DNA MKROARREY TEKNOLOJS

Dr. Soner AKSU TBTAK MAM GMBE 21 Ekim 2008

Tanm

DNA MKROARRAY TEKNOLOJS

DNA mikroarreyleri, nkleik asitlerin hibridizasyon

zelliklerinden faydalanarak farkl tipte doku ya da

hcrelerde genom boyutunda DNA ve ya RNA

molekllerinin varl ve miktarn belirlemek iin

kullanlan bir teknolojidir.

Tanm- vurgu 1
asitlerin hibridizasyon

DNA mikroarreyler; nkleik zelliklerinden faydalanr.

Kaynak: Bioconductor short course. Dudoit, S., Gentleman R., Irizarry R., Yang HY

Tanm- vurgu 2

DNA mikroarreyler; doku ve organizma bamll yoktur.

- Farkl trlere spesifik olarak gelitirilmi mikroarrey ipler ile kapsaml analizler yaplabilir.

Tanm- vurgu 3

DNA mikroarreyler; snrlandrlm kapsamdan genom boyutuna kadar analiz imkan salar.

- zerlerinde binlerce farkl gene ait dizilerin/alt dizilerin

baland ok sayda spesifik nkleotide dizileri tarlar.

Tarihe kilometre talar

Mikroarrey ip Teknolojisi

- Her gen 16-20 oligonkleotid ile ifade edilir.

- Tam e (perfect match probe - PM) oligo: Genellikle 25mer tam doru oligonkleotid.

- Hatal e (mismatch probe - MM) oligo: Tam orta noktada (13th) yanl baz tayan oligonkleotid.

- Oligo ifti: PM-MM iftleri. Her gen iin 16-20 oligo ifti bulunur.

MM oligo dizayn ile non-spesifik balanma miktarnn ve arka plan grltnn llmesi amalanmtr.

Mikroarrey ip Teknolojisi

DNA microarraylerin retiminde genelde tip gelimi teknoloji kullanlmaktadr.

- Fotolitografi

- Mekanik Mikrodatm

- Ink Jets

Mikroarrey ip Teknolojisi

Kaynak: Bioconductor short course. Dudoit, S., Gentleman R., Irizarry R., Yang HY

Temel Kullanm Alanlar

miktarlarnn tespit edilmesi (gen

- Transkript

ekspresyon seviyesi analizi)

- Genotiplendirme (SNP ipleri)

- DNA kopya saysnn belirlenmesi

- mRNA bozunum hznn llmesi

- Protein balanma blgelerinin tanmlanmas

- Gen rnlerinin hcre ii lokalizasyonunun tespit

edilmesi

Transkriptom

Transkriptom; bir ya da bir grup hcre tarafndan retilen tm mRNA molekllerini ya da transkript varln ifade eden bir terimdir.

- her hangi bir organizmann tm transkript durumunu ifade etmek iin kullanlabilecei gibi, belli bir hcre tipinde belli bir transkript iinde kullanlabilir.

Transkriptom

mRNA ya da transkript seviyesi ve ierii bir hcrenin biyolojik durumunu ok hassas bir ekilde yanstr.

- Bulunduu geliim evresi

- Bulunduu hcre dngs durumlarnn genetik

- Hastalk ve salk seviyedeki etkileri

- Tedaviye ve evresel etkenlere kar verilen biyolojik cevap

Aratrma Alanlar
salam olduu

Mikroarrey teknolojisi transkriptom bilgileri ile;

- kanser aratrmalarnda

- immunolojik aratrmalarda

- kompkeks metabolik hastalklarn ve nemli fenotipik karakterlerin altnda yatan genetik temellerin daha iyi anlalmasna ynelik almalarda sklkla kullanlan bir yntemdir.

Uygulama - bileenler

rnek Hazrlanmas

Mikroarrey ip Hazrlanmas

Uygulama ve Analiz

Uygulama - aamalar

Kaynak: Bioconductor short course. Dudoit, S., Gentleman R., Irizarry R., Yang HY

Uygulama - aamalar

Kaynak: Bioconductor short course. Dudoit, S., Gentleman R., Irizarry R., Yang HY

Uygulama laboratuar aamalar 1

- Microarray iplerin retimi: Polimeraz zincir

reaksiyonu ile oaltlm DNA fragmanlar farkl

metotlar kullanlarak ip yzeyi zerine sabitlenerek

yaptrlr.

- rneklerin Hazrlanmas: Gen ifade seviyeleri

karlatrlmak istenen farkl rneklere ait olan

mRNAlar uygun kitler kullanlarak cDNA ya evrilir.

Uygulama laboratuar aamalar 2

- aretleme: cDNA rnekleri farkl yntemler mevcut olmasna ramen temel olarak cDNA sentezi srasnda farkl iaretler ile boyanr. En ok tercih edilen iki boya, krmz ma yapan Cy3 ve yeil ma yapan Cy5 iaret maddeleridir.

- Hibridizasyon: Doku ya da hcre rneklerinden elde edilen mRNAlardan iaretlenerek elde dilen tek iplikik halindeki cDNA rnekleri nce eit miktarda kartrlr ve ardndan ip zerinde sabit olarak bulunan oligolar ile hibridize olmalar salanr.

Uygulama laboratuar aamalar 3

- ip/Slide Grntleme: Lazer ile her nokta ma yapmas iin uyarlr ve gelen sinyal okunarak konfokal mikroskop ile grntlenir.

- Data Analizi: Elde edilen ham veriler eitli parametre ve karlatrmalar ile normalize edilir ve elde edilen sonular oranlanarak gen ifadesinde rnekler arasnda anlaml bir farklln olup olmad tespit edilir. Veriler farkl metot ve programlar kullanlarak analiz edilir.

Uygulama sinyal okuma

Kaynak: Bioconductor short course. Dudoit, S., Gentleman R., Irizarry R., Yang HY

Uygulama data analizi

Her spotta kayt edilen krmz ve yeil renkteki floresan mann iddeti spotlarda yer alan genlerin bir birlerine gre olan ekspresyon seviyelerini belirler.

- Eer spot yeil gzkyorsa bu renkle iaretlenen rnekte

sz konusu gen dier rnee gre fazla eksprese ediliyor demektir.

- Spotun krmz renkte gzlenmesi ise krmz ile iaretlenen rnekte bu genin dier rnee gre daha fazla eksprese ediliyor anlamna gelir.

- Eer spot sar grnyor ise, sz konusu gen ya da transkript karlatrlan her iki rnekte de eit ifade ediliyor anlamna gelir.

Uygulama data analizi

Uygulama istatistik ve mikroarrey

Kaynak: Bioconductor short course. Dudoit, S., Gentleman R., Irizarry R., Yang HY

Mikroarrey Biyoinformatii
Teknoloji Bilgisayar Gc Algoritma Analiz Aralar

Mikroarrey - avantajlar

- Ayn anda binlerce genin ekspresyonu hakknda bilgi verir.

- Binlerce nokta kullanlarak tm genom taramas ile detayl bir genotiplendirme imkan sunar.

- Amaca ynelik olarak fakl dizayn edilebilir.

- Laboratuar aamalar kolay ve hzldr.

- Teknolojisi ile geliimini salad biyoinformatik analiz yntemlerini kullanarak olduka fazla miktardaki verileri hzl ve farkl ekillerde analiz edebilir.

Mikroarrey nemli noktalar

- Probun seilmesi ve hedefin hazrlanmas

- Spotlamann dzgn yaplmas

- Yksek kalite ve saflkta RNA izolasyonu genler ile normalizasyona

- Kaliteli ve sabit iaretleme verimlilii

- Housekeeping gidilmesi

- Yeteri kadar tekrar kullanlmas

Mikroarrey rnek alma

Konu: Obezite gibi kompleks zellik gsteren metabolik bir hastaln genetik temellerinin daha iyi anlalmasnn salanmas.

Ama: Ekspresyon farkllna dayal olarak obezite tablosunun ortaya kmasna katkda bulunan aday genlerin tespit edilmesi.

Mikroarrey rnek alma

Uygulama: DNA Mikroarrey Genip teknolojisi: Mu11KsubA ve subB (11000 gen olmak zere toplam 13000 probe)

Sonu: Obez ve normal fareler arasnda anlaml derecede ekspresyonlar farkllk gsteren genlerin belirlenmesi.

Mikroarrey rnek alma

Soner Aksu, Dirk Koczan, Ulla Renne, Hans-Jrgen Thiesen, Gudrun A. Brockmann. Differentially expressed genes in adipose tissues of high body weight-selected (obese)

and unselected (lean) mouse lines. Journal of Applied Genetics 48(2): 133-143, 2007.

Teekkrler