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(10ml)
o Vasos de precipitacin (1000ml, 500ml,100ml, 50ml, 10ml)
o Fiolas (1000ml, 500ml, 100ml, 50ml, 10ml)
o Gradillas
o Probetas
o Termmetros
o Tips, FISHERBRAND
(1000ul, 200ul, 100ul)
o Micropipetas, Gene Mate
o Matraces erlenmeyer, PIREX
5.3.2 Equipos
o Equipo micro kjeldahl para la determinacin de protena.
o Equipo completo para la determinacin de fibra.
o Equipo Soxhlet para la determinacin de grasa.
o Refractmetro porttil de mesa, con rango de lectura de 0-50%
de Slidos solubles, Carl Zeis.
o Potencimetro, marca Orin, modelo 301, rango de pH 014.
o Refrigerador marca Lehel.
o Pulpeador o majador, marca Kamplex tipo Ep-9 con juego de
tamices.
o Bomba de vaco, tipo pV 35-535 (EE.UU.)
o Balanza analtica modelo AE 163 (METLER TOLEDO,
Switzerland)
o Estufa modelo ODH6- 9240A (TOMOS Heatring Drying Oven)
o Potencimetro modelo 3510 (JENWAY)
o Congeladora
o Desionizador modelo D 7035 (Barnstead)
o Autoclave modelo 9000 D (Napco)
o Espectrofotmetro modelo Genesys 6 (Thermo Electrn
Corporation)
o Agitador magntico modelo 625 standard (VWR
TM
hotplate/stirrer)
o Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientific
industrias SI
TM
)
o Centrifuga modelo MIKRO R22 (Hettich Zentrifuge)
o Bao mara modelo YCW-010E (Associated With Cannic, Inc,
USA)
5.3.3 Reactivos y solventes
o (+)-catequin, Sigma Chemical
o Solucin de fenol folin-ciocalteu, Sigma Chemical
o Carbonato de sodio, Sigma Chemical
o Etanol 95%, Sigma Chemical
o 2,2-Difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), Sigma Chemical
o 2,2-azinobis (3-etilenobenzotiazolino-6 acido sulfnico)
(ABTS), Sigma Chemical
o 2,2-azobis-(2-amidopropano) hidrocloride (ABAP), Sigma
Chemical
o Cloruro de sodio, Sigma Chemical
o Fosfato de sodio hepta hidratado, Sigma Chemical
o Monofosfato de potasio, Sigma Chemical
o Metanol (grado HPLC), Sigma Chemical
5.4 Mtodos de anlisis
5.4.1 Anlisis de la materia prima
5.4.1.1 Caractersticas Fsicas
Medidas fsicas y biomtricas, se realizara en la materia
prima, uvilla; se utiliz un micrmetro, midiendo la uvilla, el dimetro y longitud
promedio; el peso promedio, (ZAVALA, 1999).
5.4.1.2 Anlisis qumico proximal
La materia prima ser sometida a los siguientes anlisis:
- Humedad, mtodo 23.003 (AOAC, 1 997).
- Protena, mtodo 991.29 (AOAC, 1 997).
- Grasa, mtodo 948.15 (AOAC, 1 997).
- Ceniza, mtodo 942.50 (AOAC, 1 997).
- Fibra, Se determinara por el procedimiento descrito por
HART Y FISHER (1 991).
- Carbohidratos, por diferencia restando de 100 el
porcentaje de protena, grasa, humedad y ceniza (HART y FISHER, 1 991).
5.4.2 Capacidad Antioxidante in Vitro empleando radicales: DPPH y
Peroxilos.
5.4.2.1 Degradacin radical 2, 2 diphenyl 1 picrilhydrayl
(DPPH)
Este mtodo, desarrollado por Brand- Williams et al., 1995,
se basa en la reduccin de la absorbancia medida a 515 nm del radical DPPH,
por antioxidantes; con modificaciones el mtodo descrito por Sandoval et al.,
2001.
Se preparara soluciones stock de 1 mM DPPH en etanol
95% (10ml) y 1 mM (+)-Acido ascrbico en agua desionizada (10ml). La
solucin de DPPH y cido ascrbico se homogenizara por 5 minutos hasta una
completa solubilizacin del compuesto, se almacenara a 4 C protegido de la
luz con papel metlico. A partir de la solucin stock se preparar 50 ml de 100
M DPPH en etanol 95%. Al mismo tiempo, se preparo concentraciones
crecientes de cido ascrbico a partir de la solucin stock.
Las concentraciones de las muestras son 40x de la
concentracin final. Luego se agreg 25 ul de la muestra en 975 ul de la
solucin de 100 uM DPPH en una cubeta de poliestireno (1 cm x 1 cm x 4.5
cm). La inhibicin de los radicales libres DPPH se determin por la
decoloracin de la solucin violeta a amarillo, el cual es medido con
espectrofotmetro a 515 nm. Para la determinacin del porcentaje de inhibicin
se utiliz la siguiente ecuacin:
( )
100 %
(
=
AbsControl
AbsMuestra AbsControl
DPPH Inhibicion
Abs Control: es la absorbancia a tiempo = 0 min y Abs
Muestra: es la absorbancia a tiempo = 5 min.
5.4.2.2 Degradacin de radical Peroxlo
Se realizara mediante el mtodo de TRAP (poder total de actividad
reductora), reportado por SANDOVAL et al., 2001.
Se preparara soluciones de 2.25 mM ABTS (12mL), 20 mM ABAP
(12mL) y PBS (Solucin buffer fosfato) pH 7.4 (1L) mezclando 154 mM Cloruro
de sodio, 2.7 mM Fosfato de sodio heptahidratado y 1.5 mM Fosfato de potasio
monobsico.
Luego se preparara la siguiente solucin: Se Mezclara 10 mL de
2.25 mM ABTS, 10 mL de 20 mM ABAP y 80 mL de PBS (pH 7.4); la mezcla se
llevo a incubar a 70C en bao Mara por 20 minutos. Luego se deja enfriar
sobre el hielo durante 5-10 minutos. Finalmente se agregar 10 L de muestra
a 990 L de la solucin de radicales ABTS
+
en cubetas de poliestireno.
La inhibicin de los radicales peroxilos se determinara por la
decoloracin de la solucin de radicales ABTS
+
, el cual se medira con un
espectrofotmetro a 414 nm. Para la determinacin del porcentaje de inhibicin
se utilizara la siguiente ecuacin:
( )
100 %
(
=
AbsControl
AbsMuestra AbsControl
Peroxilo Inhibicion
Abs Control: es la absorbancia a tiempo = 0 min y Abs Muestra: es
la absorbancia a tiempo = 5 min.
5.4.3 Cuantificacin de polifenoles totales
Se realizara mediante el mtodo de espectrofotometra de
absorcin molecular descrito SANDOVAL et al, 2001.
Se preparara soluciones stocks de 20% Na
2
CO
3
(100 mL) y 1 mM (+)-
Catequin en metanol (grado HPLC) (10 mL). Se agregara a cada tubo 1.58 mL
de agua desionizada y 20 L de muestra, control y estndares, se
homogenizara ligeramente.
Para los estndares se preparara de la solucin stock de 1 mM (+)
catequina las siguientes concentraciones: 1, 3, 10, 30,100 g/mL
Luego se agregara 100 L de solucin de fenol Folin-Ciocalteu a cada
muestra, control y estndares, a estas mezclas se incubara por 1 minuto a
temperatura ambiente; se neutralizara la reaccin agregando 300 L de 20%
de Na
2
CO
3
y finalmente se incubara por 2 horas a temperatura ambiente, para
una completa reaccin.
Para determinar la cantidad de compuestos fenlicos producidos
durante la reaccin, se agregara 1 mL de muestra, control o estndar en una
cubeta de poliestireno (1 cm x 1 cm x 4.5 cm) y fue leda la absorbancia a 700
nm.
1000
.
. . /
D F C
pulpa de g a mgCatequin
F
=
Donde:
C
F
: Es el valor de X de la ecuacin para cada repeticin.
F.D:
Es el factor de dilucin.
VI. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
6.1 Caracterizacin de la materia prima
6.2.1 Anlisis fsico
Medidas biomtricas y la cuantificacin de los componentes de la
fruta.
6.2.2 Anlisis qumico
Determinacin de humedad, carbohidratos, cenizas totales, grasa,
fibra bruta, slidos solubles. Se realizaran estos anlisis con los mtodos ya
descritos en los mtodos de anlisis (preparacin de muestras).
6.2 Capacidad Antioxidante in Vitro empleando radicales: DPPH y
Peroxilos.
6.2.1 Degradacin radical 2, 2 diphenyl 1 picrilhydrayl (DPPH)
Este mtodo, desarrollado por Brand- Williams et al., 1995, se basa
en la reduccin de la absorbancia medida a 515 nm del radical DPPH, por
antioxidantes; con modificaciones el mtodo descrito por Sandoval et al., 2001.
6.2.2 Degradacin de radical Peroxlo
Se realiz mediante el mtodo de TRAP (poder total de actividad
reductora), reportado por Sandoval et al., 2001.
6.3 Cuantificacin de polifenoles totales
Se realizara mediante el mtodo de espectrofotometra de
absorcin molecular descrito SANDOVAL et al, 2001.
VII. DISEO EXPERIMENTAL
Para el presente trabajo de investigacin se considerara lo
siguiente:
Donde:
A : Estados de madurez
A
1
= Pinton
A
2
= Maduro
B : Repeticiones
Por consiguiente el diseo experimental obedece a un diseo
completo al azar de dos factores y con 3 repeticiones.
A
1
Zumo de uvilla
A
2
b
1
b
2
b
3
b
1
b
2
b
3
Actividad antioxidante y
contenido de polifenoles
VIII. ANALISIS ESTADISTICO
La ecuacin del modelo estadstico a utilizar ser:
Y
ijk
= U + A
i
+ B
j
+ E
ijk
Donde:
U = media general
A
i
= Estados de madurez
B
j
= Repeticiones
Para ver la existencia de significancia y poder comparar los factores
estudiados se realizara una prueba de t.
IX. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
En el siguiente cuadro, se muestra el cronograma de actividades, los
meses divididos en semanas.
Cuadro 3. Cronograma de actividades
Actividades Meses
1 2 3 4 5
Elaboracin del proyecto XX
Presentacin y aprobacin del Proyecto XX
Desarrollo de pruebas experimentales XXXX XXXX XXXX
Redaccin del informe XXX XXXX XXXX
Donde:
X = Semanas.
X. PRESUPUESTO
En el Cuadro 4, se presenta el presupuesto para la ejecucin de
este trabajo de investigacin.
Cuadro 4. Presupuesto para la ejecucin del trabajo de investigacin.
Rubro
Cantidad
Precio Unitario
(S/.)
Precio Subtotal
(S/.)
I. Materia prima
I I. Reactivos
- Etanol comercial
- cido glico
- Cloruro de hierro
- Ferrocianuro de potasio
- cido clorhdrico
III. Papel bond-A4
IV. Lapiceros
V. Cartucho de impresora
VI. Servicios
Procesamiento de datos, alquiler
de computadora
VII. Servicios de Internet
VIII. Cubetas de poliestireno
IX. Otros Imprevistos (10% )
1000 unidades
3 unidades
2 unidades
100 horas
120 horas
2 cajas
14.00
3.00
100
1.00
1.00
120.00
100.00
50.00
500.00
28.00
9.00
200.00
100.00
120.00
240.00
100.00
TOTAL (S/.) 1347.00
XI. BIBLIOGRAFIA
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