Extraccin de ADN

La extraccin consiste en la separacion de cualquier otro compuesto La extraccin de adn en bacterias gram negativas, positivas , plantas y animales sigue 3 pasoso basicos: o o o Lisis celular Eliminacin de Proteinas Precipitacin y limpieza del ADN.

Extracin de ADN en bacterias Gram negativas:

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Obtener un cultivo nuevo de bacterias. En un microtubo de 1.5 ml. agregar sulfato de magnesio 10mM y resuspender en el una asada de bacterias. Centrifugar a 4500 rom por 3 minutos y eliminar sobrenadante con la ayuda de papel secante. Resuspender en 300uL de buffer Tris HCl 0,1 M pH 8 4. Adicionar 40 l de lisozima (20 mg/ml) y 5l de ARNasa (7000 U/ml). Incubar a 37 C por 5 min., posteriormente a -20C durante 10 min. Y finalmente a 85 C durante 10 min. Entre cada incubacion, mezclar vigorosamente. Agregar 20 l de proteinasa K (20 mg/ml). Incubar a 70C durante 10 min., durante la incubacion invertir manualmente 5-10 veces. Centrifugar a 8 000 xg durante 1 min. Recuperar el sobrenadante (aprox. 250 l ), sin tocar el boton y transferir a un tubo nuevo. Adicionar 150 l de isopropanol absoluto frio (a -20 C). Incubar a -20o C durante 30 min. Centrifugar a 10 000 xg durante 3 min. Eliminar perfectamente el sobrenadante. Limpiar el boton con 300 l de etanol al 70% agitando brevemente en vortex. Centrifugar a 10 000 xg por 3 min. Eliminar perfectamente el sobrenadante. Secar perfectamente el boton a 65 C por 5 min. y resuspender en 50 a 00l de agua pura, desionizada y esteril.

Extraccin de ADN en plantas:

1. En un mortero moler alrededor de 1 g de tejido con nitrogeno liquido hasta obtener un polvo fino. 2. Agregar 1 ml de buffer CTAB 2X y seguir moliendo. Recuperar en un microtubo de 1.5 ml. 3. Centrifugar a 8 000 xg durante 8 min. a 4C. 4. Eliminar el sobrenadante y resuspender con 600 l de CTAB 2X.

5. Incubar a 60oC durante 10 min. 6. Agregar 600 l de cloroformo:octanol 24:1, agitar hasta homogeneizar. 7. Centrifugar a 5 000 xg durante 12 min. a 4C (o hasta que le sobrenadante quede transparente). 8. Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo, cuidando de no tomar la interfase. 9. Agregar 2/3 del volumen final de isopropanol frio para precipitar el ADN. 10. Dejar reposar durante la noche a -20C. 11. Centrifugar a 8000 xg durante 5 min a 4C. Eliminar perfectamente el sobrenadante. 12. Limpiar el ADN agregando 1 ml de etanol 70% frio y centrifugar a 7 000 xg durante 5 min. 13. Eliminar el sobrenadante y resuspender con 100 l de buffer TE.

Reactivos: 1) Buffer de extraccion CTAB 2X Tris-HCl 100 mM pH8 NaCl 1.4 M EDTA 20 mM pH8 CTAB 2% b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar el buffer) 2) Buffer de extraccion CTAB Tris-HCl 100 mM pH8 NaCl 1.5 M EDTA 20 mM pH8 CTAB 4% PVP40 4% Ac. ascorbico 0.1% DIECA 0.1% b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar el buffer) 3) Buffer de extraccion STE Tris-HCl 100 mM pH8 EDTA 50 mM pH8 NaCl 100mM b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar el buffer)

Extraccin de ADN en animales:

Una vez colectado el material es necesario agregarle una solucin que estabilice al ARN lo antes posible, ya que los cambios en el patrn de expresin de los genes debido a la degradacin del ARN o a inducciones en la transcripcin ocurren inmediatamente. Primero se hace una lisi para liberar ADN dentro de la celula utilizando buffer que contienen detergente (SDS) 1% , EDTA (molecula quelante) que se unen a cationes metalicos que podrian desestabilizar la membrana celular e inhibir ADNasas ; sales que forman capas y recubren ADN protegiendolo de degradacin y Tris-HCl pH 7.5 8.2 para mantener pH de solucion estable y proteinasa para degradar proteinas o enzimas. Se incuba la muestra entre 50-70 en agitacion para facilitar ruptura de lipidos y permitir liberacion de ADN . Luego se hacen 2 extracciones . 1ro. con fenoles para eliminar proteinas (igual volumen que la muestra); se mezcla y centrifuga 10000rpm 2do. El sobrenadante de la segunda extraccion se utiliza cloroformo para limpiar cualuqier residuo lipidico. (igual volumen que la muestra); se mezcla y centrifuga 10000rpm. Des pues se precipita ADN con etanol absoluto y Acetato de sodio ; el etanol es usado para remover la concentracion de sales residuales y promoveer precipitacion del acido nucleico. Extraccin de hongos:

Se utilizan micelios obtenidos del crecimiento de esporas y son colocados en bao mara con agitacin a 27C de 24-48 horas. Luego el contenido de cada tubo de ensayo se coloco en tubos Eppendorf y se centrifug 5 minutos a 10000 rpm, para separar micelios del medio. Luego micelios obtenidos son lavados para eliminar restos del medio con agua destilada. A partir de los micelios se procede a realizar la extraccin. 1. de 100 a 200 mg de tejido seco se incubaron por 1 hora a 60C en 1000 uL de buffer de extraccin (NaCl 0.7M , 0.1M buffer Tris PH 7.5 ; 0.001M EDTA pH 8 ; Me 1% y CTAB 1%) 2. Luego se le adiciona al muestra acetato de sodio (200uL) 3M y se coloc a 20 C durante 20 minutos para ser centrifugado despus durante 10 minutos a 10000 rpm . 3. Para precipitar ADN se tomo 750 uL de sobrenadante y se le adiciona 2uL ARNasa A+ 8 uL de su buffer y se deja a 37C por 30 minutos y luego se coloca a -20 C durante 5 minutos; se le agrega 750 uL de isopropanol para la precipitacin del ADN y luego se centrifuga por 20 minutos a 14000 rpm y el precipitado se lava con etanol (70%) 4. Se deja secar a temperatura ambiente y se le agrega buffer TE 1X y se guarda solucin de ADN a 20 C. 5. Luego se somete a la muestra a la digestin de la enzima ECoR I ; se lleva a incubacin durante toda la noche y por ultimo 10 minutos a 65 C.