UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION LICENCIATURA EN BIOLOGIA FISIOLOGIA ANIMAL PRACTICA: POTENCIALES DE ACCION

EN LOMBRIZ DE TIERRA En esta prctica de laboratorio usted deber obtener el registro de los potenciales de accin de una lombriz de tierra anestesiada. Deber apreciar lo que se entiende por potencial de accin; la ley del todo o nada; periodo refractario y velocidad de conduccin por el nervio. Objetivos: Al finalizar el laboratorio usted deber ser capaz de: Describir la respuesta del Todo o Nada en un nervio Determinar la velocidad de conduccin por el nervio Explicar las diferencias entre periodo refractario absoluto y relativo de un nervio y demostrar el significado fisiolgico de estos periodos. Entender la naturaleza bidireccional del potencial de accin en un nervio Materiales requeridos: Asegrese de tener un equipo PowerLab accesorios para esta prctica: 1.- Conecte el equipo a la fuente de poder 2.- Conecte el estimulador y las conexiones para grabar al Powerlab. El cable del estimulador debe conectarse al switch anlogo Output y el Cable Bio Amp al switch Bio Amp 3.- Asegure el cable negro de la grabadora al switch Channel 1 en la entrada positiva Bio Amp . Conecte el cable blanco al cannel 1 negativo. Por otro lado debe tener listo los siguientes materiales biolgicos: Una lombriz de tierra o varias de al menos 6 cms de largas; Una capa de petri pequea; Solucin Ringer: Etanol 15% en solucin NaCl 0.25%; papel toalla en tiras, Placa o tablita de corcho, 3 agujas o alfileres entomolgicos, 3 cable de plata o clorurados, modelo de hilo o nylon, Una jeringa plstica de I mL; una regla en mm. PROCEDIMIENTO 1.- Preparacin de la Lombriz de TierraADInstrumnets 15T, con sus

Anestesia de la Lombriz: Coloque en una caja de petri , que tenga suficiente cantidad de Solucin Ringer, para cubrir una lombriz; lave la lombriz con solucin Ringer hasta que esta pare de moverse +/- 5 min. Asegrese de que esta lo suficientemente anestesiada, para proceder a hacerse una diseccin. Si la lombriz no reacciona al tacto, est lista para proceder de lo contrario vuelva a hacer lavados con solucin Ringer. Coloque la lombriz anestesiada en forma recta, en una tablita de corcho, a unos 5 cms del borde. (Nota: debe cuidar de no estropear o aplastarla por que se deteriora la preparacin, se maltratan las fibras nerviosas); use alfileres para fijar la lombriz a su tablita, esto es, uno en el extremo anterior y otro al extremo caudal, coloque otro alfiler a unos 15 mm del extremo anterior .La parte anterior es la mas corta, al clitelo, un segmento liso no segmentado, mas claro, donde se encuentran los orificios genitales. Aplique unas gotas de solucin anestesiante a lo largo de todo el animal con una jeringa o pipeta pasteur, seque el exceso de solucin con tiras de papel toalla, para evitar errores en la grabacin de los estmulos. Conexin de los electrodos: Una los electrodos estimulantes a la cabeza de los dos alfiles anteriores. El polo negativo (ctodo) deber estar posterior al cable positivo (nodo). Coloque los tres cables de plata sobre el cuerpo del animal, con el extremo negruzco en contacto con el cuerpo. Conecte los cables con extremo de mandbula de caimn. Fije los extremos en posicin usando el modelo suministrado o de cualquier material. ( El polo a tierra, deber ser el mas cercano al alfiler de estmulo, pero el lugar exacto no es crtico; el polo negativo(blanco o R1) en la parte anterior y el polo positivo en el extremo posterior(negro o R2), separados 10 mm.. ASEGURESE DE QUE UN CABLE NO TOQUE A NINGUN OTRO. SEA CUIDADOSO PARA EVITAR DAOS EN LA LOMBRIZ. Los cables se pueden manipular fcilmente, para cambiarlos de posicin si es que se requiere. 1.-POTENCIAL DE ACCION EVOCADO.Verifique que la lombriz no se seque o se mueva y si ocurre utilice unas gotas de anestsico, pero se debe remover el exceso. 1.1- Estmulo artificial.-Debe establecer en el panel de control del estimulador un voltaje de 0.2 V. de inicio, despus de 2 ms, el Labtutor deber estimular al nervio y registrar por un tiempo de 25 ms. Con este voltaje, usted ver un estmulo artificial. Este es causado por la propagacin del voltaje a los electrodos. Se debe recobrar rpidamente el estado inicial, despus de unos milisegundos. No se vera una respuesta de la lombriz a este voltaje bajo.

1.2.- Incremente el voltaje de estimulo a 2.0 V (Respuesta evocada).

e inicie el registro

En este voltaje, deber apreciarse la respuesta del nervio, mediante un axn gigante. Si no ve respuesta alguna, incremente el voltaje a 3.0 V y si no se produce respuesta, indague a su instructor.

1.3.-Encuentro del Voltaje adecuado.- una vez haya encontrado el estmulo adecuado que produce respuesta. Reinicie un nuevo estmulo. Si se obtiene respuesta, disminuya el voltaje aplicado a la mitad y vuelva a empezar. Si n o hay respuesta, incremente el voltaje de estmulo en 0.05 V, de inicio hasta que vea respuesta. 1.4.- El voltaje al cual responde la preparacin se conoce como Voltaje de respuesta adecuado. Se puede confirmar este disminuyendo el estmulo del voltaje en 0.05 V, as se puede determinar cual es el potencial de accin (voltaje) que provoca respuesta. Finalmente, debe colocar este voltaje al cual obtuvo respuesta en una tabla. Igualmente debe encontrar el estmulo que provoca una respuesta evocada en forma intermitente. Esto es normal. Pero se define El Voltaje Adecuado, como la fuerza del estmulo que provoca una respuesta en el 50% del tiempo. Anlisis de los potenciales de accin en la lombriz de tierra: Para esto debe seleccionar la escala grfica que mejor muestre los resultados con el voltaje adecuado. Coloque una marca, donde inicia el estmulo; mueva el cursor hasta donde empiece la respuesta al estmulo y de click para transferir la diferencia de tiempo y el valor obtenido. Coloque el valor obtenido en el sitio correspondiente de la tabla. Con los datos obtenidos se puede utilizar el programa excell, par proyectar y obtener respuestas del tiempo, de la intensidad del estmulo aplicado (voltaje mnimo, mximo)y las respuestas presentadas. 2.-Estmulo de axones laterales: Es el procedimiento en el cual al irse incrementando la amplitud del estmulo, con el fin de producir respuestas de fibras nerviosas de mayor tamao: medianas y laterales. Para ello: Coloque el estimulador, con un voltaje inferior al que provoc la respuesta del voltaje adecuado(ejercicio 1), determinado en el ejercicio anterior. De click en comenzar. Despus de 2 ms, el Labtuto deber estimular el nervio y producir un registro grfico, durante 25 ms. Incremente la amplitud del estmulo en 0.05 V, de click cada vez y registre hasta que obtenga una segunda respuesta , latencia. Registre la amplitud de estmulo, que lo produjo en una Tabla, junto con los otros voltajes que provocaron la latencia y la respuesta adecuada. No se sorprenda si el Voltaje adecuado a

cambiado un poco; esto puede deberse a la sequedad o cuando se aplica ms fluidos. Finalmente, vaya variando el voltaje aplicado cada 0.05 V y registre las curvas obtenidas, hasta obtener el voltaje que produce la Latencia. Guarde este voltaje en la tabla, para su anlisis. En algunas lombrices, usted no ser capaz de separar las respuestas de las fibras nerviosas medianas y laterales, esto es, parecen tener la misma respuesta al voltaje. Esto es una variacin fisiolgica normal. As, como otras lombrices, no respondern hasta obtener una Latencia, debido a que las fibras nerviosas medianas y laterales pueden estar daadas. Analice en la mejor grfica registrada, el voltaje, el tiempo de respuesta que provoco el estmulo aplicado, como se registr anteriormente.

3.-Velocidad de conduccin.En este ejercicio el, potencial de accin se registrara en dos diferentes sitios a lo largo de la lombriz, con el fin de determinar la velocidad de conduccin del impulso nervioso. 3.1.- sitio proximal- con el panel de estimulacin, situado en los voltajes que provocaron la respuesta Voltaje adecuado, determinado en el ejercicio anterior. Este deber asegurar que ambos tipos de fibras sean estimuladas realmente. Se click de inicio, si es necesario incremente la amplitud del estmulo, y haga clik de inicio, cada vez que cambie de voltaje., hasta que ambas fibras produzcan una respuesta. Aada un comentario a la grfica de registro, ej: distancia 1: la que usted debera analizar. Utilice una reglilla para determinar la distancia de ubicacin del ctodo(polo -) hasta el electrodo mas cercano R1. Registre la Distancia 1, en la Tabla. 3.2- Sitio Distal- Cuidadosamente cambie los dos electrodos de estimulacin hacia la cola de la lombriz, manteniendo una distancia de 5 a 10 mm de separacin (Ideal separarlo 30 mm). De click de inicio, Si es necesario incremente la amplitud del estmulo. De inicio cada vez, hasta alcanzar que las fibras nerviosas mediana y lateral respondan. Aada un comentario al registro grfica: Distancia 2, para su posterior anlisis. Utilice una reglilla, para medir la distancia de separacin de los electrodos. Registre los datos Distancia 2, en la Tabla. Anlisis de la conduccin de la velocidad.Utilice el registro grfico: Distancia 1. Ubique el marcador donde se inicia el estmulo. Mueva el cursor hasta donde se inicia la respuesta de la fibra mediana y de click, para transferir la Diferencia de tiempo . Coloque los valores apropiados en la Tabla de datos de velocidad de conduccin. Por otro lado, mueva el cursor al comienzo de la respuesta de la fibra nerviosa gigante

y de click, para transferir la diferencia de tiempo , al a tabla de valores para su anlisis. Seleccione el Registro Distancia 2, y repita el procedimiento anterior. Clculos: El Estmulo aplicado (artificial) se produce en el momento que se presente el estmulo. La Demora de respuesta del nervio, ante el estmulo aplicado, corresponde al tiempo, que gasta el potencial de accin para viajar del polo negativo al otro polo, donde se registra la informacin. La formula bsica de clculo de la velocidad es: Velocidad de conduccin= Distancia/tiempo Distancia = mm; (metros/segundo) tiempo= ms ; velocidad mm.ms-1 = m.s-1

Para calcular la velocidad de conduccin por el mtodo absoluto de una distancia y si esta corresponde a un periodo de latencia se usa: Velocidad de conduccin= D1/LP1 (o D2/LP2) Para calcular la velocidad de conduccin por el mtodo de la diferencia, se utiliza: Velocidad de conduccin= (D2-D1)/(LP2-LP1) Una vez, que usted ha completado los datos de la Tabla de velocidad de conduccin, Labtutor, utiliza estos datos, para calcular la velocidad de conduccin por estos dos mtodos. As, los resultados, pueden ser presentados. 4.- Periodo Refractario.En esta parte, usted deber aplicar dos estmulos al nervio, se va disminuyendo progresivamente el intervalo de estmulo: Procedimiento.- 1-Coloque el panel de estimulacin, en la mitad del voltaje determinado, para estimularlas fibras nerviosas medianas (parte 1) y las fibras grandes (parte 2). Debe cerciorarse, que slo se estimulen las fibras medianas. 2-Luego, seleccione el intervalo de estmulo hasta 10 ms; 3-De click d inicio. El equipo deber estimular el nervio dos veces en el intervalo seleccionado y registrar por 25ms. Usted deber ver dos tipos de grficas de respuesta a estmulos. 4- Repita el paso 3, pero en esta vez, disminuya el tiempo de estmulo a 1 ms. Anlisis del Periodo refractario.- Con sus datos disponibles. Note que un potencial de accin se genera muy rpido, antes de que el anterior se haya completado. El intervalo de tiempo ms grande, al cual un segundo pico no puede ser producido, es el periodo refractario. Entre este valor en la tabla.

La frecuencia mxima terica, a la cual el IN, puede ser generado por las fibras nerviosas medianas, se puede calcular usando la ecuacin. Frecuencia (Hz)= 1000/periodo refractario (ms) El registro grafico del equipo, muestra los clculos que ha utilizado en este experimento 5. Biodireccin.Conexiones.Desconecte el electrodo del ctodo y remueva el alfiler de la lombriz. La reposicin esta en la cola. Mueva el electrodo nodo al alfiler de la cola, conctelo. Una el ctodo al otro alfiler. Rehaga las conexiones, para que el estmulo se produzca al final de la cola. Procedimiento.Coloque el estimulador, con un voltaje bajo, similar al utilizado para producir el estmulo de la fibra nerviosa mediana. De click de inicio. De incrementos de voltaje de 0.05 V cada vez. De click, en cada cambio de voltaje. Note en que voltaje, percibe una respuesta del nervio mediano y de forma sucesiva( con incremento del estmulo) verifique en cual responde la fibra nerviosa grande. AnlisisResponda las preguntas que le hace el equipo. Examine sus datos. Se mostraba un potencial inicial? Si es el caso, describa el mecanismo de respuesta a sus resultados. REPORTES. 1.- Presente los resultados de Potenciales de accin evocados, la ley del todo o Nada, en los rangos mas adecuados para poder interpretarlos