Estrs agudo o crnico induce la fosforilacin de clulas compartimiento especfico del receptor de glucocorticoides y alteran su actividad transcripcional en el cerebro

de ratas Wistar
Adzic et al. (2009

Resumen El stress crnico y la alteracin de la retroalimentacin del receptor de glucocorticoides son factores importantes en el compromiso de la actividad del eje hipotlamo- hipfisis-adrenal. Se investigaron los efectos del aislamiento crnico de ratas Wistar de 21 dias, sobre la retroalimentacin negativa de la regin extrnseca de eje hipotlamo-hipfisis-adrenal: el hipocampo y la corteza prefrontal. Adems de corticosterona srica, seguimos la localizacin subcelular del receptor de glucocorticoides, la fosforilacin del receptor de glucocorticoides en serina 232 y serina 246, la expresin de los genes reguladores del receptor de glucocorticoides: GR, CRF y el factor neurotrpico derivado del cerebro (BDNF), y la actividad de c-Jun N-terminal kinaza y Cdk5 kinazas que fosforilan el receptor de glucocorticoides. Estos parmetros fueron determinados tambin en los animales sometidos a inmovilizacin aguda durante 30 minutos, que fue tomada como respuesta adaptativa "normal" al estrs. En los animales aislados, se encontr disminucin de corticosterona srica, mientras que en animales expuestos a la inmovilizacin aguda, la corticosterona srica se increment notablemente. A pesar de que el receptor de glucocorticoides fue predominantemente localizado en el ncleo del hipocampo y corteza prefrontal en el estrs agudo, pero no el estrs no crnico, la expresin de los receptores de glucocorticoides, IRC, y genes del factor neurotrpico derivado del cerebro fueron regulados de manera similar tanto en el estrs agudo como estrs crnico. Por lo tanto, la actividad transcripcional de los receptores de glucocorticoides bajo el aislamiento crnico no parece ser exclusivamente dependiente de los niveles sricos de corticosterona serica alta ni en la localizacin subcelular de la protena receptora de glucocorticoides. Por el contrario, el resultado del aumento de la activacin de Cdk5 y la fosforilacin del receptor nuclear de glucocorticoides en la serina 232 y la disminucin de la actividad de JNK reflejada en disminucin de la fosforilacin del receptor nuclear de glucocorticoides en la serina 246. Nuestro estudio sugiere que esta isoforma nuclear del hipocampo y los receptores de glucocorticoides de la corteza pueden estar relacionados con el hipocorticismo, es decir, hipo actividad del eje Hipotlamo-Hipfisis-Adrenal bajo estrs de aislamiento crnico.
Resultados

El estrs crnico disminuye el nivel de corticosterona srica, sin menoscabo de la capacidad de respuesta al estrs agudo posterior. La concentracin srica de corticosterona se detect mediante un kit de suero comercial corticosterona (Tabla 2). En el grupo control de ratas Wistar, el nivel de corticosterona srica fue de 137 ng / ml, y se encontraba en el mismo rango reportado por otros autores (Merino et al. 2000, Wren et al. 2002). Como era de esperar, la exposicin aguda (30 min) para destacar la alta intensidad fsica-emocional-psico-social, tales como la inmovilizacin, se tradujo en un aumento en los niveles sricos asignificant CORT a 627 ng / ml. En el aislamiento contrario, crnica durante 21 das (lowintensity pero el estrs psicosocial a largo plazo) dio lugar a disminucin significativa en los niveles sricos de corticosterona srica a 65 ng / ml, de acuerdo con los informes anteriores (Snchez et al. 1998, Malkesman et al. 2006) . Cuando los animales con estrs crnico fueron sometidos posteriormente a la inmovilizacin aguda (es decir, el estrs combinado), suero de corticosterona srica aumenta a un nivel similar a la observada despus de un estrs agudo (Tabla 2). El estrs crnico no altera la localizacin subcelular del receptor de glucocorticoides en el hipocampo Los efectos del estrs agudo y el estrs combinado (que result en altos niveles sricos de corticoesteroides -vase el cuadro 2) a nivel de los receptores de glucocorticoides (tGR) del hipocampo se refleja en la significativa reduccin de los receptores citoplasmticos de glucocorticoides y aumento de los receptores nucleares de glucocorticoides (tGR) (Fig. 1D). Por el contrario, los niveles citoplasmticos y nucleares de la protena de los receptores de glucocorticoides del hipocampo se mantuvieron sin cambios despus de un estrs crnico. A pesar de que podemos detectar el receptor de glucocorticoides en ambos compartimientos, los

resultados en la Fig. 1 muestran que el estrs crnico y el estrs combinado indujeron la translocacin nuclear del receptor, mientras que el estrs crnico no induce la translocacin GR (Fig. 1). La fosforilacin del receptor de glucocorticoides en S232 es dominante sobre la fosforilacin de S246 independiente del tipo de estrs o compartimiento celular Con el fin de analizar los efectos del estrs sobre la funcin del receptor de glucocorticoides en el hipocampo, se analiz su estado de fosforilacin. Protenas quinasas dependientes de ciclina fosforilan S224 y S232 del receptor de glucocorticoides de ratn, en tanto que la va de JNK ha sido demostrada para la fosforilacin del aminocido S246. Se ha sugerido que la fosforilacin de estos residuos es de importancia en la regulacin de la actividad transcripcional del receptor de glucocorticoides y la especificidad gen diana (Ciegos y Garabedian 2008, Davies et al. 2008) En la siguiente serie de experimentos, se observ un aumento en el nivel de fosforilacin del receptor de glucocorticoides S232 tanto en los extractos citoplasmticos y nuclear del hipocampo siguiendo estrs agudos y crnicos (Fig. 1A, el panel B en segundo lugar, y D). En los animales sometidos a estrs combinado, receptor de glucocorticoides S232 fue similar al nivel de control en ambos compartimientos (Fig. 1D). Por otra parte, los niveles de fosforilacin citoplasmtica y nuclear del receptor de glucocorticoides S246 fueron menores que el control en la mayora de las muestras (Fig.1A, el panel B en primer lugar, y D). La relacin de fosforilacin del receptor de glucocorticoides 232/246 se determin con el fin de comparar cuantitativamente el grado de fosforilacin del receptor de glucocorticoides en S232 o S246 (Fig. 1D). Los valores de la relacin por encima de 100% indican el predominio de la fosforilacin del receptor de glucocorticoides S232, mientras que los valores por debajo de 100% sugieren la prevalencia de la fosforilacin del receptor de glucocorticoides S246. Este enfoque indica que la fosforilacin del receptor de glucocorticoides en la S232 es predominante en comparacin con el de S246, independiente del tipo de estrs o del compartimento celular analizado. La nica excepcin fue la del receptor citoplasmtico de glucocorticoides en S232 yS246 (Fig. 1D). La ms alta proporcin de fosforilacin del receptor de glucocorticoides 232/246 se encuentra en el grupo de animales con estrs crnico en ambos compartimientos. Cambios en la expresin de las protenas Cdk5, p35, p25 en el hipocampo El nivel de expresin de Cdk5 no fue modificada por alguno de los tres estrs en ningn compartimientos celular (fig. 2). El nivel de la protena p35, un activador de Cdk5, fue notablemente elevada por el estrs crnico en el citoplasma, mientras que su nivel nuclear se increment en el estrs agudo y crnico. Adems de eso, la protena p25, que es una forma ms activa de activador Cdk5, se increment slo un poco en el estrs crnico en ambos compartimentos celulares (fig. 2). La actividad de JNK2 / 3 es aumentada por el estrs agudo y disminuida por el estrs crnico y combinado, en tanto que JNK1 se inhibe en todas las condiciones de estrs en el hipocampo. En la siguiente serie de experimentos, se analizaron los niveles y la actividad de la JNK1 detectado como protena 46 kDa (tJNK1) y JNK 2 y 3 detectado como 54 kDa(tJNK2 y 3, fig. 3C). Estos experimentos mostraron que los niveles de las tres protenas JNK en ambos compartimentos celulares estuvieron principalmente sin cambios (Fig. 3C). El nivel de fosforilacin de la isoforma JNK1 en el citoplasma del hipocampo se redujo significativamente en los tres tipos de estrs en comparacin con el control (Fig. 3 A y C), mientras que el nivel nuclear de fosforilacin de la isoforma JNK1 en el hipocampo se mantuvo inalterada por cualquiera de los estrs (Fig. 3B y C). El nivel de fosforilacin de JNK2 /3 fue significativamente elevado en el citoplasma del hipocampo por el estrs agudo (Fig. 3A-C), mientras que se redujo significativamente, ya sea por el estrs crnico o el combinado. El nivel nuclear de fosforilacin de la isoforma JNK2 / 3 se redujo por el estrs crnico (Fig. 3B y C). La proporcin de pJNK1 a tJNK1 (pJNK1/tJNK1) indic que la actividad de JNK1 citoplasmtica fue baja en todos los tipos de estrs (Fig. 3C). Por el contrario, la proporcin citoplasmtica pJNK2/3/tJNK2/3 aumento notablemente en el estrs agudo, mientras que fue baja en otros dos tipos de estrs y en el ncleo, esta relacin se redujo en el estrs crnico (Fig. 3C).

Cambios en la expresin de los genes del receptor de glucocorticoides, hormona liberadora de corticotropina y el factor neurotrpico derivado del cerebro en el hipocampo El papel de la fosforilacin del receptor de glucocorticoides en la regulacin de la expresin gnica se prob en los genes del receptor de glucocorticoides regulados especficamente, el receptor de glucocorticoides (Hermann & Spencer, 1998), el CRH (Lu yCidlowski 2006), y el factor neurotrpico derivado del cerebro (Tapia-Arancibia et al . 2004). Los genes elegidos son conocidos por estar involucrados en la regulacin de varias actividades del SNC relacionadas con el estrs. El receptor de glucocorticoides regula la actividad del eje HPA, mientras que la hormona liberadora de corticotropina y el factor neurotrpico derivado del cerebro participan en la modulacin de aprendizaje, procesamiento de la memoria, y la plasticidad sinptica del hipocampo y la corteza prefrontal (Givalois et al. 2000, Marmigere et al. 2003). Como se muestra en la figura. 4 (carril 1), la expresin del gen del receptor de glucococrticoides se redujo significativamente por los tres tipos de estrs con un cambio dominante bajo el estrs crnico. La expresin del gen del factor neurotrpico derivado del cerebro fue significativamente inhibida en el estrs crnico, mientras que bajo el estrs agudo y combinado que no afectan su expresin con respecto al control. Por el contrario, la expresin de hormona liberadora de corticotropina se increment significativamente en los tres tipos de estrs. El estrs crnico influye en la localizacin subcelular del receptor de glucocorticoides en la corteza prefrontal de forma opuesta al estrs agudo y combinado Un bajo nivel citoplasmtico y concominantemente un alto nivel nuclear tGR en la corteza prefrontal fue observado en el estrs agudo (es decir, de alta corticosterona srica) (Fig. 5 A, grupo B tercer panel, y C). Bajo el estrs crnico, el nivel de la protena tGR aument en los dos compartimentos, mientras que en el estrs combinado este aumento slo se detect en el ncleo (Fig. 5A-C). El anlisis estadstico revel en un importante grupo de trabajo las diferencias entre compartimientos en el nivel de la protena tGR, en el estrs agudo o combinado en un lado y el estrs crnico por el otro (Fig. 5C). La fosforilacin del receptor de glucocorticoides de la corteza prefrontal en S232 es dominante en el estrs crnico El nivel de fosforilacin del receptor citoplasmtico de glucocorticoides S232 se increment en estrs crnico y combinados (Fig. 5A). El nivel de fosforilacin del receptor nuclear de glucocorticoides S232 se increment en los animales con estrs crnico y disminuy significativamente en el estrs combinado (Fig. 5B). La fosforilacin del receptor de glucocorticoides en S246 se increment notablemente en el citoplasma en el estrs crnico y en su mayora se mantuvo sin cambios por otros tratamientos (Fig. 5A, el primer panel B, y C). La relacin de fosforilacin de los receptores de glucocorticoides 232/246 se elev en el citoplasma en el estrs agudo y combinado, mientras que en el ncleo, esta proporcin se elev en el estrs crnico y la disminuy en el estrs combinado. Cambios en la expresin delas protenas Cdk5, p35, p25 en la corteza prefrontal Los niveles citoplasmticos de las protenas Cdk5 y p35 aumentaron significativamente slo por el estrs crnico, mientras que sus niveles nucleares se incrementaron slo por el estrs combinado (Fig. 6). El nivel citoplasmtico de p25 se increment tanto en estrs crnico y combinado, mientras que su nivel nuclear se increment slo por el estrs crnico (Fig. 6). Nuestros resultados indican que la actividad de Cdk5 podra aumentar en los ambos compartimentos celulares bajo el estrs crnico y el combinado. La fosforilacin de JNK1 y JNK2/3 en el compartimiento citoplasmtico y nuclear de la corteza prefrontal se redujo en el estrs crnico Los niveles totales de protenas JNK1 y JNK2 /3 estaban en su mayora sin alteraciones en cualquier tipo de estrs en ambos compartimientos (Fig. 7C). Tanto los niveles citoplasmticos como nucleares de pJNK1 y pJNK2/3 fueron disminuidas en el estrs crnico y sin alteraciones en el estrs combinado (Fig. 7C). Claramente el mayor nivel de protena citoplasmtica pJNK2 /3 se observ slo en el caso de estrs agudo (Fig. 7A y C). El promedio pJNK/tJNK indic que la actividad de ambas JNK1 y JNK2 /3 se redujo en el estrs crnico en ambos compartimientos (Fig. 7C), mientras que en el estrs agudo se observ aumento del promedio

citoplasmtico de pJNK2/3/tJNK2/3, lo que sugiere que JNK2/3, pero no JNK1se activa en el estrs agudo.

Cambios en la expresin de los genes receptores de glucocorticoides, hormona liberadora de corticotropina, y del factor neurotrpico derivado del cerebro en la corteza prefrontal La expresin del gen de los receptores de glucocorticoides en la corteza prefrontal disminuy bajo el estrs crnico. Por el contrario, los genes de hormona liberadora de corticotropina y factor neurotropico derivado del cerebro aumentaron en las mismas condiciones de estrs (Fig. 8A y B carriles 2 y 3). En respuesta al estrs agudo y combinado, la expresin de los tres genes no mostr cambios significativos, con la excepcin de factor neurotrpico derivado del cerebro que disminuyeron en el estrs combinado.

Discusin Se ha postulado que la respuesta desadaptativa de la SNC para el estrs neuroendocrino puede salir de su terminacin comprometida, que es por lo menos en parte sobre la base de el GR deterioro de retroalimentacin negativa en la parte superior de la SNC. Estas alteraciones se observaron en condiciones de el estrs crnico (Chrousos y Kino 2007). En el presente, en vivo estudio, que explota el modelo de rata Wistar para investigar crnica depende de estrs alteraciones GR en Hipona y PFC, las dos estructuras del SNC conocidos a participar en el eje HPA regulacin homeosttica. Se analizaron los recursos genticos de estrs depende redistribucin y su actividad transcripcional despus de la crnica 21 das de aislamiento social que representa potencialmente desadaptativos estrs. En los animales sometidos a este tipo de estrs, se encontr una disminucin del nivel de CORT en el suero de la sangre en comparacin con los animales de control. Este hallazgo est de acuerdo con la datos de otros autores que muestran HPA hipoactividad eje en Ratas Wistar en condiciones similares (Snchez et al. 1998, Malkesman et al. 2006). En el grupo de animales expuestos a aguda de 30 minutos de inmovilizacin (Garca et al. 2000), aplicado por s sola o despus de que el estrs crnico, nos encontramos con una significativamente mayor nivel de CORT suero. El prominente aumento de CORT despus de la inmovilizacin aguda era de esperar, ya que este tipo de estrs es de alta intensidad (Garca et al. 2000). As, los animales con experiencia previa estrs crnico no presentan peligro la capacidad de respuesta del eje HPA a la estrs agudo posterior como lleg a la conclusin de lo observado niveles de la hormona. El anlisis de los niveles de protena TGR en Hipona se indica que, de conformidad con la conocida 'dogma' de la mecanismo molecular de accin GR (Nishi y Kawata 2006), esta protena se transloca del citoplasma a la compartimiento nuclear cuando los niveles de CORT fueron elevados, es decir, bajo estrs agudo o en combinacin. De acuerdo con eso, bajo el estrs crnico, cuando los niveles de CORT eran bajos, TGR los niveles en el citoplasma y el ncleo de Hipona siendo indistinguible de la de control. Por lo tanto, nuestros resultados sugiere que el estrs crnico no comprometer la capacidad de los recursos genticos a someterse a la translocacin nuclear sobre la posterior estrs agudo, es decir, cuando el nivel de hormona es mayor. Sin embargo, en el marco del estrs crnico, a pesar de perfeccionar nivel de la central nuclear de TGR, esta protena mostraron significativas actividad transcripcional sobre la expresin de su propia gen, as como la expresin de la IRC y BDNF genes, que son dos objetivos de otros recursos genticos conocidos (Tapia-Arancibia et al. 2004, Lu y Cidlowski 2006). Este la actividad nuclear TGR en el estrs crnico es comparable con el observado en el estrs agudo, es decir, cuando CORT

los niveles eran altos y crecientes niveles de los recursos genticos se encuentran en el ncleo. Es decir, en tanto aguda como crnica destaca, regulacin a la baja similar de genes los recursos genticos y la regulacin positiva de gen CRH se detectaron. Por otra parte, mientras que el BDNF se alterada por estrs agudo, se downregulated en crnica estrs. Estos hallazgos sugieren que la transcripcin