Herramientas estereolgicas en la investigacin biomdica

RESUMEN Los estudios estereolgicos son cada vez ms frecuente en la literatura, particularmente en el desarrollo / evolucin, la patologa y las reas de neurociencias. El desafo estereologa es comprender la disposicin estructural interna tridimensional basado en el anlisis de las rodajas de estructura nica que muestran informacin en dos dimensiones. Mtodos de Cavalieri y Scherle para estimar el volumen, y el problema de la aguja de Buffon, se coment en el contexto estereolgicos. Un grupo de acciones es necesaria para cuantificar adecuadamente las estructuras morfolgicas (objetiva y reproducible), por ejemplo, muestreo, isotrpica y uniforme al azar secciones (principio Delesse), actualizadas herramientas estereolgicos (disector, fraccionador, nucleador, etc.) A travs del uso estereologa correcto, un estudio cuantitativo con poco esfuerzo se puede realizar: la eficiencia en estereologa significa un recuento de los cortes mnimos de la muestra (poco trabajo), de bajo costo (preparacin rebanadas), pero una buena precisin. En el presente texto, un breve repaso de las herramientas principales estereolgicos se hace como una base de fondo para no expertos cientficos.

INTRODUCCIN Morflogos estn tradicionalmente interesado en la forma y composicin de las estructuras en los niveles macro, meso, microscpicos, y ultraestructurales. Recientemente, se han beneficiado morflogos por el uso de tcnicas genticas y moleculares para ayudar a la comprensin de sus problemas mejorando as las investigaciones biolgicas y biomdicas. Sin embargo, para las preguntas sobre las alteraciones cuantitativas de los tejidos, clulas u orgnulos celulares (que aparecen con frecuencia en la adaptacin, la evolucin o la patologa de un organismo), as como una mejor correlacin entre la morfologa y funcin, necesitamos un enfoque cuantitativo que se entiende bien (Weibel 1989, Mayhew1992, Roberts et al. de 2000,Andersen y Pakkenberg 2003). El desarrollo de una plataforma estructural cuantitativo para la biologa experimental, que se extiende a travs de una jerarqua de tamaos que van desde las molculas a los organismos, ha estado marcada por una serie de logros importantes en los ltimos aos (Bolender 1992). El reto de la estereologa es entender la estructura interior de disposicin tridimensional basado en el anlisis de los cortes de la estructura que slo muestran informacin en dos dimensiones (Figura 1), para que los principios estereolgicos tomen en consideracin la geometra y la estadstica de probabilidad (Weibel 1979, Jensen 1998 ). A pesar de la discusin sobre la nomenclatura como morfometra y estereologa podramos denominar el mismo mtodo (Aherne y Dunnill 1982) - la mayora de autores consideran la morfometra un mtodo cuantitativo de dos dimensiones que utiliza una pinza (principalmente una pinza de micrmetro, un manmetro con un tornillo micromtrico calibrado para la medicin de objetos finos bajo observacin microscpica).Por el contrario, estereologa no utiliza una pinza (y no realiza una medicin directa), pero es una sistema de prueba por lo general compuesta por puntos de prueba, lneas de pruebas sobre un marco conocido (o zona de prueba). Las principales diferencias entre la morfometra y estereologa se resumen en la Tabla I (Mandarim-de-Lacerda, 1999). Morfometra determina longitudes, permetros, reas y beneficia de las instalaciones de software de anlisis de imgenes. Estereologa calcula la densidad, las ms interesantes son las

densidades por unidad de volumen: la densidad de volumen (Vv), densidad de longitud (LV), la densidad de la superficie (Sv), y la densidad numrica (NV). La densidad por rea tambin puede ser estimada e informativa: la densidad de rea (AA) y la densidad por rea numrica (AN o QA) son ms frecuentemente estimadas (Pereira y Mandarim-de-Lacerda, 2001b). Todos los ndices se calculan mediante la aplicacin de frmulas especficas que se demuestra mejor en la secuencia. Sin embargo, la exactitud de los clculos se basa en los principios estadsticos (tamao de la muestra, al azar, e isotropa). El objetivo del diseo de muestreo para estereologa es obtener la mxima cantidad de informacin estructural cuantitativa en un coste total dado o esfuerzo. Principios de esos diseos y mtodos para la generacin de ellos sern discutidos. En general, la variacin entre individuos diferentes (la variacin biolgica) es el principal determinante de la eficiencia global, mientras que la variacin entre las caractersticas microscpicas individuales no es importante. Sin embargo, gastar tiempo y / o dinero con el fin de aumentar la precisin de las mediciones individuales, es irracional en casi todos los estudios que enfatizan los resultados biolgicos. Esto podra resumirse en la frase'' hacer ms menos bien'' (Gundersen y sterby 1981). En los ltimos 50 aos, los estudios estereolgicos han aparecido en la literatura cada vez ms frecuentemente, los primeros estudios han sido basados en pioneros (Chalkley 1943, Abercrombie 1946, Chalkley et al. 1949, Weibel y Gmez 1962, Weibel et al. 1966). La llamada "nueva estereologa'' se desarroll en los aos ochenta del siglo XX, una coleccin de procedimientos de inflexin estereologa ms fcil y objetiva (Gundersen et al 1983, Sterio 1984, Gundersen 1988.) - en realidad, la pregunta de sesgos y estereologa sigue estando hasta ahora en discusin, pero las nuevas tcnicas hacen la estereologa ms consistente (Hedreen 1999, Baddeley 2001, von Bartheld 2002, Gardella et al., 2003). Una explicacin sencilla acerca de la precisin y el sesgo en los estudios cuantitativos se puede comprobar en el esquema de la figura 2. La estereologa es dinmico y llena de perspectivas para el futuro, los nuevos enfoques a las viejas preguntas siguen estimulando a los estereologos para las posibilidades de prueba, un ejemplo interesante es la tcnica de ''sondas virtuales de esferas isotrpicas'', debido a que la superficie de una esfera es perfectamente isotrpica, todas las intersecciones de caractersticas lineales con la superficie tienen la misma probabilidad (Cruz-Orive y Gual Arnau-2002, Mouton et al., 2002). Se debe considerar que la parafina - o similares medios de incrustacin como Paraplast o Plus Paraplast - provoca una distorsin intrnseca de las estructuras: la contraccin causada por la infiltracin de fijacin, la deshidratacin y la parafina (Figura 3), y la compresin causada por la accin cuchillo en la direccin microtoma (La figura 4) (Weibel 1979). La contraccin en el material incrustado en parafina puede ser alrededor de 25% y compresin alrededor de 10% en relacin con el material fresco (Mandarim-de-Lacerda et al. 1985, Mandarim-de-Lacerda y Penteado 1988). A pesar de esto, es posible determinar las cantidades exactas de las estructuras morfolgicas en los niveles de tejido o clula ampliando matemticamente los resultados multiplicando la medicin por el encogimiento y los factores de compresin previamente determinados (Mandarim-de-Lacerda et al. 1987). Sin embargo, el alcance de la estereologa est lejos de ser un nmero "mgico'', una cantidad "exacta'' de clulas. El ''exacto" en este caso tiene un punto de vista estadstico. Por lo tanto, el estudio frecuentemente trata de comparar cantidades entre los diferentes grupos, el material que se prepar de forma similar. A travs de la comparacin, si la contraccin y la compresin son los mismos en todos los grupos, su correccin podra no ser necesario (todos correccin matemtica es inexacta, a veces conduce a una mayor polarizacin, cada vez ms difciles de interpretar en trminos biolgicos, que el material no corregido).

Es fcil comprender cmo la morfometra y / o estereologa puede ser til en los estudios sobre el desarrollo (Mandarim-de-Lacerda, 1991a, b, Almeida y Mandarim-deLacerda 2002), proceso de envejecimiento (Duffell et al. guila 2000, y Mandarim-de-Lacerda 2001, Pakkenberg et al. 2003), y el diagnstico anatomopatolgico (Elias et al. 1981, Collan 1985, Hamilton y Allen, 1995, Collan 1997, Hof et al., 2003). Los patlogos han hecho un esfuerzo para establecer nuevas y precisas clasificacionespara el diagnstico de patologas ambiguas, sobre todo en los carcinomas (cualquiera de los diversos tipos de tumores malignos derivados del tejido epitelial en varios sitios), lo que permite una estimacin pronstica (Hansen et al. De 1998, Ladekarl 1998). Los estudios cientficas estereolgicos tienen ventajas sobre los estudios cualitativos.En primer lugar, los resultados son numricos (no subjetiva), a continuacin,reproducible y fcil de ser verificada en cualquier momento por diferentes laboratorios.En segundo lugar, la comparacin entre los diferentes grupos (edades, especies, las acciones de drogas, manipulaciones, etc) se separan ms fcilmente, por lo tanto, estos mtodos son particularmente tiles para poner a prueba esas situaciones. En tercer lugar, el trabajo meticuloso comnmente asociados con los estudios cuantitativos prcticamente desapareci con la estrategia de muestreo riguroso y la forma asistida por el ordenador para llevar a cabo la estereologa moderna. En cuarto lugar, bien establecida base terica hace que el mtodo aceptable en gran medida. En quinto lugar, la necesidad de la formacin poco tiempo para los cientficos jvenes. Y, por ltimo, la necesidad de equipos de bajo costo (pero un equipo de alto escneo como un microscopio lser confocal de barrido es bienvenido) (Bolender 1981, 1982,Gundersen et al. De 1999, Bjarkam et al. De 2001, Kubinova y Janacek 2001, Kubinova et al. 2001, Pereira y Mandarim-de Lacerda2002, Charleston et al. 2003, Davey et al., 2003).

PREMISAS METODOLGICAS El enfoque estereolgico ha cambiado con el tiempo, pero todava se basa en algunas premisas metodolgicas. El ncleo de todos los pensamientos estereolgicos es en el principio del siglo XIX l gelogo frnces de la Delesse, como veremos ms adelante en la secuencia. Sin embargo, algunas de las preguntas en la estereologa se resuelven, o benefician de principios paralelos. A. LA ESTIMACIN DEL VOLUMEN Con frecuencia es necesario estimar el volumen de un rgano completo o partes de un rgano. Esta medida es esencial para estimar las cantidades estereolgicas absolutas, como veremos ms adelante. Hay dos mtodos principales que son utilizados normalmente para este clculo, el mtodo "desplazamiento de agua'' y el procedimientomediante el principio de Cavalieri. La determinacin del volumen de lquido por el desplazamiento fue resuelto por Arqumedes (287-212 aC). El rey Hiern de Siracusa encontr la corona hecha por un orfebre ms ligero que el estimado (por la cantidad de oro que dio al orfebre para hacer la corona). Observando el mtodo desplazamiento de agua cuando cay en una piscina para baarse, Arqumedes se dio cuenta de que poda resolver el problema.En ese momento empez a correr desnudo, gritando Eureka! Eureka! lo que significa, en griego antiguo, lo encontr! Lo encontr! - Este principio se ha adaptadopara estimar el volumen del rganos pequeos, el volumen es determinado segn el mtodo de inmersin en el cual se registra el desplazamiento de solucin salina isotnica debido al volumen de rganos se registra por el peso (W) (Scherle 1970).Como el peso especfico de solucin salina isotnica es 1,0048 el volumen

(V) se obtiene por: V = W/!, o sencillamente V!W (Weibel 1979). Normalmente, el peso se mide en gramos que necesitan transformacin a una unidad de volumen como milmetros cbicos, por ejemplo (recordar: 1g es igual a 103 mm 3). El matemtico italiano Bonaventura Cavalieri (1598-1647) inspirado en los antiguos griegos demostr que el volumen podra ser determinado en una estructura de cortes seriados por el producto de las zonas de los cortes, y el grosor del corte. Desde el punto de vista de la estereologa aplicada, Cavalieri mostr que el volumen de un objeto en forma arbitraria puede ser estimado de manera imparcial a partir del producto de la distancia entre los planos (T) y la suma de las reas de las secciones aleatorias sistemticas a travs del objeto ("A) (Mouton 2002). Figura 5 ilustra el mtodo, si las zonas estn determinadas por recuento de puntos, el volumen ser estimado sin ninguna medicin, solo el recuento de los punto. El mtodo es til en los rganos que absorben agua en lugar de desplazarlo o en rganos como los pulmones que no desplazan el agua (Michel y Cruz Orive-1988). En particular, es til en estructuras microscpicas, como el ganglio tico en rata (Costa et al. 1991) o en las estructuras inmersas en un tejido como el sistema de conduccin del corazn (Mandarimde-Lacerda y Penteado, 1988). B. PRINCIPIO DE DELESSE: '' ... De acuerdo con lo anterior, hemos reducido la evaluacin de los volmenes de diferentes minerales en la evaluacin de las superficies que presenten en las secciones de la roca, pero es fcil de reconocer que, suponiendo roca siempre homognea, sera llevar a esta misma evaluacin con longitudes interceptadas por diferentes minerales en las lneas dibujadas en estas secciones, aunque la determinacin de estas longitudes puede hacerse simplemente por medio de una lnea de divisin en la que el leer casi de inmediato'' (Delesse 1847). En una roca, compuesto de un nmero de minerales, el rea ocupada por cualquier mineral dado sobre una superficie de una seccin de roca es proporcional al volumen del mineral en la roca. El principio de la Delesse se basa en estructuras homogneas (en el punto de vista de estereolgicos en'' isotrpica y uniformidad al azar, IUR, secciones''). Slo en este caso podemos aceptar que:

que significa, en las secciones IUR, la relacin entre los puntos parciales (PP) contaba con una seccin en relacin al total de puntos posibles o puntos de prueba (PT) es equivalente a la relacin entre longitudes (parcial, LL, a longitud total, LT), zonas (parcial, AA, a la superficie total, AT) y volmenes (parcial, VV, el volumen total, VT). En consecuencia, se puede estimar la fraccin de la longitud, la fraccin de rea, o la fraccin de volumen de una estructura simplemente por recuento de puntos. La fraccin de volumen o densidad de volumen (VV) es una potente estimacin estereolgicos robusto, es decir, VV puede estimarse incluso cuando la seccin IUR no se puede demostrar en un primer momento. C. EFECTO HOLMES La muestra ideal es una seccin infinitamente delgada. El rea ocupada por cualquier componente puede ser sobre-estimado. Para el ojo colocado encima de la seccin, la imagen del componente aparecer para ocupar un rea mayor en la superficie de la seccin de lo que lo hace en realidad. En el caso de partculas con un buen contraste, es habitual hacer algn margen para el efecto Holmes si el dimetro medio de la partcula es menor de 12 veces el espesor de la seccin (Aherne y Dunnill 1982). La figura 6 muestra esferas cortadas por una seccin delgada y una seccin de

espesor. En consecuencia, la estimacin estereolgica debe tener en cuenta el efecto Holmes. Una correccin matemtica del efecto Holmes se puede hacer, aunque ninguna correccin es preferible mediante secciones delgadas. En la prctica, las secciones con no ms de 3m de espesor son tiles para la mayora de los procedimientos estereolgicos (una excepcin a la utilizacin de secciones delgadas es el mtodo disector, donde la seccin de espesor sobre 20m podra ser utilizado). D. EL PROBLEMA DE LA AGUJA DE BUFFON Georges-Louis Leclerc Conde de Buffon (nacido el 07 de septiembre 1707, Montbard, Francia muri el 16 de abril de 1788, en Pars). Naturalista francs, recordado por su obra completa sobre la historia natural, ''Histoire Naturelle, Gnraleet Particulire'' (iniciada en 1749). Fue creado un recuento en 1773. ''Creo que en una habitacin cuyo suelo se divide simplemente por juntas paralelas, lo tira un palo, y un jugador apuesta que la varita no cruzan el paralelo de la acusacin, y que la otra vez Apuesto a que el palo se cruzan algunos de estos paralelos, exigimos la fuerza de estos dos jugadores. Uno de los jugadores poco de este juego en un tablero con una aguja de coser o una cabeza de alfiler'' (Buffon 1777). El problema de la aguja era'' cul es la posibilidad de que una aguja lanzada al aire intersecte las lneas en un piso de parquet?'' En la estereologa moderna la pregunta debera ser'' cul es la probabilidad de que una lnea colocada al azar intersecte una red de lneas paralelas?'' (Mouton, 2002). Sobre esta base, el borde (b) y, en consecuencia, la densidad superficial (SV) de una estructura puede ser estimada (Figura 7):

donde d es la distancia entre las lneas de un sistema de prueba, que es el nmero de intersecciones de la frontera de la estructura con las lneas, y LT es la longitud total de las lneas. El SV es un sensible (no resistente) estimacin, la premisa de las secciones IUR necesita ser respetada en un primer momento (Cruz-Orive andWeibel 1990). E. PRODUCCIN DE LAS SECCIONES IUR Un rgano tiene estructura homognea (isotrpico o no orientado) cuando no somos capaces de decidir la seccin de orientacin de la observacin de su aspecto histolgico, de lo contrario, el rgano tiene una estructura heterognea (anisotrpico u orientados). Las secciones IUR son la base morfolgica para usar estereologa. Las secciones IUR siempre pueden obtenerse para permitir estudios estereolgicos. En los rganos con estructura homognea (hgado, las glndulas salivales, etc) las secciones IUR son fciles de obtener, cortar el tejido y la tincin de los cortes es suficiente. Los rganos con una estructura heterognea necesitan un procedimiento especial para obtener secciones IUR. Para destruir la orientacin estructural interna de un rgano hay dos mtodos principales que se han propuesto: el orientador (Mattfeldt et al 1990) y las secciones verticales (Baddeley et al, 1986.). El orientador es una evolucin de la ortrips (Mattfeldt et al, 1985): Est demostrado que la tericamente en las muestras anistropas la precisin de la estimacin de Lv y VS es considerablemente mayor si secciones IUR en conjuntos orientados de tres secciones perpendiculares (ortogonales sondas triples = ortrips ) se utilizan. Elorientador es una tcnica para la estimacin de la densidad de longitud y de superficiey otros parmetros

estereolgicos utilizando secciones IUR. Se trata de un enfoque imparcial, el diseo basado en el estudio cuantitativo de las estructuras anistropas, como el msculo, el miocardio, los huesos y cartlagos. Ningn equipo tcnico especial es necesario. Orientador puede ser generado sin dificultades en las muestras de gran tamao, como el msculo esqueltico humano, el miocardio, la placenta y tejido intestinal. Ligeras modificaciones prcticas amplian la aplicabilidad del mtodo a los pequeos rganos, como corazones de ratas. A nivel ultra estructural, un procedimiento de correccin de la prdida de anisotrpicas membranas mitocondriales debido a la orientacin oblicua sobre el haz de electrones ha sido sugerido. Otras posibles aplicaciones del orientador en estructuras anisotrpicas incluyen la estimacin de rea individual de la superficie de la partcula con nucleadores isotrpicos, la determinacin de la conectividad de redes de ramificacin con disectores isotrpicos, y la generacin de perfiles isotrpicos para estereologa de segundo orden (anlisis de patrones en tres dimensiones) (Mattfeldt et al., 1990). La figura 8 muestra el orientador hecho con el corazn de rata. Por ejemplo, en el rin, el diseo orientador puede obtenerse inicialmente por el corte del rgano al azar; el rin se coloca a continuacin en este corte y, de nuevo al azar, la muestra se corta con una seccin perpendicular al primer plano. La muestra se coloca de nuevo sobre la superficie de corte nuevo y una nueva orientacin aleatoria se define por el corte del rgano en una seccin perpendicular al plano. El ltimo corte se considera uniformemente isotrpicos: significa que sin hacer referencia a la posicin de la muestra en el primer corte la ltima superficie tiene una orientacin que vara de todos los posibles. Las secciones verticales son las secciones planas longitudinal a una direccin axial fija (pero arbitrario). Ejemplos son secciones de un cilindro paralelo al eje central y secciones de una losa plana normal al plano de la losa. Las secciones verticales de cualquier objeto puede ser generados mediante la colocacin del objeto en una tabla y tomando las secciones perpendiculares al plano de la mesa. Mtodos estndar de estereologa asumen las secciones IUR, y no son aplicables a este tipo de muestreo sesgado. Sin embargo, utilizando sistemas de prueba especialmente diseados (sistema de prueba de arcos cicloide), una estimacin imparcial de rea superficial se puede obtener (Mandarimde-Lacerda y Pereira 2001). Los supuestos acerca de la distribucin de la forma u orientacin de la estructura no son necesarios. La seccin vertical de estereologa es vlida en las mismas condiciones que los mtodos estereolgicos estndar para secciones al azar isotrpicas. La direccin del eje vertical se elige libremente, lo que hace el procedimiento de muestreo simple. La Figura 9 muestra las secciones verticales en un rgano.

SISTEMAS DE PRUEBA Y DE ADQUISICIN DE DATOS Los estudios estereolgicos necesitan lneas de prueba, puntos de prueba y un marco conocido (zona de ensayo) para obtener informacin de los sectores. Todos juntos, lneas, puntos y el marco de componer un sistema de prueba. Por lo general, los sistemas de prueba tienen una longitud de la lnea conocida (LT), el total de puntos (PT), y la zona de ensayo (EN). La Estereologa necesita esta informacin para estimar la densidad de volumen (VV: = PP / PT), la densidad de longitud (LV: = 2.QA), y la densidad superficial (SV: = 2.I/LT (usamos: =porque es una estimacin). Cualquier sistema de prueba tiene que ser superpuesta a una imagen. Este puede ser montado en el ocular del microscopio, o elaborado en acetato y puesto sobreimpresiones brillantes (esto es normalmente el caso con microscopio electrnico), o a travs de la pantalla del monitor en un sistema de vdeo microscpico. De todos modos, tenemos que contar con lneas y puntos que golpean las estructuras de tejido, o el nmero de objetos dentro del marco, para obtener la informacin suficiente para las frmulas estereolgicas (Gundersen et al. 1988b, CruzOrive and Weibel 1990,Mandarim-de-Lacerda, 1999).

La figura 10 muestra un sistema de prueba clsico llamado multipropsito" sistema de prueba o M42. Una longitud de la lnea corta, d, se utiliza para la calibracin; AT es 36.36d2, LT es 21d y el PT es de 42 (Weibel et al 1966).. Otro sistema de prueba compuesto por arcos cicloides es particularmente til con secciones verticales y muestras estratificadas (piel, mucosas, corteza, etc) (Figura 11) (Gundersen et al. 1988b). Si SV no es necesario para ser estimado recuerda que SV no es robusto, necesitan secciones IUR y, por tanto, un gran esfuerzo (un gran costo) es normalmente necesario para estimar SV, un sistema de prueba sin lneas podra ser utilizado (como el ejemplo de la Figura 12), permitiendo recuentos fciles y rpidos sin prdida de precisin. Dado que el esterelogo dans Hans Gundersen demostr la que la sobre-estimacin provoc el efecto de borde, dos bordes de un marco han sido sistemticamente considerados "prohibidos", y todas las estructuras afectadas por estos bordes no se consideran en el conteo (Figura 13) (Gundersen 1977). En el ejemplo de la Figura 14, un corte de la corteza renal observada bajo microscopa de luz se va a contar con el sistema de prueba de M42. La ampliacin de la imagen de lnea corta (d) corresponde a 25m (por lo tanto, AT = 22, 725m2 y LT = 525m). Cinco glomrulos pueden ser contados en el marco sin golpear la lnea prohibida o sus extensiones (N = 5), siete puntos por golpear glomrulos (Pp = 7), y seis lneas intersectan la cpsula de Bowman (I = 6). En estas condiciones, Vv: = 16,7%; QA (o NA): = (5/22, 725) / m2 o 220/mm2; SV: = 0.0229m2/m3 o 23mm2/mm3. Una rutina para el clculo se puede simplificar con una instalacin de software. Por supuesto, esto es el resultado de un slo campo microscpico. El trabajo estereolgico necesita una muestra de campos por persona, a algunos individuos por grupo. La correcta planificacin sobre la cantidad de recuento es fundamental para una buena de estereologa y se debe hacer en un primer momento. En de estereologa, la eficiencia se mide por el y la idea del mtodo disector (ntese que la palabra disector tiene slo una s de acuerdo con su primera descripcin) (Sterio 1984). La mayora de los autores consideran el mtodo disector imparcial (Bendtsen y Nyengaard 1989, Fiala y Harris, 2001, Charleston et al. 2003), pero no por unanimidad (Hedreen 1999, Baddeley 2001, von Bartheld 2002). Cuando el mtodo disector complet 10 aos de uso una interesante revisin demuestra cmo el mtodo ampliado en la literatura, con gran impacto en el conteo y el tamao de las partculas biolgicas (Mayhew y Gundersen, 1996). La figura 15 muestra los principios bsicos del mtodo disector en el cual se obtiene Nv en juegos de dos secciones paralelas con una separacin conocida (espesor).Para evitar la sobre estimacin del el recuento de un plano (del plano mirar hacia arriba del plano o mirar hacia abajo del plano) se considera prohibido y el recuento debe hacerse slo en un plano (porque esta cuenta se denomina Q-). Por ejemplo, si la mirada hacia abajo del plano es considerado prohibidos sin objetos afectados por este plano se cuentan, pero afectados por la mirada arriba del plano. Los recuentos se hicieron en un marco de rea conocida AT (teniendo en cuenta la lnea prohibida y sus extensiones como se describe antes). Por lo tanto, una prueba de volumen se construye (AT multiplicado por grosor), cuenta en esta prueba de volumen es considerado imparcial (Gundersen et al. 1988a,Mandarim-de Lacerda y Costa 1993, Mandarim-de-Lacerda et al. 1995, Burity et al. de 1996, guila y Mandarim-de Lacerda-1999, Mandarim-de -Lacerda y Pereira 2000,Pessanha y Mandarim-de-Lacerda 2000, Melo et al. 2002). El disector ptico se compone de los recuentos realizados en secciones gruesas observados con un microscopio de luz adaptada con el eje z en la plataforma mvil (para determinar con exactitud la distancia entre los planos de arriba y abajo del disector, o T de espesor). El disector fsico se compone de los recuentos realizados en fotomicrografas (Figura 16) (Pereira yMandarim-de-Lacerda, 2001a) o micrografas electrnicas de los aviones arriba y abajo. La densidad numrica de los objetos (NV) se puede estimar como:

El nmero absoluto de los objetos (N) se puede estimar si el volumen del rgano (tejido) es conocido (V, mtodo de Scherle de desplazamiento de agua o un mtodo de Cavalieri ya se ha descrito): N = NV V. El fraccionador es otro mtodo imparcial utilizado para cuantificar el nmero de objetos. Se utiliza el principio de la tcnica manual del conteo de las clulas sanguneas, la sangre se diluye muchas veces y, al final, las clulas sanguneas se cuentan en esta muestra diluida. El nmero del conteo debe ser multiplicado por las diluciones, permitiendo que el nmero de clulas estimado en la sangre intacta. Con la tcnica fraccionador se produce el mismo proceso. El rgano est completamente en cortes, una fraccin conocida de cortes se toma (por ejemplo, una cada tres cortes) y cortado en tiras, una fraccin conocida de tiras (por ejemplo, una cada cuatro tiras) se toma y se cort en fragmentos, una fraccin conocida de los fragmentos (por ejemplo, uno cada cinco fragmentos) est incrustado y se seccionaron serialmente. Por ltimo, una fraccin conocida de las secciones se analiza (por ejemplo, una cada tres secciones) y todos los objetos se cuentan en estas secciones elegidas. Este nmero de cuenta (N [cuenta]) se debe multiplicar por fracciones para recomponer el nmero absoluto de los objetos (N [objetos]) en el rgano (Pakkenberg y Gundersen 1988, West et al. 1991, Nyengaard y Bendtsen 1992). En el ejemplo anterior:

LO LTIMO PERO NO PALABRAS FINALES Esta breve resea se dirigi a los cientficos que trabajan en diferentes campos de la biologa y la medicina. El autor no lo consider un espacio adecuado para una larga discusin sobre estereologa, pero un texto informativo para motivar a los jvenes cientficos, con miras a una lectura cmoda de los textos modernos. Algunas tcnicas de estereolgicas no se han descrito aqu (ponderado por volumen del volumen nuclear, el volumen de hueso estrella, nucleador, etc) para seguir estas caractersticas de texto, pero esto no implica que son menos importantes para la cuantificacin morfolgica. Para ms detalles, los lectores se ven obligados a libros de texto completos y actualizados (Howard y Reed 1998, Russ y Dehoff 2000, Mouton, 2002).El anlisis estadstico de los datos estereolgicas es un complemento importante para el presente texto (Jensen, 1998).