Cristian Schweitzer de Oliveira

Caracterizao por Microscopia de Fora Atmica de

Camadas Lipdicas Imobilizadas em Superfcies






















Florianpolis
Agosto de 2007
Universidade Federal de Santa Catarina
Curso de Ps-Graduao em Fsica
Centro de Cincias Fsicas e Matemticas
Departamento de Fsica












Caracterizao por Microscopia de Fora Atmica de
Camadas Lipdicas Imobilizadas em Superfcies





Cristian Schweitzer de Oliveira
Mestrando

Andr Avelino Pasa
Orientador





Dissertao apresentada ao Curso de Ps-
Graduao em Fsica da Universidade
Federal de Santa Catarina, como parte dos
requisitos para obteno do ttulo de
Mestre em Fsica.







Florianpolis
Agosto de 2007



























Prefiro ser esta
metamorfose ambulante do
que ter aquela velha opinio
formada sobre tudo.

(Raul Seixas)
(Raulzito!)

ndice

AGRADECIMENTO
RESUMO
ABSTRACT
1 . Objetivos
1.1. Objetivos Gerais
1.2. Objetivos Especficos
1
2. Introduo e Reviso Bibliogrfica
2.1.Membranas Celulares: Funes, Propriedades, Composio e Estados
Fsicos
2
2.2. Modelos de Membranas Biolgicas 8
2.2.1. Tcnicas de Preparao de Membranas Imobilizadas 12
2.2.2. Tcnicas e Caracterizao para Membranas Imobilizadas 13
2.3 Microscpio de Fora Atmica 14
3 . Procedimentos e Tcnicas Experimentais
3.1. Preparao dos Substratos
3.1.1. Mica
3.1.2. Silcio
21
3.2. Reagentes, Solventes e Fosfolipdio Utilizado 22
3.3. Preparao dos Filmes Lipdicos
3.3.1. Formao de Filmes por Espalhamento de Vesculas
Lipdicas (Lipossomas) Fuso de Vesculas
3.3.1.1. Preparao das Vesculas ou Lipossomas
23
3.3.1.2. Deposio das Vesculas sobre os Substratos 24
3.3.2. Formao de Filmes por Espalhamento de Soluo
Orgnica Casting
3.3.3. Formao de Filmes Lipdicos por Spin-Coating
25
3.4. Caracterizao por AFM 27
3.4.1. Clula Lquida do AFM 28
3.4.2. Mtodo de Hidratao das Amostras 29
3.4.3. Controle para Atmosfera de Trabalho 30
4 . Apresentao e Discusso dos Resultados
4.1. Anlise dos Substratos Utilizados
31
4.2. Anlise dos Filmes Lipdicos Formados por Fuso de Vesculas 34
4.3. Anlise dos Filmes Lipdicos Formados por Spin-Coating 36
4.3.1. Transio de Fase do DMPC 39
4.4. Anlise dos Filmes Lipdicos Formados por Simples Espalhamento
de Soluo Orgnica Casting
4.4.1. Mica
42
4.4.2. Silcio Hidroflico (SiO
2
)
4.4.2.1. Solues Lipdicas em Isopropanol
45
4.4.2.2. Solues Lipdicas em Clorofrmio
4.4.2.2.1. 20l de Soluo Gotejada
49
4.4.2.2.2. 100l de Soluo Gotejada 51
4.4.3. Silcio Hidrofbico (Si-H)
4.4.3.1. 20l de Soluo Gotejada
53
4.4.3.2. 100l de Soluo Gotejada 57
4.5. Discusso Geral 59
5 . Concluso 61
6 . Perspectivas 63
7 . Referncias Bibliogrficas 64













AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de agradecer pessoa sem a qual este trabalho talvez no
chegasse ao fim. Por acreditar em mim, por me apoiar, por ajudar sempre que
necessrio, por oferecer consolo nos piores momentos, por me ouvir, por me amar,
agradeo a minha noiva Liziane por estar ao meu lado. Te amo!

meu pai e minha me pela educao recebida e por toda ajuda que puderam oferecer
durante no s a realizao deste trabalho como ao longo de minha vida.

minha irm Caroline pelo apoio dado no incio deste trabalho, por me ouvir e
aconselhar nos momentos de necessidade. Obrigado Carol!

minha irm Catisca por seu exemplo enquanto me e profissional, alm de sempre
estar disposta e preocupada em me ajudar.

toda minha famlia especialmente aos avs Amilton, Hildegard e Walmorina pelos
conselhos, apoio, carinho e etc. Agradeo especialmente ao v Vilon por seu exemplo e
ensinamentos eternamente vivos na minha memria.

tia Zaira por ajudar no s a mim como tambm a minha famlia num momento
crtico deste trabalho.

minha amiga Margareth (Mag) que considero como uma irm, por apoiar e ajudar a
mim e minha famlia com toda sua pacincia e apoio. Obrigado Mag!

meu orientador Prof. Andr Avelino Pasa, pela oportunidade de realizar este trabalho,
pelos ensinamentos, pacincia, conselhos, parceria, por ter confiado em mim, ......
Obrigado chefe!

Profa. Tnia Beatriz Creczynski Pasa pela orientao, pelos conselhos, por elogiar
minhas imagens de AFM.......Obrigado!

Ao agora Prof. Maximiliano Luiz Munford, da Universidade Federal de Viosa pelos
ensinamentos sobre a microscopia de fora atmica e tudo mais sobre deposio e
caracterizao de lipdios.

Aos colegas de laboratrio Vincius e Ricardo por me ajudarem sempre que
requisitados. Sem a ajuda de vocs as coisas teriam sido muito mais complicadas, valeu!

colega de pesquisa Vnia por estar sempre disposta a me ajudar e tirar minhas
dvidas.

Aos amigos Dorico, Ren e Rose, Rafael e Louise, Zanchinho, Pio, pelos bons
momentos em torno de uma mesa de bar (alm da ajuda na hora da cantoria).

Aos colegas de laboratrio e amigos Vagner, Clodoaldo, Joaquim, Marlia, Joozinho e
Alexandre, pelos momentos de descontrao na hora do trabalho.

um amigo mais que especial que sempre agradecerei por ter me ajudado, no s
profissionalmente, como tambm pessoalmente. Obrigado Lenidas!

Aos amigos Rnei, Liliane, Amauri e Jader pela mais que parceria.

s eternas amigas Menegon e Michele, nunca esquecerei de todo apoio que me deram
em um dos momentos mais complicados da minha vida.

Aos colegas de estudo Estevan, George e Antnio, pela ajudada extremamente
importante no incio do mestrado.

Patricia, Nortenha, Bohemia, Brahma Extra, Kaiser Gold, Original........ por tornarem
meus momentos de lazer mais prazerosos.




todos que de uma forma ou outra contriburam para a realizao deste trabalho.
Amigos de infncia, amigos de curso, amigos de repblica, professores, amigos de
trabalho, aos amigos distantes, at mesmo aqueles que torceram e fizeram para que este
sonho no se realizasse, pois, deram-me ainda mais motivos para a complementao
desta obra.

CAPES pelo auxlio financeiro.



























RESUMO

Neste trabalho foram preparados filmes lipdicos de DMPC (1,2-dimiristil-
fosfatidilcolina) em substratos de mica, silcio hidrofbico e silcio hidroflico, com a
finalidade de sintetizar estruturas que mimetizem membranas biolgicas. As tcnicas
empregadas na preparao dos filmes foram fuso de vesculas lipdicas, espalhamento
de soluo orgnica por centrifugao (spin-coating), e automontagem por
evaporao de solvente (casting), sendo que somente a ltima foi realizada nos trs
tipos de substratos. Os solventes utilizados para dissolver os lipdios foram isopropanol
e clorofrmio. A caracterizao estrutural e morfolgica dos filmes foi realizada por
anlise topogrfica de imagens obtidas por microscopia de fora atmica (AFM). As
amostras com e sem hidratao por vapor de gua foram investigadas em ambiente
controlado por fluxo constante de gs nitrognio (ex-situ). Tambm foram realizadas
imagens com hidratao total dos filmes por completa imerso das amostras em soluo
fisiolgica (in-situ). Superfcies com degraus da ordem de 5 nm, caractersticos de
bicamadas lipdicas, foram observadas principalmente em substratos hidroflicos, com a
formao ou no de estruturas multilamelares.

















ABSTRACT

In this work it has been prepared lipid films of DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-
glycero-3-phosphocholine) were prepared on mica, hydrophobic silicon, and
hydrophilic silicon substrates, with the purpose of fabricating structures that mimic the
biological membranes. The techniques used for the preparation of the lipid layers were
vesicle fusion, spin-coating and casting. The solvents used for the dissolution of the
lipids were isopropanol and chloroform. The morphologic characterization of the
deposits was performed by acquiring atomic force microscopy (AFM) images of the
surfaces. The images of samples with and without hydration in water vapor were taken
in a chamber with controlled atmosphere and constant flux of nitrogen gas. This
measuring condition is named ex-situ. In-situ experiments were also carried out by
imaging the lipid films immersed in a physiologic solution. As a general result, surfaces
with step heights of 5 nm, typical of lipid bilayers, were observed on samples prepared
on hydrophilic substrates, being observed also the formation of multilayer structures.























1
1 OBJETIVOS

1.1 Objetivos gerais

Este trabalho tem como objetivo a caracterizao de camadas lipdicas
imobilizadas em substratos, utilizadas como modelo de membranas biolgicas, atravs
do uso da microscopia de fora atmica em atmosfera controlada e em soluo aquosa.
Os experimentos realizados visam elucidar os aspectos importantes da morfologia das
camadas lipdicas sustentadas, em funo da tcnica de preparao das estruturas.

1.2 Objetivos especficos

Preparar camadas lipdicas em substratos de mica e de silcio,
Preparar camadas lipdicas pelas tcnicas de automontagem por evaporao do
solvente, por centrifugao, e por fuso de vesculas,
Testar diferentes concentraes de lipdios e os solventes isopropanol e clorofrmio
para solubilizar os lipdios,
Determinar a topografia das camadas lipdicas por microscopia de fora atmica,
Analisar o comportamento da estrutura das camadas lipdicas quando submetidas a
hidratao por vapor de gua ou imerso em meio lquido.














2
2 INTRODUO E REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 - MEMBRANAS CELULARES: FUNES, PROPRIEDADES,
COMPOSIO E ESTADO FSICO

A membrana plasmtica de organismos vivos incluindo as clulas eucariticas
vegetais e animais, tem como papel fundamental a individualizao de cada unidade
celular. responsvel tambm pelo controle rigoroso do transporte de substncias entre
os meios intra e extracelulares, sendo permevel as substncias lipossolveis e
impermevel aos ons e molculas polares, alm de sustentar protenas, que atuam na
reteno e transporte de substncias
1,2-6
.
A composio das membranas determinante para o cumprimento de suas
funes. A sua estrutura resistente, porm flexvel
7
, o que permite crescimento,
locomoo e fuso celular
1,8,9
. Alm disso, a membrana tem a capacidade de englobar
substncias para absorv-las ou expuls-las, em processos denominados de endocitose e
exocitose, respectivamente, e apresenta uma importante propriedade que a de auto-
regenerao
1,4-6
.
Conforme pode ser observado na Figura 1, as membranas biolgicas so
compostas de diferentes estruturas proticas, inseridas integral ou perifericamente em
uma bicamada lipdica. Existem cerca de 510
6
molculas de lipdio em uma rea de 1
m
2
de bicamada
1,3
.


Figura1: Ilustrao de uma membrana celular
1
.

3
O comportamento dos lipdios em relao gua determinante para a formao
da estrutura da bicamada lipdica da membrana celular, cuja espessura varia de 5nm a
8nm
1,3
. Na Figura 2 representado o comportamento diferenciado dos lipdios
dependendo da regio de sua estrutura que est em contato com gua.

Monocamada
Bicamada
Interface gua/gua
Interface ar/gua

Figura 2: Ilustrao da montagem molecular dos lipdios em interface ar/gua e
gua/gua.

Observam-se as interaes hidroflica e hidrofbica, entre a parte polar do
lipdio (cabea) e apolar do lipdio (calda), com a gua, respectivamente. Outra
caracterstica importante que os lipdios so insolveis em gua e solveis em
solventes orgnicos, como etanol, isopropanol, ter, clorofrmio e benzeno
5,6
.
Os lipdios tm a natureza de steres, pois so formados pela combinao de
cidos graxos com lcoois. cidos graxos so cidos orgnicos (cidos carboxlicos)
que possuem longas cadeias de carbono, variando entre 4 e 36 tomos de carbonos.
Alguns cidos graxos so saturados, outros insaturados, como demonstrado na Figura
3. Estes ltimos contm uma ou mais ligaes duplas em sua cadeia hidrocarbonada, o
que lhes permite adicionar tomos de hidrognio na molcula
1
.



Figura 3: Ilustrao da estrutura da molcula do (A) cido esterico (estearato) e do (B) cido
olico (oleato)
1
.

A B
4
Existem trs tipos de lipdios em uma membrana celular: glicerofosfolipdios,
compostos por dois cidos graxos ligados a gliceris, esfingolipdios, que so
compostos por um cido graxo ligado e um grupo amina ligado a esfingosina; e esteris,
caracterizados por uma cadeia fechada de quatro hidrocarbonetos. Nas Figuras 4 e 5
apresentada a classificao dos lipdios e a estrutura molecular do colesterol. A parte
hidroflica destes lipdios pode ser simplesmente um grupo hidroxila (-OH) ligado a um
sistema esterol, ou algo mais complexo. Glicerofosfolipdios e esfingolipdios contm
lcoois carregados ou grupos fosfatos na extremidade de sua parte polar
1,2
.


Figura 4: Classificao dos lipdios
1
.


Figura 5: Colesterol lipdio esterol encontrado na membrana
lipdica de todos tecidos do corpo humano
1
.

De todos os lipdios descritos, os fosfolipdios constituem a principal classe de
lipdios na membrana, porque so os mais abundantes
10
. Os fosfolipdios, cuja
5
composio apresentada na Figura 6, so pequenas molculas lipdicas, compostas de
cido graxo, glicerol e um grupo fosfato ligado a um lcool
2,11
.


Figura 6: Representao geral de uma molcula de fosfolipdeo R1 e R2
variam de acordo com o cido graxo presente na molcula, X pode ser
diferentes lcoois (colina, glicerol, etalonamina, inositol ou serina), ligados ao
grupo fosfato.

Os fosfolipdios so nomeados de acordo com o lcool presente em sua
estrutura. A fosfatidilcolina o lipdio mais comum na membrana celular, assim
denominado por conter a colina protonada ligada a um derivado fosfrico do glicerol.
Se estiver ligada a etalonamina protonada, ento o fosfolipdio chamar
fosfatidiletanolamina e assim segue para os outros lcoois. Na Figura 7 apresentada
estrutura qumica dos fosfolipdios citados.


Figura 7: Estrutura qumica dos fosfolipdios fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina. As regies em
destaque na figura apresentam o que diferencia os lcoois presentes na composio dos fosfolipdios.

Embora a bicamada lipdica seja estvel, os lipdios e molculas esteris tm
liberdade para moverem-se pela membrana. O movimento dos lipdios pode ser dividido
em duas categorias: conformacional e translacional. A conformacional descreve os
movimentos intra-moleculares como rotao ao longo do eixo, vibrao metilnia
simtrica/assimtrica (stretching) e isomerizao trans-gauche, enquanto a
translacional envolve a difuso passiva trans-bicamada (flip-flop), difuso lateral no
6
plano e transio de fase principal. No esquema da Figura 8 so apresentdas algumas
dinmicas lipdicas.





Figura 8: Algumas dinmicas lipdicas. (A) Difuso lateral no plano e difuso passiva trans-bicamada.
(B) Rotao ao longo do eixo. (C) Vibrao stretch simtrica. (D) Vibrao stretch assimtrica.

O grau de fluidez da membrana depende da composio do lipdio e da
temperatura. Em baixas temperaturas, a movimentao dos lipdios diminui e a
membrana torna-se quase cristalina. Acima de determinada temperatura caracterstica,
associada ao tipo de membrana, a movimentao dos lipdios torna-se muito maior
1
.
Os lipdios apresentam transio de fase
10,12
. A temperatura de transio
do estado gel ou paracristalino (L

) para o estado lquido cristalino ou fludico (L

)
depende da composio dos lipdios. Lipdios com maior concentrao de cidos
graxos saturados apresentam montagem molecular altamente ordenada,
aproximadamente cristalina, estabilizada por interaes hidrofbicas. Porm, a mistura
com cidos graxos insaturados com ligaes duplas cis entre tomos de carbono, que
no permitem a rotao entre os tomos da ligao e introduzem uma curvatura rgida
na cadeia de hidrocarbonetos (conforme observado na Figura 3) interfere na ordem da
A B
C
D
7
bicamada e na temperatura de transio de fase. Estudos revelam que lipdios com
grande concentrao de cidos graxos insaturados apresentam transio de fase numa
faixa menor que 0C. Nas Figuras 9 e 10 apresentam-se modelos da estrutura lipdica
com diferentes cidos graxos e da bicamada lipdica em fases diferentes.


Figura 9: Representao da mistura de cidos graxos saturados e insaturados
1
.


Figura 10: esquerda, bicamada lipdica no estado slido ou paracristalino (gel); direita, bicamada
lipdica no estado fludico (lquido)
1
.













8
2.2 -MODELOS DE MEMBRANAS BIOLGICAS

A membrana celular desempenha papel fundamental em vrias funes
celulares, tais como contatos intercelulares, organizao, comunicao e transporte de
substncias
13,14
. Sendo a bicamada lipdica a estrutura bsica das membranas biolgicas,
o conhecimento da sua estrutura e propriedades de grande importncia para a
compreenso destas funes
2
. Porm, a complexidade das membranas biolgicas e suas
interaes com os meios intra e extracelulares, dificultam a realizao de uma direta
investigao
15,16
. Atualmente e nas ltimas duas dcadas vrios estudos vm
investigando formas de biomimetizar a natureza das membranas biolgicas, atravs da
utilizao de modelos
2,16-18
. Lipossomas
8,19,20
e membranas suportadas
18,21,22
so os
modelos mais comumente usados
23,24
.
Como neste trabalho ser usado o modelo de membranas suportadas, uma breve
descrio do modelo de lipossomas ser realizada e a seguir um detalhamento do
modelo de interesse.
Na Figura 11 so apresentados lipossomas e sua classificados por tamanho. Os
lipossomas so vesculas esfricas que se formam espontaneamente quando certos
fosfolipdios so dispersos em gua
25
.


Figura 11: Classificao dos lipossomas de acordo com seu tamanho
26,27
.
9
A utilizao de lipossomas como modelo de membranas, apresenta algumas
vantagens como a facilidade de produo e a obteno em grandes quantidades
2,5
Uma
relevante aplicao dos lipossomas o transporte de drogas confinadas em seu interior,
possibilitando o direcionamento na liberao de frmacos
28
, como por exemplo, em
tecido com tumor
29
. Porm, apresentam-se bastante instveis sob armazenamento
19
,
possuem limitado espao aquoso para a insero de substncias, no possibilitam o
acesso em ambos os lados da membrana com eletrodos
2
, entre outras desvantagens.
Os modelos de membranas suportadas, que consistem basicamente em
fosfolipdios estruturados desde mono
30
at multicamadas
31
, adsorvidas em substratos
hidroflicos (como mica
32,33
, silcio oxidado
34,35
, vidro
34
e ouro
35
) e hidrofbicos , como
silcio aps remoo do xido nativo
36
. So freqentemente usados para o estudo da
estrutura e propriedades das membranas biolgicas e a investigao de processos
biolgicos, tais como reconhecimento celular, catlise enzimtica, adeso celular e
fuso de membranas
37
. Apresentam uma variedade de aplicaes como a
biofuncionalizao de slidos inorgnicos e materiais polmricos, a preparao de
camadas ultrafinas com resistncia eltrica elevada em condutores e a incorporao de
receptores nestas camadas isolantes para o desenvolvimento de biossensores, podendo
ser feita assim a deteco eltrica e ptica do ligante inserido
21,22,38-42
. Uma outra
aplicao de grande destaque a insero de protenas, molculas de DNA, anticorpos e
de antgenos
42-46
. Porm, as membranas imobilizadas diretamente em substratos slidos
tm a desvantagem da proximidade entre a membrana artificial e a superfcie slida na
qual depositada. A distncia membrana-substrato no suficiente para evitar o direto
contato entre as protenas trans-membranares incorporadas e a superfcie slida
16
, a
Figura 12 apresenta um modelo referente a este tipo de estrutura.


Figura 12: Representao do contato direto de
protenas inseridas em membrana e a
superfcie do substrato
16
.

O contato direto com o substrato faz com que as protenas desnaturem ou
percam a atividade, podendo causar, por exemplo, uma resposta imune implantes
42
,
10
alm da perda da mobilidade lateral da protena na bicamada
47
e dos prprios lipdios
constituintes da membrana, cuja fluidez lateral crucial para a investigao de diversos
aspectos dinmicos das membranas biolgicas
16
.
Vrios so os esforos em aumentar o volume entre membrana e substrato,
proporcionando a formao de um ambiente que imite o meio extra-celular e o
glicoclix
16,48
(camada de polissacardeos que reveste uma clula animal externamente).
Conforme pode ser observado na Figura 13, a funcionalizao da superfcie do substrato
e do filme lipdico imobilizado pode ser realizada por diferentes estratgias, entre elas o
uso de lipdios sintetizados
42
como os tiis-lipdios
49,50
( assim chamados por conterem
grupo bissulfeto em sua estrutura), de monocamadas compostas por espaadores
orgnicos
51
como peptdeos
52
e alcanotiis
53,54
de polmeros depositados entre a
membrana e a superfcie
16,34,55
H tambm modificaes estruturais no prprio
substrato, como micro poros feitos em substratos de silcio. Estes modelos, embora mais
frgeis que o modelo de camada bilipdica suportada diretamente em substrato slido,
possibilitam o acesso a ambos os lados da membrana, oferecendo mais versatilidade e
estabilidade na composio da estrutura lipdica em cada lado da membrana, o que
possibilita a rpida adio de medicamentos, inibidores, entre outras molculas de
interesse
56
.












11


Figura 13: Representao de alguns dos modelos de membranas com espaadores. (A) polmero
16
,
(B) alcanotiol ligado a substrato slido suportando uma monocamada de lipdios
53
e (C) tiol lipdio:
estrutura e ligao ao substrato
49
.

















(C)
(A) (B)
12
2.2.1 - TCNICAS DE PREPARAO DE MEMBRANAS IMOBILIZADAS

Com o objetivo de obtere apropriadas caractersticas, grande importncia vem
sendo dada preparao das amostras de filmes lipdicos suportados. Atualmente vrias
so as alternativas para a deposio de filmes em substratos slidos, dentre elas
mencionam-se as tcnicas: Langmuir-Blodget, fuso de vesculas e espalhamento de
soluo orgnica, que pode ser feito por simples gotejamento da soluo (casting) e por
centrifugao (spin-coating)
17,22,31,56,57
. As duas primeiras tcnicas asseguram a
formao de uma ou duas camadas lipdicas, possibilitando uma superfcie ordenada e
livre de defeitos
31
, sendo instveis para um nmero maior de camadas imobilizadas
17
.
Entretanto, apesar das tcnicas oferecerem a presena de uma fina camada de gua entre
os lipdios e o substrato
22,58,59
, o filme lipdico interage fortemente com o substrato
60
, o
que trz srias limitaes para a investigao da estrutura e de vrias funes das
membranas biolgicas
34
. Por outro lado, o processo de simples espalhamento de soluo
orgnica leva formao de depsitos multilamelares orientados, podendo chegar a
centenas de bicamadas. Esta tcnica apresenta algumas vantagens como a incorporao
de protenas, transporte de frmacos e empacotamento de solues. Porm, importante
o controle do nmero de camadas formadas e uma orientao no alinhamento com o
substrato. A tcnica de spin-coating oferece a possibilidade da deposio controlada de
1 at aproximadamente 30 bicamadas ordenadas
17,31,60

Todas as tcnicas citadas acima, exceto Langmuir-Blodget (por no ser utilizada
neste trabalho), sero detalhadamente discutidas no tpico tcnicas e procedimentos
experimentais.


13
2.2.2 - TCNICAS DE CARACTERIZAO PARA MEMBRANAS
IMOBILIZADAS

As membranas depositadas so acessveis a uma grande variedade de tcnicas de
caracterizao, que permitem investigar a estrutura, composio e propriedades dos
filmes de fosfolipdios
9
. Exemplos destes mtodos so: microscopia ptica, microscopia
eletrnica
61,62
, raios-X
34
, reflectividade de nutrons
63
, difrao de nutrons
64
,
espectroscopia Raman
65
, microscopia fluorescente
66-68
, ressonncia superficial plasmon
(SPR), elipsometria
9,69
, espectroscopia por impedncia
16
, e espectroscopia por infra-
vermelho
49,70
. SPR e espectroscopia Raman permitem o monitoramento da formao de
filmes lipdicos e a deteco de ligao de biomolculas, elipsometria um conveniente
mtodo para a medida da espessura dos filmes, raio-X e nutrons fornecem no somente
a composio qumica do filme suportado mas tambm a organizao molecular
37,63
, a
microscopia ptica permite a medida da massa seca dos lipdios imobilizados
69
,
microscopia fluorescente permite o estudo da organizao molecular e a morfologia de
domnios lipdicos
31
, a microscopia eletrnica permite a determinao da ordem
molecular e visualizao da estrutura lateral em monocamadas orgnicas com resoluo
molecular
49
, e a espectroscopia por impedncia permite o sensoriamento condutivo da
atividade de canais inicos incrustados em membranas suportadas em eletrodos
16
.
Entretanto, com o advento do microscpio de fora atmica (AFM)
71
, tornou-se
possvel uma direta abordagem no estudo das membranas e uma variedade de novas
possibilidades de pesquisa em filmes lipdicos suportados. O AFM oferece exclusivas
vantagens em relao a outras tcnicas, como a capacidade de estudar em tempo real e
em ambiente aquoso, ou em condies nativas, a nano estrutura de filmes lipdicos e
suas mudanas estruturais em molculas individuais em at trs dimenses; possui alta
resoluo espacial, de tal modo que simples protenas podem ser observadas com
resoluo melhor que 1nm; permite a combinao de imagem e manipulao,
possibilitando perturbar a estrutura e processos biofsicos em sistemas biolgicos em
um nvel menor que o celular, na escala de molculas isoladas; possibilita a medida
quantitativa das foras existente nas interaes entre a camada lipdica e a ponta do
AFM, dando informaes sobre propriedades mecnicas da amostra biolgica. Estas
habilidades justificam o contnuo crescimento de aplicaes do AFM na pesquisa de
lipdios sustentados, isto se torna evidente observando-se o constante aumento de
publicaes neste campo
32,33,37,51,72-74
.

14
2.3 MICROSCPIO DE FORA ATMICA (AFM)

O AFM faz parte de um grupo de instrumentos denominados de microscpios de
varredura por sonda. A microscopia de fora atmica no oferece somente
caractersticas morfolgica e tipogrfica da amostra investigada, mas tambm outras
propriedades fsicas, como por exemplo, a condutibilidade eltrica de estruturas
sustentadas em substratos condutores
75
.
A parte mais importante de um AFM a ponta, que deve ser extremamente
delgada. Aspectos estruturais como o raio de curvatura, a altura, ngulos de aberturas
frontal e lateral da ponta, determinam o poder de resoluo das imagens topogrficas,
sejam elas verticais e ou laterais obtidas pelo microscpio. As pontas so usualmente
fabricadas a partir de silcio oxidado (SiO
2
) ou nitreto de silcio (Si
3
N
4
). Na Figura 14
pode-se observar a imagem de uma ponta no formato piramidal e os aspectos que
determinam sua qualidade na resoluo das imagens obtidas
76
.





Figura 14: (A) Imagem de uma ponta de AFM piramidal. (B) Imagem retirada da referencia 76, onde
aparece o raio de curvatura da ponta, durante interao da ponta com uma suposta amostra. (C) ngulos
laterais da ponta. (D) ngulo frontal e altura da ponta. As figuras B, C e D apresentam os aspectos que
determinam sua qualidade na resoluo das imagens obtidas

A ponta est conectada a outra parte fundamental do AFM, que quase sempre
constitudo do mesmo material da ponta, o cantilever ou haste flexvel.
__2m_
A C
B D

15
A haste uma espcie de alavanca com elevada flexibilidade, ou seja, com
constante elstica relativamente baixa ( na faixa de 10
-2
a 10
2
N/m), a razo desta
propriedade fsica que a alavanca seja passvel influncia de foras na faixa de
nanonewtons (nN). Alm de flexvel, a haste da alavanca no deve ser suscetvel a
instabilidades vibracionais durante a varredura da amostra, devendo ter elevada
freqncia de ressonncia, numericamente superior a 10 kHz
77-79
. A conseqncia direta
deste requisito que a haste deve ter comprimento muito pequeno
82
. Na Figura 15,
apresentada a imagem de um cantilver na forma triangular.


Figura 15: Foto de uma haste flexvel
(cantilver).

Conforme pode ser visto na Figura 16 a haste ligada a um suporte (chip)
geralmente feito de silcio, que base da sonda composta por ponta, alavanca e o
prprio suporte.


Figura 16: Foto de um suporte (chip) com
haste flexvel e ponta. O conjunto forma a
sonda do AFM.

A sonda montada no AFM executa uma varredura sobre a amostra. Esta
varredura que descrita na Figura 17, executada com a ponta passando num sentido
ao longo de uma linha na direo horizontal (i) e voltando no sentido contrrio sobre a
mesma linha. Logo aps, a sonda passa para uma outra linha na direo vertical (j).

200m

16

Figura 17: Ilustrao da varredura por uma sonda de AFM. A linha vermelha
inidica o caminho percorrido pela sonda na direo i, a linha azul indica o
movimento reverso e seguido de uma passagem para uma regio superior a ser
varrida. Os pontos presentes na figura indicam as regies aonde sero
armazenadas as informaes durante uma varredura.

O movimento da sonda sobre a amostra, realizado pelo sistema de varredura de
ponta (scanner). O scanner constitudo por material piezoeltrico que expande e
contrai proporcionalmente tenso aplicada, conforme pode ser observado na Figura
18.


Figura 18: Efeito da aplicao de tenso em material piezoeltrico
88
.

Os piezos utilizados atualmente, movem-se em escala atmica. So constitudos
de materiais cermicos e apresentam formato tubular. Por serem compactos e simtricos
permitem a varredura de largas reas
76,77
. Conforme pode ser observado na Figura 19,
as paredes do piezoeltrico cermico so polarizadas radialmente e revestidas
internamente e externamente com eletrodos, o eletrodo da face interna contnuo e o da
face externa dividido em quatro partes. Com a aplicao de uma diferena de
potencial no eletrodo interno e em todos os outros, o tubo poder contrair ou expandir
na direo z. Se a tenso for aplicada em um dos quatro eletrodos externos o tubo ir

17
encurvar nas direes x e y. Com o objetivo de poder se obter um encurvamento mais
acentuado, os eletrodos so organizados opostamente em termos da direo, por
exemplo, +x oposto a x. O resultado que se houver a aplicao de +n volts num
eletrodo e n volts noutro, o encurvamento ser duas vezes maior, do que se tenso for
aplicada em um nico eletrodo
77,78,80
.


Figura 19: Esquema de piezo-scanner tubular. Os vetores rosas
demonstram a polarizao radial do material do piezoeltrico
78
.

Durante a varredura, a haste flexvel sofrer deflexes, causadas pelas foras
existentes entre a ponta e a superfcie da amostra. Dentre todas que contribuem para as
deflexes, a mais associada com a microscopia de fora atmica, a fora interatmica
denominada de van der Walls.
Para a descrio matemtica da relao entre distncia e foras que atuam entre
uma partcula presente na extremidade da ponta de um AFM e outra na superfcie da
amostra, utiliza-se uma funo de energia potencial para um par de partculas, o modelo
desta funo conhecido como Lennard-Jones.

(

\
|

\
|
=
6 12
4 ) (
r r
r U

Onde e so constantes que dependem do material, sendo que a constante
aproximadamente igual ao dimetro das partculas envolvidas.

Derivando a funo potencial (U) descrita acima em funo da distncia (r),
obtm-se uma expresso para a fora (F) em funo da distncia (r), que pode ser
visualizada a seguir.


18
|
|

\
|
=
7
6
13
12
2
24 ) (
r r
r F

A partir da equao acima encontra-se o grfico apresentado na Figura 20.


Figura 20: Grfico fora (F) x distncia (r), obtido a partir da funo Lennard-Jones, usada para um par
de partculas. A parte acima do eixo r (regio 2) corresponde a regio onde predominam as foras
repulsivas, ou regio de contato. A parte abaixo do eixo r (regio 1) corresponde a regio onde
predominam as foras atrativas, ou regio de no-contato

Observa-se no grfico duas regies (1 e 2) delimitadas pelo eixo da distncia
entre superfcie e ponta. Na regio 2 a ponta est a poucos nanometros da superfcie da
amostra e a haste fica arqueada para cima, devido forte interao repulsiva existente
pelo princpio de excluso de Pauli e pela blindagem dos eltrons mais prximos ao
ncleo atmico, nesta regio o AFM opera em modo contato. Na regio 1 a ponta est
de dezenas a centenas de nanometros da superfcie da amostra, nestas distncias h o
predomnio de foras atrativas de van der Waals e a haste fica arqueada para baixo,
nesta regio o AFM opera em modo no contato. No intervalo que comea na regio 1
onde h o incio da marcao em cinza na curva e termina na regio 2 na marcao de
mesma cor, tem-se o modo intermitente ou tambm denominado de tapping-mode,
onde a haste oscila com determinada freqncia entre os modos contato e no contato.

19
Como neste trabalho foi usado somente o modo contato, o restante da seco
ser dedicado descrio deste modo de operao.
Neste modo de operao a ponta permanece em contato direto com a amostra
durante a medida. Possibilitando a varredura em altas velocidades; a obteno de
resoluo atmica na topografia das imagens e a investigao da amostra em um meio
lquido
77-80
.
Para trabalhar em modo contato deve-se ajustar a fora entre a amostra e a ponta
causando uma curvatura para cima na sonda, a qual deve permanecer constante durante
toda a varredura, este processo conhecido como modo de fora constante. Para manter
a deformao na alavanca como a pr-ajustada, um laser incide sobre a extremidade da
alavanca e ento um fotodiodo com 4 quadrantes detecta o feixe refletido, e converte o
sinal luminoso em um sinal eltrico que fica armazenado no computador como
referncia. Qualquer deflexo da alavanca altera a posio do feixe no fotodiodo, isso
faz com que se registrem sinais eltricos diferentes dos iniciais. A diferena entre os
sinais eltricos ento repassada ao piezoeltrico atravs de um sistema de
realimentao (feedback), que ento movimenta-se na direo do eixo Z
perpendicular a varredura da amostra.
Quando a varredura de uma amostra realizada num modo que mantm a
curvatura (Z
0
) da sonda constante, os valores das tenses eltricas enviadas para o
piezo so armazenadas no computador e os deslocamentos nas direes x, y e z do
piezoeltrico so ento convertidos na topografia da imagem
78
.
importante destacar que o mtodo de deteco por feixe ptico das deflexes
da sonda durante a varredura, embora tenha sido descrito durante a explicao do modo
contato, tambm usado para os modos de operao no-contato e intermitente (tapping
mode).
Na Figura 21 apresentado o esquema descrito acima para o processo de
obteno de imagens por microscopia de fora atmica.


20

Figura 21: Esquema de operao de um AFM
76
. Atravs da deteco das
deflexes da haste da sonda do AFM por um fotodiodo de quadrantes (A,B,C e
D) de um feixe de laser, obtm-se as informaes sobre topografia e morfologia
da amostra.




















21
3 PROCEDIMENTOS E TCNICAS EXPERIMENTAIS

3.1 PREPARAO DOS SUBSTRATOS

3.1.1 MICA

As superfcies de mica muscovita [(KAl
2
(OH)
2
AlSi
3
O
10
)] utilizadas como
substratos, foram adquiridas da firma SPI-supplies (West Chester, PA, U.S.A), sendo
esta mica a mais usada como substrato para obteno de camadas lipdicas. A sua
preparao consiste na clivagem da mica, obtendo-se assim superfcies limpas por no
estarem expostas atmosfera desde sua formao a milhes de anos atrs
77
.

3.1.2 SILCIO

Para o preparo dos substratos de silcio sempre se utilizou gua ultrapura
deionizada com resistividade especfica de 18 Mcm.
Os substratos de silcio utilizados nas amostras tinham rea de 1 cm
2
,
aproximadamente. As superfcies de silcio tipo N (100) foram adquiridas da MEMC
Eletronic Materials (Malsia).
Para a remoo do xido nativo formado pela exposio do silcio atmosfera,
as lminas foram colocadas por 30 s em um bquer com gua e logo em seguida imersas
em soluo de cido fluordrico (HF 5%) por 15 s. Aps, foram mergulhadas vrias
vezes em outro bquer com gua por 30 s e na seqncia enxaguadas em fluxo
constante de gua, tambm por 30 s. Para finalizar, as lminas foram secas em fluxo
constante de gs nitrognio. O resultado deste procedimento foi a obteno de ligaes
Si-H, as quais impedem momentaneamente a oxidao do silcio. Os substratos
submetidos as este procedimento apresentam propriedades hidrofbicas
81,82
.
Para a obteno de superfcies hidroflicas foi realizada a oxidao do silcio.
Inicialmente feita a remoo do xido nativo, conforme descrito no pargrafo anterior.
Logo aps, as lminas so mergulhadas em soluo piranha de H
2
SO
4
e H
2
O
2
(30%) na
proporo 4:1, aquecida previamente 80C, por 15 minutos. Em seguida, so
enxaguadas por fluxo constante de gua por 30s e secas em fluxo de gs nitrognio.
Atravs desse procedimento obtm-se na superfcie do silcio a formao de ligaes
SiO
2
, com propriedades hidroflicas
81,83
.
22

3.2 REAGENTES, SOLVENTES E FOSFOLIPDIO UTILIZADOS

Os reagentes, solventes e fosfolipdios adquiridos para utilizao nos
experimentos so das marcas relacionadas abaixo:
Sigma

- cido hidroxietil piperazina etanosulfnico HEPES.
Merck

-
Perxido de Hidrognio (H
2
O
2
), isopropanol, clorofrmio, cido
fluordrico (HF), cido sulfrico (H
2
SO
4
).
Avanti

Polar Lipids - O fosfolipdio 1,2-dimiristil-fosfatidilcolina (DMPC)
utilizado foi obtido da Avanti

Polar Lipids. A temperatura de transio de fase do

DMPC de aproximadamente 24C
84
.






















23


3.3 PREPARAO DOS FILMES LIPDICOS

Os filmes utilizados nos experimentos foram preparados por trs diferentes
tcnicas, espalhamento de vesculas lipdicas (fuso de vesculas), espalhamento de
soluo lipdica por centrifugao (spin-coating) e simples espalhamento de soluo
orgnica (casting).

3.3.1 FORMAO DE FILMES POR ESPALHAMENTO DE VESCULAS
LIPDICAS (LIPOSSOMAS) FUSO DE VESCULAS

O mtodo de fuso de vesculas tem atrado grande interesse na montagem de
filmes lipdicos por ser de fcil reprodutibilidade e de aplicabilidade em diversos
substratos
14
. Neste mtodo, uma soluo de vesculas lipdicas ou lipossomas
espalhada sobre o substrato, aps um perodo de incubao, o excesso de vesculas
retirado por rinsagem de soluo tampo HEPES + 0,9% NaCl. Obtm-se bicamadas
lipdicas auto-organizadas sobre o substrato, onde processo de rompimento das
vesculas induzido principalmente por foras de van der Walls
35,51,58,59
.

3.3.1.1 PREPARAO DAS VESCULAS OU LIPOSSOMAS

As vesculas unilamelares ou multilamelares, mostradas anteriormente na Figura
11, so formadas pela solubilizao de 20mg de lipdios em 1ml de clorofrmio num
balo de vidro. Em seguida, o solvente evaporado por fluxo de gs nitrognio,
formando uma camada no fundo do tubo. O balo volumtrico colocado em um
dessecador por 2 horas e em vcuo, para a completa evaporao do solvente. O filme
lipdico formado ento hidratado por soluo tampo HEPES 10mM em pH 7.4
(fisiolgico) e agitado vigorosamente em agitador tipo vortex. A concentrao final
obtida foi de 0,3mg/ml.




24


3.3.1.2 DEPOSIO DAS VESCULAS SOBRE OS SUBSTRATOS

Um volume de 20 L da soluo de lipossomas descrita no item anterior
gotejada sobre uma superfcie de mica de aproximadamente 1 cm
2
, recm clivada,
deixando-se incubar por 90 minutos para se obter a ruptura das vesculas e a formao
de bicamadas lipdicas, devido interao hidroflica entre as vesculas e o substrato,
conforme ilustrado na Figura 22. Em seguida o excesso de vesculas retirado por
rinsagem de soluo tampo HEPES com 0,9% NaCl.


Figura 22: Processo de fuso de vesculas sobre mica. a) Adsoro
das vesculas; b) fuso das vesculas ao substrato; c) ruptura das
vesculas. (Ilustrao extrada da referncia 59)

Neste mtodo foi usada somente a mica como substrato. A vantagem dos
substratos hidroflicos que durante a deposio do filme lipdico h a formao de uma
camada lubrificante de 10 a 20 de espessura de gua ou tampo, dando certa
mobilidade para a bicamada sustentada
15
. A Figura 23 apresenta a estrutura esperada
para as camada formadas, aps a ruptura das vesculas constitudas pelo fosfolipdio
DMPC.

25

Figura 23: Esturutra esperada na formao de bicamadas lipdicas
pelo mtodo de fuso de vesculas em substratos hidroflicos
59
.

3.3.2 FORMAO DE FILMES POR ESPALHAMENTO DE SOLUO
ORGNICA CASTING

A tcnica de espalhamento de soluo um mtodo prtico e eficiente para o
preparo de filmes de multicamadas lipdicas
62,85
. Este mtodo tambm conhecido pela
palavra em ingls casting. Consiste simplesmente em gotejar uma pequena quantidade
de lipdios solubilizados em solvente orgnico sobre o substrato desejado atravs do uso
de uma micropipeta. Aps o espalhamento da soluo, espera-se a evaporao do
solvente em uma capela de exausto, para em seguida colocar a amostra em um
dessecador em vcuo para a completa evaporao do solvente orgnico.
Neste trabalho foi utilizado o fosfolipdio DMPC dissolvido em
clorofrmio ou isopropanol em concentraes de 0,1 mg/ml e 0,3 mg/ml. As solues
lipdicas foram gotejadas usando micropipetas de 10 l, 20 l e 100 l em substratos de
mica, silcio hidroflico e silcio hidrofbico. O tempo de espera para a evaporao do
solvente na capela de exausto foi de 12 minutos e no dessecador de 15 horas,
aproximadamente.

3.3.3 FORMAO DE FILMES POR ESPALHAMENTO DE SOLUO
ORGNICA POR CENTRIFUGAO - SPIN COATING

Conforme mencionado na seco 2.2.1, o mtodo de crescimento de filmes
lipdicos denominado de centrifugao, em ingls spin-coating, oferece a
possibilidade de se obter um nmero controlado de bicamadas sustentadas, que pode
variar de uma a aproximadamente trinta. Nesta tcnica os lipdios so solubilizados em
solvente orgnico e pipetados sobre um substrato hidroflico ou hidrofbico, montado
26
no topo de um eixo que gira com uma freqncia constante. O equipamento utilizado
denominado de spin coater. Em seguida a amostra levada para o dessecador, onde
permanece em vcuo por um intervalo de tempo longo, para a completa evaporao do
solvente.
Neste trabalho foram preparadas solues lipdicas com DMPC diludo em
isopropanol na concentrao de 0,3 mg/ml. As solues foram pipetadas com
micropipetas de 10 l e 200 l sobre mica fixada no eixo de rotao de uma centrfuga,
em substituio ao emprego de um spin coater, no disponvel no laboratrio. A
soluo foi gotejada com o substrato girando na freqncia de 500 rpm, a qual
aumentada para 3000 rpm nos ltimos 3 minutos de centrifugao. Em seguida as
amostras foram levadas ao dessecador e mantidas por 15 horas em vcuo.














27
3.4 CARACTERIZAO POR AFM
As imagens de AFM foram obtidas com um microscpio PicoSPM da Molecular
Imaging Corporation (Tempe, Arizona). As medidas foram realizadas em sonda
composta por cantilver, e ponta de nitreto de silcio, fabricadas em suporte de silcio
(chip) de 1,6 mm x 3,4 mm. O modelo da sonda utilizada NP-S com cantilever de
200 m de comprimento e formato triangular com as hastes formando ngulos de 45
com o chip, e constante de mola nominal de 0,12 N/m. A ponta de formato
piramidal de raio de curvatura 10 nm com ngulos frontal e laterais de 35. Para o
controle e aquisio de dados foi utilizado programa computacional PicoScan verso
4.19. Na Figura 24 apresentado o microscpio utilizado na realizao das imagens.


Figura 24: Foto do AFM usado na obteno das imagens e cmara para evitar
vibraes mecnicas e sonoras.

As imagens e grficos apresentados na dissertao foram tratados pelo programa
computacional de microscopia de sonda por varredura WSxM 4.0 verso 9.2. de agosto
de 2006 da Nanotec Eletrnica SL e Origin 6.1. v6. 1052 (B232) da OriginLab
Corporation.
28
O clculo da rugosidade mdia quadrtica (w) foi realizado pelo programa
computacional PicoScan verso 4.19 do AFM. A rugosidade mdia quadrtica
encontrada atravs da Equao 1, onde h a altura, L
x
e

L
y
so os comprimentos das
coordenadas (x,y). Na Equao 2 apresentado o clculo da altura mdia (h
L
) da
amostra
86
.

2
1 1
_
2
] ) , ( [
1
) (

=
= =
x
L
i
y
L
j
L
h j i h
L
L w
(1)
onde:
( )
=
= =
Lx
i
Ly
j
L
j i h
L
h
1 1
,
1
(2)

Na maioria das medidas realizadas, a temperatura da amostra foi estimada pela
medida da temperatura no interior da cmara antivibrao do AFM, atravs do
termmetro digital acoplado a ela.

3.4.1 CLULA LQUIDA DO AFM
Conforme j apresentado na seco 2.2.2, a microscopia de fora atmica
oferece a grande vantagem de realizao de imagens em meios lquidos. A clula
lquida do AFM foi construda no LFFS para a realizao de imagens in-situ. Nesta
clula usualmente colocado uma quantidade de 800 l de soluo tampo HEPES 10
Mm, 0,9% NaCl, e pH 7,4, com o objetivo de mimetizar o ambiente natural de uma
membrana plasmtica. As amostras foram imersas nesta soluo e fixadas pelo anel
branco que aparece na Figura 25, para realizao das medidas de AFM.



29


Figura 25: Fotos da clula lquida construda no laboratrio. A esquerda; clula
lquida desmontada com a amostra em seu interior sem a soluo tampo. No centro,
viso lateral da clula lquida fixada no suporte de amostra do AFM, com a amostra j
in-situ. direita; viso superior da foto apresentada no centro.

3.4.2 MTODO DE HIDRATAO DAS AMOSTRAS
Algumas amostras foram hidratadas em vapor de gua a 40C por 20 minutos. A
hidratao foi realizada colocando-se as amostras em atmosfera mida em um
equipamento de Banho-Maria com gua a 40C. Para esta finalidade, o suporte de
amostras do AFM foi posicionado acima do nvel da gua do banho-maria. O sistema
permanece tampado, durante todo o tempo de hidratao, conforme mostrado na Figura
26.


Figura 26: Fotos do equipamento de banho-maria usado para hidratao
das amostras. A esquerda aparece a amostra colocada acima do nvel da
gua sobre suportes imersos em gua a 40C. A direita o banho maria
tampado durante a hidratao.



30
3.4.3 CONTROLE DA ATMOSFERA DE TRABALHO
Algumas imagens foram realizadas em ambiente controlado por fluxo de gs
nitrognio, a fim de diminuir a umidade sobre a superfcie da amostra e,
conseqentemente, a formao de camadas de gua causadoras de foras de capilaridade
na ponta do AFM, que interferem na qualidade das imagens obtidas
77
. Na Figura 27
apresentada a base utilizada para o controle da atmosfera, que consiste de um recipiente
de vidro com um flange de metal para que o microscpio encaixe e possibilite que o
sistema fique hermeticamente celado. Atravs de uma mangueira de plstico lateral,
mostrada na Figura 27 viabilizada a entrada de gs nitrognio.



Figura 27: Fotos da base utilizada para controle da atmosfera. esquerda; suporte utilizado para
se obter ambiente controlado. direita; a base conectada ao tubo do gs nitrognio, com o
microscpio sobre ela. A conexo entre o microscpio e a base tal que obtm-se um ambiente
praticamente isolado do meio externo.









31
4 APRESENTAO E DISCUSSO DOS RESULTADOS

Neste trabalho foram obtidas imagens de camadas lipdicas imobilizadas em
superfcies por microscopia de fora atmica, para as trs tcnicas de preparao
apresentadas nas sesses 3.3.1, 3.3.2 e 3.3.3, com a finalidade de descrever o processo
de formao e a topografia destas camadas. Foram abordados tambm aspectos
experimentais que influenciaram no crescimento de camadas lipdicas, bem como
processos fsicos que alteram a estrutura morfolgica destas.

4.1 ANLISE DOS SUPORTES UTILIZADOS

Todos os substratos analisados neste tpico foram preparados pelos processos
descritos na seco 3.1 e em seguida levados diretamente ao microscpio de fora
atmica, para realizao de imagens sob ambiente controlado por fluxo constante de gs
nitrognio.
Na Figura 28 mostrada imagem da superfcies da mica logo aps o processo de
clivagem.

1.0m

0.0 0.4 0.8 1.2
0
1
2
3
4
5


A
l
t
u
r
a

(

)
Distnica (m)

Figura 28: A esquerda; Imagem de mica logo aps o processo de clivagem. . A direita;
medida das alturas na regio demarcada. A rugosidade mdia quadrtica encontrada foi de
1,05 .

Na Figura 29 apresentada imagen de silcio hidrofbico, isto , para a
superfcie do Si passivada com ligaces (Si-H).
32
400nm

0 200 400 600
0
1
2
3
4
5
6
7
8


A
l
t
u
r
a

(

)
Distncia (nm)

Figura 29: A esquerda; Imagem de silcio hidrofbico (SiH), logo aps processo de remoo do
xido nativo, sob fluxo constante de gs nitrognio. A direita; grfico referente as alturas da regio
marcada na imagem da esquerda. A rugosidade mdia quadrtica encontrada foi de 1,96 .

Na Figura 30 apresentada a imgem de silcio hidroflico SiO
2
, oxidadado por
soluo piranha.

1.0m

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6
0
1
2
3
4
5


A
l
t
u
r
a

(

)
Distncia ( m)

Figura 30: A esquerda; Imagem de silcio hidroflico (SiO
2
), logo aps ser oxidado por soluo
piranha. A direita; grfico referente as alturas da regio marcada na imagem da esquerda. A
rugosidade mdia quadrtica encontrada foi de 0,70 .

As alturas que variam entre 0 e 7 e rugosidades mdias quadrticas de 1,05
(mica), 0,70 (SiO
2
) e 1,96 (SiH), indicam a formao de substratos planos que
apresentam uniformidade lateral.
As alturas obtidas nas imagens de SiO
2
so menores do que as medidas no silcio
hidrofbico. Embora a camada xida formada por soluo piranha apresente espessura
33
na ordem de 1,5 nm ou mais
81
, os resultados indicam uma uniformidade nas alturas do
xido formado sobre o substrato.































34
4.2 ANLISE DOS FILMES LIPDICOS FORMADOS POR FUSO DE
VESCULAS

Conforme j descrito na seo 3.3.1, o mtodo de fuso de vesculas foi
realizado somente em substratos de mica. Utilizando a clula lquida apresentada da
seo 3.4.1, a imagem da Figura 31 foi realizada com a amostra totalmente submersa
em soluo tampo HEPES com 0,9% de NaCl (in-situ), na temperatura ambiente de
18C.

2.0m
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
-1
0
1
2
3
4
5
6


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 31: A esquerda; imagem topogrfica de camada DMPC preparada por fuso de vesculas em
substrato de mica, a imagem foi realizada in-situ na temperatura ambiente de 18C. A direita; perfil de
aproximadamente 5 nm medido na regio destacada da imagem topogrfica.

As alturas encontradas de aproximadamente 5 nm esto de acordo com as de
bicamadas lipdicas e revelam a ruptura das vesculas ao entrarem em contado com o
substrato. Os resultados encontrados esto de acordo com alguns artigos na literatura
relacionados ao estudo de camadas lipdicas in-situ
12,61,35
.
A Figura 32 apresentada a seguir, foi realizada em outra regio da amostra da
Figura 31, mantendo-se todas as condies j descritas.
35
4.4m


Figura 32: (A) Imagem topogrfica em duas dimenses em outra regio da amostra da Figura 31,
mantida todas as condies anteriores. (B) Mesma imagem, porm com a topografia revelada em
trs dimenses. Pode-se observar uma regio com maior uniformidade lateral das camadas
lipdicas sustentadas. As alturas encontradas so da ordem de 5nm.

A anlise topogrfica da Figura 32 revela uma maior uniformidade lateral na
distribuio das camadas lipdicas sobre o substrato, se comparado com os filmes
formados na Figura 31. O que demonstra a possibilidade da obteno de regies do
substrato com dimenses na ordem de 20 m
2
totalmente cobertas por bicamadas
lipdicas.















A
B
36
4.3 ANLISE DOS FILMES LIPDICOS FORMADOS POR SPIN
COATING

A preparao das amostras das imagens apresentadas a seguir foi feita nas
condies citadas no tpico 3.3.2 desta dissertao, com a utilizao de uma pipeta de
200 L para o gotejamento da soluo sobre o substrato de mica. As imagens da Figura
36 foram realizadas ex-situ na temperatura de 26C, sem as amostras passarem por
qualquer processo de hidratao.

4.0m

4.0m

Figura 36: Filmes lipdicos de DMPC imobilizados em mica pela tcnica spin-coating. Utilizou-se uma
pipeta de 200 L no processo de pipetamento da soluo lipdica sobre o substrato em rotao. Imagens
topogrficas de amostras diferentes, porm formadas nas mesmas condies, realizadas ex-situ na
temperatura de 26C. (A) Formao de bicamadas lipdicas. (B) Observao de multicamadas. Ambas as
amostras no foram hidratadas.

Nas imagens da figura 36 observou-se a formao de bicamadas e multicamadas
de DMPC, em duas amostras diferentes que foram submetidas ao mesmo processo de
formao e condies de investigao.
Na Figura 37 observa-se a mesma amostra da Figura 36(A) hidratada em vapor
de gua a 40C por 20 minutos, A imagem obtida foi realizada ex-situ a 25C.

A
B
37
4.0m

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0
2
4
6
8
10
12


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 37: esquerda; imagem topogrfica ex-situ a 25 C da mesma amostra da Figura 36(A) hidratada
em vapor de gua a 40C por 20 minutos, antes da realizao da varredura pelo AFM em modo contato.
direita; perfil de alturas que revela a formao de mais de uma bicamada lipdica.

A Figura 37 observa-se a formao de mais de uma bicamada lipdica na mesma
amostra que havia apresentado a formao de uma bicamada em outra regio antes da
hidratao por vapor de gua, conforme pode ser verificado na figura 36(A). Pelo
resultado encontrado, pode-se chegar a concluso de que a observao das
multicamadas na Figura 37 est ligado ao processo de hidratao. No entanto, de acordo
com as referncias 15 e 94, o processo de hidratao causa mudanas morfolgicas na
estrutura dos filmes. Como obteve-se na Figura 36(B), a formao de mais de uma
bicamada para a condio ex-situ sem hidratao, pode-se concluir que apenas est se
observando na Figura 37 uma outra regio da amostra com estrutura multilamelar,
porm com estrutura morfolgica diferenciada devido a hidratao da amostra.
Outra amostra foi formada nas mesmas condies das anteriores, porm com a
deposio da soluo lipdica sendo realizada por uma pipeta de 10 L. As imagens ex-
situ obtidas na temperatura de 25C, de duas regies diferentes da mesma amostra, aps
hidratao feita do mesmo modo que a da Figura 36, so apresentadas nas Figuras 38 e
39.
38
2.0m

Figura 38: Filmes lipdicos de DMPC imobilizados em mica pela tcnica spin-coating. Utilizou-se
uma micropipeta de 10 L no processo de despejo da soluo lipdica sobre o substrato em rotao.
Imagem topogrfica ex-situ realizada na temperatura de 25C. A amostra foi hidratada em vapor de
gua 40C por 20 minutos, antes da realizao da varredura pelo AFM em modo contato. (A)
Imagem bidimensional e (B) imagem tridimensional.

2.0m


Figura 39: Imagem em outra regio da mesma amostra da Figura 38, nas mesmas condies. (A) Imagem
Bidimensional e (B) imagem tridimensional.

As imagens mostradas das Figuras 38 e 39 confirmam a possibilidade de se
observar numa mesma amostra, depositada por spin-coating, a formao de uma ou
mais bicamadas lipdicas.
Comparando os resultados apresentados nas figuras 36, 37, 38 e 39, leva-se a
concluso de que a concentrao lipdica gotejada sobre o substrato em rotao no
interfere consideravelmente na quantidade de bicamadas formadas, pois, caso contrrio
deveria ser observado com mais facilidade a formao de multicamadas na amostra das
Figuras 36 e 37 que foi formada pelo pipetamento de 200 L de soluo lipdica. Alm
A B
A
B
39
do mais, a formao de multicamadas foi observada na amostra onde a quantidade de
10L de soluo foi gotejada. De certo modo o resultado no to surpreendente, pois,
de acordo com a literatura os fatores determinantes para a formao de camadas
lipdicas por spin-coating so o tamanho do substrato, a rotao a qual est submetido
e a concentrao lipdica da amostra pipetada
17
, ou seja, independe da quantidade de
soluo gotejada durante a centrifugao do substrato.

4.3.1 TRANSIO DE FASE DO DMPC

Foram realizadas imagens em outras amostras formadas nas mesmas condies
da apresentada nas Figuras 38 e 39. Tambm, foi realizado o processo de hidratao por
vapor de gua a 40C por 20 minutos, antes da realizao da anlise topogrfica dos
filmes pelo AFM. Os resultados a serem apresentados nas Figuras 40 e 41, so de
amostras diferentes e foram obtidos em ambiente ex-situ na temperatura de 25C.

2.0m

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 40: Imagem ex-situ realizada na temperatura de 25C de filme lipdico previamente hidratado,
formado nas mesmas condies do apresentado nas Figuras 38 e 39. O perfil das alturas revela a
coexistncias da fase L

(parte mais escura e baixa da imagem) e da fase gel L

(parte mais clara e alta da

imagem).


40
1.0m

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)


Figura 41: Imagem de outra amostra feita nas mesmas condies e temperatura da apresentada na
Figura 40. Do mesmo modo, o perfil das alturas (B) revela coexistncia das fases gel e lquida na regio
indicada na imagem bidimensional (A). A imagem tridimensional (C) d uma idia melhor da diferena
entre a altura da bicamada lipdica e as alturas referentes a fases diferentes do filme de DMPC a 25C.

Conforme apresentado na reviso bibliogrfica na seco 1.1, os lipdios
apresentam transio de fase do estado lquido cristalino ou fludico (L

) para o estado
gel ou paracristalino (L

). A fase gel apresenta altura um pouco maior que a fase

fludica, devido organizao dos hidrocabornetos em ambos os estados. Em artigos de
microscopia de fora atmica disponveis na literatura, o 1,2-dimiristil-fosfatidil colina
(DMPC) inicia sua transio em 23C e acaba em 26C aproximadamente, sendo que as
A B
C
41
diferenas de alturas encontradas entre as fases lipdicas variam de 0,1 nm 1 nm,
aproximadamente
12,35,61,87
. Deste modo as imagens apresentadas nas Figuras 40 e 41
esto de acordo com o esperado.
O mtodo de spin-coating dentre as tcnicas de deposio de filmes lipdicos
mais utilizadas uma das mais recentes
31
. Talvez, por este motivo encontram-se poucos
artigos que tratam transio de fase de filmes de DMPC formados pela tcnica. Por
esta razo, mesmo no sendo o foco deste trabalho apresentou-se a elucidao do
comportamento de fosfolipdios durante a mudana de estado fsico nas Figuras 40 e 41.


























42
4.4 ANLISE DOS FILMES LIPDICOS FORMADOS POR SIMPLES
ESPALHAMENTO DE SOLUO ORGNICA CASTING

A tcnica de espalhamento de lipdios por soluo orgnica, foi a nica que se
usou substratos diferentes e solues com variaes nas concentraes lipdicas. Alm
disso, foi a que se fez o maior nmero de imagens nos modos in-situ, hidratada por
vapor de gua e ex-situ. Portanto, este mtodo foi o de maior foco deste trabalho.
Importante destacar que todas as imagens das amostras realizadas em ex-situ, foram
expostas a fluxo constante de gs nitrognio, assim como, as realizadas em in-situ
referem-se a total imerso da amostra em soluo tampo HEPES com 0,9% de NaCl.
Para melhor anlise dos resultados, as imagens obtidas sero apresentadas de
acordo com os substratos utilizados.

4.4.1 - MICA

Na formao das amostras utilizou-se a concentrao lipdica de 0,3 mg/ml de
DMPC diludo em isopropanol. O volume da soluo pipetada sobre o substrato foi de
20 L. Nas Figuras 42 e 43, so mostradas imagens realizadas da mesma amostra, em
condies ambiente diferentes, ex-situ e in-situ respectivamente.





43
4.0m

0 1 2 3 4 5
0
2
4
6
8
10
12


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 42: Bicamadas lipdicas de DMPC imobilizados em mica pela tcnica casting. Utilizou-se uma
micropipeta de 20L no processo de despejo da soluo lipdica sobre o substrato. esquerda; Imagem
topogrfica ex-situ em ambiente controlado por fluxo constante de gs nitrognio, realizada na
temperatura de 19C. direita; perfil das alturas obtidas na regio indicada na imagem topogrfica.

2.0m

0.0 0.4 0.8 1.2
0
1
2
3
4
5
6
7


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 43: Imagem da mesma amostra da figura 42. Entretanto, aps ser colocada em meio in-situ
15C. esquerda, imagem topogrfica. direita, perfil das alturas obtidas na regio indicada na imagem
topogrfica, que revela a estrutura de uma bicamada lipdica.


Na imagem da Figura 42 observou-se em ex-situ o crescimento de duas
bicamadas lipdicas, resultado j esperado de acordo com a descrio feita na seco
2.2.1. sobre filmes formados por casting. Entretanto, como mostra a Figura 43,
quando a amostra foi colocada in-situ obteve-se somente alturas relativas a uma
44
bicamada. Este fato pode ser explicado pela forte interao existente entre a primeira
bicamada e o substrato hidroflico, que maior do que a interao entre a mesma
bicamada e as posteriores
60
. Baseado neste argumento, pode-se concluir que a soluo
fisiolgica do meio in-situ desprende as camadas mais externas da primeira bicamada
ligada fortemente ao substrato, restando deste modo a bicamada apresentada na Figura
43. Em reforo a esta concluso, encontram-se facilmente artigos na literatura que usam
jatos de gua sobre amostras formadas por casting, a fim de retirar o excesso de
bicamadas suportadas sobre a primeira, que est em contato com o substrato, antes da
visualizao da amostra no AFM. As imagens obtidas aps este procedimento esto de
acordo com as de bicamadas lipdicas sustentadas em suportes hidroflicos
34
.
A Figura 44 apresenta o resultado obtido para uma outra amostra formada nas
mesmas condies que a das Figuras 42 e 43. A imagem foi realizada ex-situ na
temperatura de 26C.

3.0m


Figura 44: Imagem topogrfica realizada em outra amostra, nas mesmas condies da amostra utilizada nas
Figuras 42 e 43, porm na temperatura de 26C. (A) Imagem Bidimensional e (B) imagem tridimensional,
ambas revelam a estrutura de multicamadas lipdicas imobilizadas.

Observando as imagens das Figuras 42 e 44, nota-se a formao de um nmero
maior de multicamadas na ltima. Este resultado no surpreende, visto que bastante
comum observar uma no uniformidade lateral em filmes lipdicos crescidos por
espalhamento de soluo orgnica. Principalmente pela tcnica casting, onde a soluo
lipdica no espalhada uniformemente sobre o substrato, sendo apenas despejada sobre
ele. Portanto, h regies da amostra com inmeras bicamadas e outras onde no se
observa camadas lipdicas depositadas.
45
4.4.2 SILCIO HIDROFLICO (SiO
2
)

Para a adsoro dos fosfolipdios sobre o substrato, foram espalhadas solues
lipdicas de DMPC diludo nos solventes isopropanol e clorofrmio. Dependendo do
tipo de solvente, alterou-se a quantidade de soluo pipetada e sua concentrao
fosfolipdica.
As solues foram pipetadas em quantidades de 20 l quando o solvente foi o
isopropanol e nas quantidades de 20 l e 100 l quando utilizou -se o clorofrmio.
Para o solvente clorofrmio utilizou-se somente a proporo de 0,3 mg/ml na
concentrao da soluo lipdica. Enquanto que para o isopropanol foi utilizado alm de
0,3 mg/ml a proporo 0,1 mg/ml.
Os resultados sero apresentados de acordo com o solvente utilizado na diluio
do DMPC.

4.4.2.1 SOLUES LIPDICAS EM ISOPROPANOL

A amostra a ser apresentada na Figura 45, foi formada por pipetamento de
soluo lipdica de 0,1 mg/ml atravs de uma pipeta de 20 L sobre o substrato. As
imagens foram realizadas em meio ex-situ a 26C.




46
4.0m

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0
2
4
6
8
10
12


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 45: Bicamadas lipdicas de DMPC imobilizados em SiO
2
pela tcnica casting. Utilizou-se uma
micropipeta de 20 L no processo de pipetamento da soluo lipdica com isopropanol de 0,1 mg/ml sobre
o substrato. esquerda; Imagem topogrfica ex-situ em ambiente controlado por fluxo constante de gs
nitrognio, realizada na temperatura de 26C. direita; perfil das alturas obtidas na regio indicada na
imagem topogrfica.

Pela morfologia da imagem da Figura 45, verifica-se a facilidade em se obter
alturas relativas a bicamadas de DMPC, devido a baixa concentrao da soluo lipdica
depositada (0,1 mg/ml).
As imagens que sero apresentadas nas figuras 46, 47 e 48 so de amostras feitas
com soluo lipdica na concentrao de 0,3 mg/ml, construdas nas mesmas condies
que a da Figura 45.
A seguir, na Figura 46, pode ser observada a imagem topogrfica em duas e trs
dimenses de camadas lipdicas investigadas em meio ex-situ na mesma temperatura da
imagem obtida para a Figura 45, 26C.
47
3.0m

0 1 2 3 4
0
20
40
60
80
100


A
l
t
r
u
a

(
n
m
)
Distncia (m)


Figura 46: Multicamadas lipdicas de DMPC imobilizados em SiO
2
pela tcnica casting. Amostra
formada nas mesmas condies da figura 45, sendo que modificou-se a concentrao da soluo lipdica
gotejada para 0,3 mg/ml sobre o substrato, mantendo-se a quantidade. (A) Imagem topogrfica ex-situ em
ambiente controlado por fluxo constante de gs nitrognio, realizada na temperatura de 26C. (B) perfil
das alturas obtidas na regio indicada na imagem topogrfica. (C) Viso tridimensional das multicamadas.

Com o aumento da concentrao lipdica na soluo observa-se com maior
facilidade na Figura 46 a obteno de multicamadas. Importante destacar que a estrutura
obtida nesta figura para o silcio oxidado, bastante semelhante estrutura obtida para
o substrato de mica na Figura 44. Observando que as amostras foram formadas pela
A B
C
48
mesma concentrao lipdica com isopropanol (0,3 mg/ml) e mesma quantidade de
soluo pipetada (20 l).
Portanto, pode-se concluir que a morfologia das estruturas multilamelares
formadas nas Figuras 44 e 46, est relacionada mais com o comportamento hidroflico
do substrato, do que com a substncia que ele constitudo.
A amostra da Figura 46 foi colocada in-situ e foram obtidas as imagens
apresentadas nas Figuras 47 e 48 na temperatura de 24,5C.

3.0m

Figura 47: Imagem topogrfica da mesma amostra da figura 46. Entretanto, aps ser colocada em meio
in-situ a 24,5C. esquerda, imagem topogrfica, onde as alturas medidas so da ordem de 6nm.
direita, viso tridimensional demonstrando uma relativa uniformidade lateral da bicamada lipdica.

3.0m

0 200 400 600 800
-1
0
1
2
3
4
5
6
7


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (nm)

Figura 48: Imagem topogrfica in-situ em outra regio da mesma amostra da Figura 47, na temperatura
de 24,5C. direita, perfil das alturas obtidas na regio indicada na imagem topogrfica, que revela a
estrutura de uma bicamada lipdica.
49
Da mesma forma que as imagens ex-situ para o silcio oxidado e mica,
apresentam resultados semelhantes. Os resultados das Figuras 47 e 48 esto de acordo
com o obtido na Figura 43 para amostras de filmes de DMPC depositadas em mica in-
situ nas mesmas concentraes e quantidade, utilizando-se o mesmo solvente. Ou seja,
bicamadas lipdicas so visualizadas para amostras in-situ depositadas em substratos
hidroflicos, independentemente da natureza dos mesmos.

4.4.2.2 SOLUES LIPDICAS EM CLOROFRMIO

As amostras foram preparadas nas mesmas condies que as formadas pela
deposio de lipdios diludos em isopropanol, apenas foi modificado o solvente para
clorofrmio, sendo que a concentrao lipdica usada foi sempre de 0,3 mg/ml. Como
ser visto, em algumas amostras mudou-se a quantidade de soluo lipdica pipetada
sobre o substrato de 20 l para 100 l.

4.4.2.2.1 20 l DE SOLUO PIPETADA

As imagens das Figuras 49 e 50 apresentadas a seguir, so de regies diferentes
da mesma amostra. Foram realizadas em ambiente ex-situ a 23C.

3.0m

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0
20
40
60
80
100


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 49: Multicamadas lipdicas de DMPC imobilizados em SiO
2
pela tcnica casting. Utilizou-se
uma micropipeta de 20 L no processo de pipetamento da soluo lipdica com clorofrmio de 0,3
mg/ml sobre o substrato. esquerda; Imagem topogrfica ex-situ em ambiente controlado por fluxo
constante de gs nitrognio, realizada na temperatura de 23C. direita; perfil das alturas obtidas na
regio indicada na imagem topogrfica.
50

3.0m



0.0 0.5 1.0 1.5
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)


Figura 50: Imagem em outra regio da mesma amostra da Figura 38, nas mesmas condies e
temperatura. (A) Imagem Bidimensional, revelando estrutura cilndrica nas multicamadas formadas; (B)
perfil das alturas obtidas, referentes a multicamadas e (C) imagem tridimensional oferecendo uma melhor
visualizao dos cilindros lipdicos.


Pela observao das imagens das Figuras 49 e 50, obtidas de uma mesma
amostra, nota-se claramente a formao de multicamadas. Entretanto, a morfologia das
camadas apresenta grande diferena. Isto foi verificado em vrias amostras depositadas
A B
C
51
em superfcies hidroflicas onde se utilizou o clorofrmio como solvente. Talvez, ocorra
esta discrepncia morfolgica em diferentes regies da amostra, devido falta de
aderncia do solvente ao substrato. Mas, dentre todas as estruturas lipdicas encontradas
para amostras nestas condies, o aspecto cilndrico apresentado na Figura 50 com
certeza o de maior destaque. Isto porque alm de seu aspecto curioso a estrutura foi
repetida em outras amostras construdas nas mesmas condies.

4.4.2.2.2 100 l DE SOLUO PIPETADA

A amostra apresentada na Figura 51, foi feita nas mesmas condies da amostra
das Figuras 49 e 50, ou seja, pipetou-se soluo lipdica de DMPC diludo em
clorofrmio na concentrao de 0,3 mg/ml em substrato de SiO
2
. No entanto alterou-se
a quantidade de soluo despejada para 100 L. A imagem foi realizada em ambiente
ex-situ na temperatura de 23C.










52
4.0m

0 1 2 3 4
0
50
100
150
200
250


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)


Figura 51: Multicamadas lipdicas de DMPC imobilizados em SiO
2
pela tcnica casting. Utilizou-se uma
pipeta de 100 L no processo de pipetamento da soluo lipdica com clorofrmio de 0,3 mg/ml sobre o
substrato. (A) Imagem topogrfica bidimensional, revelando estrutura cilndrica nas multicamadas
formadas; ex-situ em ambiente controlado por fluxo constante de gs nitrognio, realizada na temperatura
de 23C. (B) perfil das alturas obtidas, referentes a multicamadas e (C) imagem tridimensional oferecendo
uma melhor visualizao dos cilindros lipdicos, agora quase que totalmente macios.

Pela imagem da Figura 51, observa-se a formao de um nmero maior de
camadas lipdicas e a manuteno do padro cilndrico observado na Figura 50.
Entretanto os cilindros lipdicos aparecem mais preenchidos. As mudanas nas alturas
53
obtidas e na morfologia das multicamadas podem ser facilmente explicadas devido ao
aumento de cinco vezes na concentrao lipdica por mililitro de solvente orgnico.

4.4.3 SILCIO HIDROFBICO (Si-H)

Para espalhamento dos fosfolipdios foram somente usadas solues orgnicas
de clorofrmio, pelo fato deste solvente espalhar-se facilmente sobre substratos
hidrofbicos.
A concentrao de 0,3 mg/ml foi mantida constante nas solues lipdicas
despejadas em todas as amostras utilizadas nas imagens obtidas. Variou-se somente a
quantidade de soluo pipetada sobre os substratos, sendo de 20 l na maioria das
amostras e 100 l em outras.
Conforme realizado nos outros substratos, as imagens foram realizadas por
microscopia de fora atmica no modo contato em ambientes ex-situ, com ambiente
controlado por fluxo de gs nitrognio e in-situ em soluo tampo HEPES com 0,9%
de NaCl. Sendo que algumas amostras foram hidratadas em vapor de gua a 40C por
20 minutos antes da varredura em ambiente ex-situ pelo AFM.

4.4.3.1 20 l DE SOLUO PIPETADA

As imagens apresentadas nas Figuras 52 e 53, a seguir, so da mesma amostra
formada pelo despejo de 20 L de soluo lipdica sobre o silcio. Elas foram realizadas
em ambiente ex-situ na temperatura de 27 C.

54
4.0m
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
50


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distnica (m)

Figura 52: Multicamadas lipdicas de DMPC imobilizados em SiH pela tcnica casting. Utilizou-se uma
micropipeta de 20 L no processo de pipetamento da soluo lipdica com clorofrmio de 0,3 mg/ml
sobre o substrato. esquerda; Imagem topogrfica ex-situ em ambiente controlado por fluxo constante de
gs nitrognio, realizada na temperatura de 27C. direita; perfil das alturas obtidas na regio indicada
na imagem topogrfica.

4.0m
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
50
60


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 53: esquerda; imagem topogrfica ex-situ a 27 C da mesma amostra da Figura 52, hidratada
em vapor de gua 40C por 20 minutos, antes da realizao da varredura pelo AFM em modo contato.
direita; perfil de alturas que revela a manuteno das multicamadas lipdicas.

Atravs da anlise das imagens das Figuras 52 e 53 observa-se a mudana
morfolgica das camadas lipdicas e nenhuma mudana significante nas alturas obtidas
aps hidratao por vapor de gua, o que era esperado pelo o que j foi discutido na
55
seco 4.3 para a tcnica spin-coating. As pequenas mudanas registradas nas alturas de
uma imagem para outra, deve-se a no uniformidade no espalhamento das multicamadas
sobre o substrato do que ao fato de a amostra estar hidratada.
A seguir, ser apresentada uma outra amostra feita nas mesmas condies que a
investigada na Figura 52. Primeiramente, na Figura 54 ser verifica sua topografia em
ambiente ex-situ e em seguida, na Figura 55 em meio in-situ (Figura 51).

4.0m
0 1 2 3 4 5
0
15
30
45
60
75


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 54: esquerda; Imagem topogrfica ex-situ realizada em outra amostra, nas mesmas condies
da amostra utilizada na Figuras 52, porm na temperatura de 26C. direita; perfil das alturas obtidas na
regio indicada na imagem topogrfica, revela novamente a formao de multicamadas lipdicas.



56
3.0m

0 1 2 3 4
0
15
30
45
60
75


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)

Figura 55: esquerda; Imagem topogrfica in-situ realizada na mesma amostra da figura 54, na
temperatura de 27,6C. direita; perfil das alturas obtidas na regio indicada na imagem topogrfica. A
anlise das alturas revela a manuteno da estrutura multilamelar mesmo a amostra estando in-situ.

Em comparao com as imagens in-situ obtidas nas Figuras 47 e 48 para o
substrato SiO
2
, observa-se na imagem da Figura 55 que no houve reduo de
multicamadas para bicamadas como aconteceu para os substratos hidroflicos.
Importante destacar ainda, que este resultado foi verificado para outras amostras
realizadas nas mesmas condies, com o mesmo substrato SiH. Certamente este
resultado deve estar relacionado com uma possvel mudana na formao estrutural das
multicamadas, durante a auto-organizao delas sobre o substrato hidrofbico. Essa
possvel mudana pode ocorrer, pois, como a cauda do DMPC hidrofbica, deve ser
essa a parte do lipdio que interage com o substrato e possivelmente com o clorofrmio,
que conforme j foi descrito no incio desta seco, interage muito bem com superfcies
hidrofbicas.
Obs.: No foram encontrados artigos na literatura que abordassem multicamadas
lipdicas in-situ, imobilizadas em substratos hidrofbicos.
A imagem apresentada a seguir na Figura 56 de outra amostra feita nas
mesmas condies das utilizadas nas Figuras 52 e 54. Ela foi realizada em ambiente ex-
situ na temperatura de 20C.

57
4.0m

Figura 56: esquerda; Imagem topogrfica ex-situ realizada em outra amostra, nas mesmas condies
das amostras utilizadas nas Figuras 52 e 54, porm na temperatura de 20C. As alturas medidas so da
ordem de 50 nm. direita; a mesma imagem em trs dimenses, oferece uma melhor visualizao da
organizao das multicamadas suportadas.

Observando as Figuras 52, 54 e 56, nota-se que todas elas apresentam
praticamente as mesmas alturas e o padro de feijes, embora a estrutura morfolgica
apresente diferenas entre as imagens. Como nenhuma delas passou pelo processo de
hidratao, possvel que a razo das mudanas morfolgicas esteja associada ao tipo
de solvente, visto que durante a realizao de diversas imagens em vrias amostras
formadas pelo solvente clorofrmio, observou-se variadas estruturas lipdicas embora as
alturas praticamente mantinham-se constantes.

4.4.3.2 100 l DE SOLUO PIPETADA

A seguir, Na Figura 57, ser apresentada uma imagem de outra amostra feita
com a mesma soluo lipdica da amostra da Figura 56, s que com o despejo de 100
L de soluo sobre o substrato em vez do volume de 20 L utilizado no despejo das
solues em todas as amostras apresentadas anteriormente para o substrato SiH. A
imagem foi obtida em ambiente ex-situ na temperatura de 20,2C.

58
3.0m

0.0 1.5 3.0 4.5 6.0 7.5
0
20
40
60
80
100


A
l
t
u
r
a

(
n
m
)
Distncia (m)


Figura 57: Multicamadas lipdicas de DMPC imobilizados em SiH pela tcnica casting. Utilizou-se uma
pipeta de 100 L no processo de pipetamento da soluo lipdica com clorofrmio de 0,3 mg/ml sobre o
substrato. (A) Imagem topogrfica bidimensional, ex-situ em ambiente controlado por fluxo constante de
gs nitrognio, realizada na temperatura de 20C. (B) Perfil das alturas obtidas, referentes a multicamadas
e (C) imagem tridimensional oferecendo uma melhor visualizao da maior uniformidade lateral
encontrada.

Comparando as imagens das Figuras 56 e 57, verifica-se um aumento nas alturas
medidas e tambm uma maior uniformidade lateral, para a amostra observada na Figura
57. Com certeza estas mudanas devem estar associadas ao aumento da quantidade de
soluo lipdica despejada, conforme tambm ocorreu com o SiO
2
na seco 4.4.2.2.2.

A
B
C
59
4.5 DISCUSSO GERAL

Os substratos utilizados apresentaram rugosidade mdia quadrtica bastante
baixa, indicando a formao de superfcies praticamente planas. O silcio hidrofilizado
pelo mtodo da soluo piranha, apresentou alta uniformidade lateral. A anlise
topogrfica em diversas regies da superfcie da amostra revelou que o filme de xido
se auto-organizou de modo homogneo por toda rea da lmina de silcio usada como
base para o substrato.
Atravs da anlise feita a partir dos resultados e das referncias bibliogrficas,
observou-se que cada tcnica de deposio de filmes lipdicos investigada apresenta
caractersticas determinantes. A tcnica de fuso de vesculas conforme esperado,
apresentou a formao de bicamadas quando investigada em meio lquido, notando-se
que em algumas imagens obtidas observou-se uma razovel uniformidade lateral nos
filmes sustentados. A tcnica de espalhamento por spin-coating apresentou estruturas
que variam desde bi at multicamadas lipdicas. A topografia das imagens revelou que a
morfologia dos filmes no est diretamente associada quantidade de soluo gotejada
sobre o substrato. A tcnica de simples espalhamento de soluo orgnica apresentou a
esperada formao multilamelar e algumas morfologias inesperadas como os cilindros
lipdicos.
Observou-se claramente a dependncia entre o solvente utilizado na soluo
lipdica e o tipo do substrato enquanto sua propriedade hidroflica ou hidrofbica.
Confirmou-se que o isopropanol interage melhor com substratos hidroflicos
possibilitando a fcil adsoro dos lipdios diludos no solvente e a formao de filmes
homogneos. J o clorofrmio interagiu melhor com substratos hidrofbicos e os filmes
lipdicos obtidos atravs da deposio de solues lipdicas formadas por este solvente,
no mantiveram uma homogeneidade morfolgica.
As anlises dos filmes em meio in-situ apresentaram resultados bastante
interessantes. Multicamadas caracterizadas em substratos hidroflicos em ambiente ex-
situ, mudaram drasticamente sua morfologia quando imersas em meio lquido, sendo
que a anlise topogrfica revelou a formao de bicamadas. J o mesmo no ocorreu
para substratos hidrofbicos, que mantiveram a estrutura de multicamadas in-situ.
O aumento de concentrao lipdica na soluo gotejada em algumas amostras,
fez com que as alturas obtidas na anlise topogrfica aumentassem significamente,
assim como, a uniformidade lateral dos filmes.
60
Finalmente, os resultados foram bastante satisfatrios e proporcionaram uma
grande variedade de informaes morfolgica e topolgicas dos filmes depositados, que
abrem um grande campo para futuras pesquisas em diversas reas da nanobiotecnologia,
como o desenvolvimento de biosensores e frmacos, alm de incorporao de protenas
nas estruturas lipdicas que possibilitariam a investigao das propriedades dos canais
inicos.
61
CONCLUSO

Os resultados encontrados pela anlise topogrfica das imagens obtidas pelo
microscpio de fora atmica demonstram que cada tcnica de preparao dos filmes do
fosfolipdio DMPC apresenta caractersticas especiais.
A tcnica de fuso de vesculas em substrato hidroflico (mica) apresentou a
formao de bicamadas lipdicas estveis sob investigao in-situ.
As amostras preparadas por spin-coating formaram de 1 a 3 bicamadas
dependendo da regio investigada da amostra, ressaltando-se que a quantidade de
soluo gotejada sobre o substrato no resultou em um aumentou consideravelmente do
nmero de bicamadas depositadas, mantendo-se a mesma rotao da amostra durante o
mesmo intervalo de tempo. As superfcies das amostras hidratadas em vapor de gua
apresentaram uma mudana morfolgica bastante significativa em relao as superfcies
observadas para estas amostras como depositadas, sem que ocorresse alteraes no
nmeros de bicamadas formadas. Na temperatura de aproximadamente 25C pde-se
observar claramente a coexistncia das fases lquida cristalina e gel do DMPC.
A automontagem por evaporao de solvente levou a formao de multicamadas
nos trs tipos de substratos utilizados (mica, SiO
2
e Si-H). Observou-se que a
uniformidade no espalhamento das camadas lipdicas sobre o substrato depende do
tipo de solvente e das propriedades da interface lipdio/substrato formada e da
quantidade de soluo lipdica gotejada. Semelhantemente ao constatado para a tcnica
de centrifugao, o processo de hidratao promoveu a reorganizao morfolgica dos
filmes lipdicos. Destacando-se que na situao de imerso total em soluo fisiolgica
de tampo HEPES, detectou-se a permanncia de apenas uma bicamadas na superfcies
de substratos hidroflico. Porm, esta reduo no nmero de bicamadas no ocorreu para
o substrato de silcio hidrofbico. Um resultado muito interessante e que
necessariamente ser investigado no futuro, foi a formao de estruturas lipdicas
cilndricas multilamelares, observadas para solvente clorofrmio e silcio hidroflico
(SiO
2
).





62
DIAGRAMA 1: TCNICA DE DEPOSIO X SUBSTRATO



DIAGRAMA 2: AMBIENTE DA VARREDURA X SUBSTRATO


63
PERSPECTIVAS

A caracterizao dos filmes lipdicos realizada neste trabalho, forneceu uma
quantidade de informaes que subsidiariam o desenvolvimento de novos projetos.
Dentre as diferentes possibilidades discutidas ao longo da realizao desta dissertao
de mestrado, poderiam ser citadas as seguintes linhas de pesquisa:
1) estudo da formao de filmes lipdicos com mais de um fosfolipdio para melhorar o
modelo de membranas biolgicas;
2) imobilizar protenas nas membranas para simular o papel dos canais inicos;
3) insero de frmacos para o desenvolvimento de medicamentos;
4) descrever o processo de formao das estruturas lipdicas cilndricas visualizadas nas
amostras preparadas por casting com clorofrmio em silcio hidroflico,
5) desenvolver biossensores.

64
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