUBOS DE DIGESTION Ml de almidn al 1% mL de buffer fosfato pH 6.8 0.1 M mL HCl 0.5 N mL H2O destilada mL NaCl mL saliva diluida

1 1.0 0.5 1.2 0.5

2 1.0 0.5 1.2 0.5

3 1.0 1.2 0.5 0.5

Incubar en bao Maria de 37 C por 10 minutos y cada 3 minutos agitar el tubo removiendo el almidn que tiende a sedimentar. Luego retirar del bao Maria y agitando previamente los tubos de la digestin preparar las siguientes bateras:

REACCIN DE LUGOL: Identifica la presencia de almidn por la aparicin de una coloracin azul oscura.
TUBOS Digerido 1 mL Digerido 2 mL Digerido 3 mL

1 1.0 -

2 1.0 -

3 1.0

HCl 0.5 N mL Solucin de Lugol mL

0.2 1.0

0.2 1.0

0.2 1.0

Mezclar y observar los resultados: REACCIN DE BENEDICT: Identifica la presencia de azcares reductores por la aparicin de un precipitado rojo ladrillo caracterstico.
TUBOS Digerido 1 mL Digerido 2 mL Digerido 3 mL Reactivo de Benedict mL

1 0.5 1.0

2 0.5 1.0

3 0.5 1.0

Colocar en bao de agua hirviente (100 C) por 2 a 3 minutos, observe los resultados.
PROCEDIMIENTO I

1. Un alumno debe enjuagarse repetidas veces la cavidad oral con abundante agua, y luego retendr la saliva aproximadamente por 5 minutos. La saliva acumulada se colectar en un beaker dejndola caer y evitando la formacin de espuma. 2. Preparar la siguiente batera de tubos: Tubo 1 1 0.5 1.2 0.5 Tubo 2 1 0.5 1.2 0.5 Tubo 3 1 1.2 0.5 0.5

Solucin de almidn 1 % (mL) Buffer fosfato pH 6,8 (mL) 0.1 M HCl 0.5 N (mL) Agua destilada (mL) NaCl (mL) Saliva diluida (mL)

3. Lleve todos los tubos a incubacin por 10 minutos a 37C, y cada 3 minutos agitar el tubo removiendo el almidn para que no sedimente. Asegrese que, una vez agregada la saliva diluida, los 10 minutos de incubacin sean igual para todos los tubos.

PROCEDIMIENTO II Se trabajar con los tubos hidrolizados en el Procedimiento I. Lo que se mide del tubo 1 se le denominar Tubo L1 cuando se trabaje con el reactivo de Lugol y Tubo B1 cuando se trabaje con el reactivo de Benedict, de igual modo para los tubos 2 y 3.

Reaccin de Lugol.- En presencia de almidn, la solucin se colorea de azul intenso. 1. Prepare la siguiente batera de tubos: Tubo L1 1 0.5 0.5 Tubo L2 1 0.5 0.5 Tubo L3 1 0.5 0.5

Digerido del Tubo 1 (mL) Digerido del Tubo 2 (mL) Digerido del Tubo 3 (mL) Acido Clorhdrico 0.5 N (mL) Solucin de Lugol (mL)

2. Homogenice, observe y calfiquelos cualitativamente.

Reaccin de Benedict.- En presencia de azcares reductores, se forma un precipitado de color rojo ladrillo. 1. Prepare la siguiente batera de tubos: Tubo B1 0.5 1 Tubo B2 0.5 1 Tubo B3 0.5 1

Digerido del Tubo 1 (mL) Digerido del Tubo 2 (mL) Digerido del Tubo 3 (mL) Solucin de Benedict (mL)

2. Homogenice suavemente los tubos y colquelos en bao de agua hirviente por 3-5 minutos.

RESULTADOS 1. Luego de llevar a cabo el procedimiento I, observamos que todos los tubos adquieren una coloracin blanquecina bastante diluda. 2. Despus de realizar la reaccin de Lugol en el procedimiento II, observamos lo siguiente: - El tubo L1 tom una coloracin amarillenta; lo que nos indica una reaccin de lugol negativa. - El tubo L2, del mismo modo, adquiere una coloracin amarillenta por lo que la reaccin se denomina lugol negativa. - El tubo L3, a diferencia de los anteriores, presenta una coloracin azl violeta intensa; indicando de ese modo, la presencia de polisacridos y concluyendo que en ese caso no hubo actividad enzimtica, pues no se hidroliz el almidn.

Imagen1.La fotografa indica la coloracin obtenida en cada tubo para el lugol. Se observa lugol positivo para el tubo L3.

3. Luego de realizar la reaccin de Benedict del procedimiento II observamos que: - El tubo B1 y B2 presentan un precipitado color rojo ladrillo lo que indica reacciones positivas para Benedict. Esto indica la presencia de azcares reductores provenientes de la hidrlisis enzimtica del almidn. El precipitado del tubo B1 es ms intenso que el precipitado del tubo B2. - El tubo B3 presenta una coloracin celeste turquesa lo que indica una reaccin negativa para Benedict. En este caso no hubo hidrlisis enzimtica. Algunos azcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el in Fe3+ o Cu2+. Esta caracterstica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azcares con un grupo carbonilo libre son llamados azcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra combinado en unin glicosdica se conocen como azcares no reductores. El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato de sodio. El Na2CO3 confiere a la solucin un pH alcalino necesario para que la reaccin pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al in Cu2+ en solucin ya tiene la propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre produce un complejo de color celeste turqueza. Si se le agrega al reactivo una solucin de azcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullicin, el azcar en solucin alcalina a elevadas temperaturas se convertir en D-gluconato y su n-diol, rompindose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos, reaccionarn con el Cu++. Se obtiene entonces un azcar oxidado y dos iones Cu+.

Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH- presentes en la solucin para formar el hidrxido de cobre: Cu + + OH - Cu(OH) 2Cu(OH) Cu2O (precipitado rojo ladrillo) + H2O

La aparicin de un precipitado que va desde amarillo, anaranjado a rojo ladrillo segn la concentracin de carbohidratos ,evidenciandose la presencia de un azcar reductor.

Imagen2.Muestra de los digeridos 1,2 y 3 y sus caractersticas en la Reaccion De Benedict y Lugol.

V.DISCUSIN

En el desarrollo de la prctica se pueden presentar errores que se observan en fallas que repercuten en los resultados; por ejemplo: si es que no hubo una correcta homogenizacin la reaccin con lugol puede tomar un color ms oscuro; otro factor a tener en cuenta es que algunas personas tienen en la saliva menos concentracin de la enzima que otras, lo que hace que la enzima sea considerada un factor limitante. Pero observamos que algunos posibles errores tambin podan pasar inadvertidos si es que no se toman las precauciones necesarias y la debida

atencin; tal es el caso de la falta de enzima que nos hubiera dado una reaccin de lugol positiva o una falta de sustrato nos habra dado una reaccin de lugol negativa o de no haber habido un correcto enjuague bucal podramos haber obtenido una reaccin con Benedict verdosa que indicara pequeas cantidades de azcar.

VI.CONCLUSIONES

1. Para la reaccin con lugol, los tubos 1 y 2 presentaron una reaccin negativa, osea hubo degradacin de polisacridos, esto se explica fcilmente ya que estos tubos estuvieron sometidos a una solucin buffer de pH 6.8 que asemeja las condiciones fisiolgicas normales que permiten dicha actividad hidroltica. En el tercer tubo sucedi todo lo contrario, es decir hubo una reaccin positiva para el lugol observndose una coloracin azul violeta intensa que indica la presencia del polisacrido y la ausencia de la actividad enzimtica. Este fenmeno tiene su explicacin en el cido clorhdrico 1N usado. La enzima amilasa salival no tiene actividad cataltica a pH cido. 2. Para la reaccin con Benedict, obtuvimos que los dos primeros tubos, a diferencia del tercer, reaccionaron positivamente presentando un precipitado color rojo ladrillo en el fondo del tubo. Podemos atribuir esta diferencia inicial a la diferencia de pH. El precipitado es xido cuproso en donde el cobre tiene como nmero de oxidacin +1. Hubo una reaccin de xido reduccin en donde el azcar reductor se oxida y el catin del reactivo de Benedict se reduce y se forma Cu2O que precipita de color rojo ladrillo. El pH para los dos primeros tubos es de 6.8, similar al de las condiciones normales de nuestro cuerpo; mientras que para el tercer tubo el medio es cido, lo cual inhibe la actividad enzimtica. La coloracin del precipitado para el tubo 1 fue ms intensa que para el tubo 2, esto indica mayor presencia de los azcares reductores que reaccionaron con el cobre. Es decir, el tubo 1 present mayor actividad enzimtica que el tubo 2. Esta diferencia de la actividad cataltica entre los dos primeros tubos se debe a que en el primer tubo usamos NaCl, que como observamos de acuerdo al resultado, actu como un activador, incrementando la cantidad del producto. Comprobndose que la enzima amilasa salival acta mas eficientemente en presencia del in cloruro tal comos se sabe por teora.

CUESTIONARIO 1. Determine el pH del medio de reaccin del tubo 3 Tubo3: 1mL de almidn al 1% 1.2mL de HCl 0.5N 0.5mL de agua destilada 0.5mL de saliva diluida Sabemos que: pH = -log [H+]

Como el HCl es un acido fuerte la normalidad es igual a la molaridad (0.5N=0.5M ) 0.5M: hay 0.5mol de HCl por 1000mL Entonces en 1.2mL de HCl habr 0.0006mol de HCl En el tubo 3 [H+]= moles de HCl/Volumen que contiene el tubo 3 [H+]= 0.0006mol/0.0032L Reemplazando y operando en pH = -log [H+] El pH del tubo 3 es 0.73 2. Describa el fundamento de la reaccin de Benedict y de la reaccin de Lugol

Reaccin del Lugol El lugol o solucin de Lugol es una solucin de yodo (I2) en equilibrio con yoduro de potasio (KI) formndose el triyoduro de potasio. El almidn es coloreado de azul en presencia de Lugol, debido a una adsorcin o fijacin del triyoduro (I3) sobre las unidades de glucosa que se encuentran dentro de los espacios helicoidales que presenta la Amilosa o la Amilopectina (almidon). Al calentar hasta ebullicin, desaparece el color( incoloro)debido a un cambio en la estructura tridimensional hacindose lineal y reaparece al enfriar (azul intenso).

Reaccin de Benedict La reaccin o prueba de Benedict identifica azcares reductores (aquellos que tienen su OH anomrico libre).En soluciones alcalinas, pueden reducir el Cu2+ que tiene color azul a Cu+, que precipita de la solucin alcalina como Cu2O de color rojo-naranja. El fundamento de esta reaccin radica en que en un medio alcalino, el ion cprico (otorgado por el sulfato cprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo aldnico del azcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al xido cuproso (Cu2O). El medio alcalino facilita que el azcar est de forma lineal, puesto que el azcar en solucin forma un anillo de piransico o furansico. Una vez que el azcar est lineal, su grupo aldehdo puede reaccionar con el ion cprico en solucin.