Cultura de clulas animais

A cultura de clulas o conjunto de tcnicas que permitem cultivar ou manter clulas isoladas fora do organismo natural onde existem, mantendo suas caractersticas prprias. Os meios de cultura necessrios para a propagao de clulas animais so muito mais complexos que o meio empregado para o crescimento de bactrias e leveduras. O crescimento de uma colnia visvel de clulas animais a partir de uma nica clula demora uma semana ou mais, ao passo que colnias de E. coli ou leveduras demoram uma noite para crescerem a partir de uma nica clula. Em 1955, Harry Eagle realizou uma anlise sistemtica dos nutrientes necessrios ao crescimento de clulas animais em cultura. Alm de sais e glicose, os meios usados para cultivo de clulas animais contm vrios aminocidos e vitaminas, que as clulas no podem sintetizar. O meio de crescimento para a maioria das clulas animais em cultura tambm inclui soro, que serve como fonte de fatores de crescimento necessrios para estimular a diviso celular. Atualmente, este meio estabelecido por Eagle ainda usado para a cultura de clulas animais. Os nutrientes presentes em um meio de cultura so: - Glicose: carboidrato primrio metabolizado pela via da gliclise - Glutamina: uma das principais fontes de energia - Aminocidos: devem ser adicionados os aminocidos necessrios para o crescimento celular, pois no so sintetizados por mamferos in vivo. - Sais: para manter o balano osmtico e isotonicidade - Elementos figurados: como Mn, Cu, Fe, Zn, Ca, Mg, Mo, Va, Se, Si e Ni, importantes a atividade de algumas enzimas essenciais para a sobrevivncia da clula - Vitaminas: vitaminas e componentes hormonais esto presentes em baixas concentraes e utilizados como cofatores - Fatores do crescimento: fator de crescimento epitelial, do fibroblasto, etc..

As clulas em cultura retm as propriedades associadas sua origem. Por exemplo, clulas do musculo esqueltico contraem espontaneamente na placa de cultura e clulas epiteliais formam extensas lminas com muitas das propriedades de um epitlio intacto.

Dadas as condies apropriadas a maior parte das clulas animais e vegetais podero viver, multiplicar-se e at mesmo expressar propriedades diferenciadas numa placa de cultura de tecidos. As clulas podem ser observadas num microscpio ou analisadas bioquimicamente e os efeitos da adio ou remoo de molculas especficas, tais como hormnios ou fatores do crescimento, podem ser explorados. As primeiras culturas celulares estabelecidas a partir de um tecido so chamadas de culturas primrias. As clulas em uma cultura primria geralmente crescem at cobrirem a superfcie da placa de cultura. Ento, elas devem ser removidas da placa e colocadas em uma nova placa com menor concentrao de clulas para formar uma cultura secundria. Este processo pode ser repetido muitas vezes, mas a maioria das clulas normais no pode ser crescida em cultura indefinidamente. Por exemplo, fibroblastos humanos normais geralmente podem ser cultivados por 50 a 100 duplicaes da populao, aps o que eles param de crescer e morrem. Tem sido sugerido que este limite de tempo de vida est relacionado com o limite de tempo de vida do animal do qual a clula se derivou. Entretanto, ocasionalmente, algumas clulas em cultura sofrero uma mudana gentica que as tornam efetivamente imortais. Tais clulas se proliferaro indefinidamente e podero ser propagadas como uma linhagem de clulas. Apesar das desvantagens associadas a este sistema de expresso, como elevado custo e instabilidade, as clulas animais so muitas vezes empregadas na obteno de biofrmacos por serem capazes de realizar as modificaes ps-traducionais complexas exigidas por algumas protenas, como glicosilao, -carboxilao e -hidroxilao. A glicosilao a mais crtica das modificaes ps-traduo, j que est associada a diversas propriedades importantes das protenas, tais como atividade biolgica, solubilidade, antigenicidade, imunogenicidade, resistncia inativao e ao de proteases. Alm deste aspecto, o fato de que as clulas de mamferos geneticamente modificadas geralmente excretam no meio as protenas heterlogas produzidas, facilita e reduz os custos de purificao dos biofrmacos produzidos. As clulas animais mais empregadas como sistema de expresso so as clulas do ovrio de hamster chins (CHO), por apresentarem um padro de glicosilao adequado e baixa susceptibilidade a vrus que afetam humanos. As clulas de rim de beb de hamster (BHK) tambm tm sido empregadas na produo de biofrmacos por apresentarem desempenho equivalente.

As clulas CHO so clulas epiteliais que podem ser adaptadas para o crescimento em suspenso e o principal tipo de clula empregado na produo de protenas recombinantes. O interferon 1a produzido pela Biogen e utilizado no tratamento de esclerose mltipla expresso em clulas CHO. As clulas BHK so fibroblastos aderentes que tambm podem ser adaptadas para crescimento em suspenso, e so usualmente empregadas para propagao de vrus para a produo de vacinas veterinrias. O fator de coagulao VIII produzido pela Bayer e utilizado no tratamento da hemofilia expresso em clulas BHK.

Somente em 1987 o FDA aprovou para comercializao a primeira protena teraputica produzida por clulas animais recombinantes: o ativador tecidual de plasminognio humano (t-PA). Desde ento, inmeros outros biofrmacos chegaram ao mercado, tais como a eritropoetina (EPO), que estimula a produo de glbulos vermelhos e empregada no tratamento de anemia e como co-adjuvante em casos de cncer e AIDS; os fatores sangneos VIII e IX, empregados no tratamento da hemofilia; os fatores estimulantes de colnias (G-CSF e GM-CSF), que estimulam a produo de glbulos brancos, fortalecendo o sistema imune de pacientes com neutropenia, cncer e AIDS; e anticorpos monoclonais, usados tanto para diagnstico (in vitro e in vivo) quanto para fins teraputicos, em especial no tratamento de diversos tipos de cncer. A cultura de clulas animais exige, alm de meios complexos e caros, cuidado extremo com a produo. As culturas de clulas so muito vulnerveis a contaminao:

as clulas se dividem lentamente, enquanto microorganismos crescem rapidamente 1050 vezes mais rpido e so mais resistentes a variaes em pH, temperatura e disponibilidade de nutrientes. Fatores como a diluio do meio de cultura, descongelamento de nitrognio lquido durante a armazenagem e utilizao de enzimas para a obteno de culturas primrias podem aumentar o risco de contaminao. Alm disso, durante todo o processo, a demanda de oxignio para a manuteno da cultura alta e as clulas so frgeis e sensveis ao cisalhamento. Os equipamentos necessrios para a cultura de clulas animais so: - Cmara de fluxo laminar: permite a remoo de partculas do ar, evitando a contaminao cruzada. - Incubadora: Mantm a temperatura a 37C e 5% de CO2 mantm o pH do meio.

Algumas clulas, como os linfcitos, podem crescer livremente em soluo, enquanto outras s crescem se aderidas a um suporte. Quando os sistemas de produo empregam biorreatores, este problema pode ser resolvido atravs do confinamento das clulas dentro de membranas semipermeveis, imobilizao em gis ou cpsulas ou fixao sobre diferentes suportes. O emprego de biorreatores permite a cultura de clulas em larga escala, com o controle do pH e da temperatura do meio, abastecimento de oxignio e remoo de CO2 e manuteno das condies asspticas, evitando a contaminao por microorganismos, vrus, etc. O grande desafio na operao de birreatores manter as condies ideais homogneas para toda a populao de clulas. Os biorreatores podem ser classificados quanto a homogeneidade do sistema em homogneos ou heterogneos. Nos biorreatores homogneos as clulas esto suspensas uniformemente no meio de cultura, e neste tipo de biorreator possvel monitorar e controlar de maneira mais confivel as condies fsico-qumicas s quais as clulas so submetidas. Nos biorreatores heterogneos as clulas permanecem imobilizadas ou retidas em um compartimento, e foram desenvolvidos para o cultivo de clulas que precisam estar aderidas a uma superfcie para sua proliferao. Neste sistema impossvel obter amostras homogneas. Os diferentes modos de operao empregados na fermentao microbial podem tambm ser empregados em biorreatores de cultura de clulas, sendo eles: batelada, batelada alimentada, contnuo simples e perfuso.

Batelada um modo de operao descontnuo, o crescimento de celular ocorre sem o abastecimento de nutrientes suplementares aps a inoculao das clulas. Enquanto o substrato metabolizado, a clula cresce, formando o produto e metablitos. Este modo de operao apesar de ser simples e frequentemente empregado, fornece uma baixa produtividade por volume. No modo de operao em batelada alimentada, mais nutrientes so adicionados durante o crescimento celular para repor aqueles consumidos pela clula. Assim, deve comear com um volume de operao menor que o limite. O aumento na disponibilidade de nutrientes resulta numa maior concentrao final de clulas e produto, otimizando a produtividade. A limitao deste modo de operao se baseia no acmulo de metablitos txicos no meio, que pode inibir o crescimento celular. No modo de operao continuo simples, nutrientes frescos so continuamente adicionados ao meio com a concomitante remoo da suspenso de clulas, em uma mesma vazo. Algumas vezes, a velocidade de remoo das clulas maior ou igual a velocidade de crescimento das clulas, o que resulta em uma diluio do meio e diminuio da produtividade, o que torna este modo de operao no muito atrativo. O modo de operao perfuso apresenta a maior produtividade e complexidade operacional. Este modo de operao corrige o maior problema apresentado pelo modo de operao continuo simples, que a baixa produtividade devido a remoo de clulas. Em perfuso, a perda das clulas evitada pelo emprego de um dispositivo de reteno celular. O desenvolvimento deste sistema mais sofisticado, envolvendo um custo maior em sua instalao, e possui um maior risco de contaminao por ser um sistema aberto.