Adriana Casique Bernal DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE SUSTANCIAS 12 DE MARZO DE 2012

La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza Cada inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas. molcula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de onda presenta una molcula -esto es, su espectro de absorcin constituye una sea de identidad de la misma. Transmitancia y Absorbancia La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100. La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma. Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales, la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda.

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Obtencin de un espectro de absorcin El espectro de absorcin es una representacin grfica que indica cantidad de luz absorbida a diferentes valores de absorbacia. A partir de una solucin diluida de un compuesto, cuya absorbancia mxima entra dentro del rango de medida del espectrofotmetro, se ver el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solucin de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorcin se obtendr el valor de al que el compuesto presenta la mayor absorbancia (max). Dicho se utilizar a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El espectro de absorcin de un cromforo depende, fundamentalmente, de la estructura qumica de la molcula.

Adriana Casique Bernal DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE SUSTANCIAS 12 DE MARZO DE 2012 OBTENCIN DE LA MUESTRA PROTEICA (Solucin madre) C= 10mg/ml: se pesaran. 05 g de clara de huevo y diluirlo en 5 ml de agua destilada.

OBTENCIN DE LAS SOLUCIONES (Solucin madre + agua destilada)

Tubo 1(BLANCO): agua destilada 1ml Tubo 2: Solucin estndar 0.1 ml + 0.9 ml agua destilada Tubo 3: Solucin estndar 0.2 ml + 0.8 ml agua destilada Tubo 4: Solucin estndar 0.3 ml+ 0.7 ml agua destilada Tubo 5: Solucin estndar 0.4 ml + 0.6 ml agua destilada Tubo 6: Solucin estndar 0.5 ml + 0.5 ml agua destilada

Agregado del reactivo de Biuret que solo se agrega cuando todos los tubos estn con su disolucin lista ya que a partir de que se coloca comienza la reaccin, y deben comenzar todas las soluciones al mismo tiempo.

Mezclamos y agitamos los tubos durante 10 a 30 segundos en el Vrtex

Dejamos incubar los tubos a 37 C durante 30 minutos. Transferir a celdas del espectrofotmetro y leer a 540nm usando el blanco como referencia.

Hacer la lectura de la transmitancia y absorbancia de las muestras. Calcular y graficar.