Ankara niversitesi Eczaclk Fakltesi Yayn No: 84

TOKSKOLOJ

LABORATUVAR KTABI

Prof. Dr. Nevin VURAL

Farmastik Toksikoloji Anabilim Dal

Ankara 2000

Ankara niversitesi Eczaclk Fakltesi Yayn No: 84

TOKSKOLOJ

LABORATUVAR KTABI

Prof. Dr. Nevin VURAL

Farmastik Toksikoloji Anabilim Dal

Ankara 2000

ISBN

975-482-512 2

Ankara niversitesi Basmevi - 2000

NSZ

Mesleki veya eitli nedenlerle oluan akut veya kronik zehirlenmelerin toksikolojik analizlerini ieren bu kitap, ilk kez 1975 ylnda yazlm olan "Toksikoloji Laboratuvar Kitab"nn yeniden dzenlenmesi ve daha gelimi yntemlerin ilavesiyle hazrlanmtr. Kitap Eczaclk Fakltesinde okutulan "Toksikoloji Pratik" derslerine ynelik hazrlanmakla beraber, aklanan yntemler adli tp, ii sal ve zehirlenme danma merkezleri gibi kurumlarn toksikoloji laboratuvarlarnda da uygulanabilecek niteliktedir. Ad geen kurumlar iin yardmc olacan mit ederim. ki blmden oluan kitapta 1. blmde toksikoloji uygulamas ve toksikolojik analiz prensipleri hakknda genel bilgilere; 2. blmde ise sk zehirlenmelere neden olabilen kimyasal maddelerin analizleri (monograf

eklinde) aklanmtr. Yntemlerin bir ksm rutin laboratuvar imkanlar ile yaplabilecek dzeydedir. Bir ksm da Anabilim Dalmzda eitli tez ve proje almalarnda uygulanabilirlii gsterilen yntemlerdir. Kitabn hazrlanmasnda byk emekleri geen Anabilim Dalmz

sekreteri Nurcan Blkba, Polis Akademisi hocalarndan Mustafa Dnmez ve ei Somay Dnmez, Farmastik Toksikoloji Anabilim Dal aratrma

grevlileri Ahmet Ouz Ada ve lker Ate'e teekkr bir bor bilirim.

Prof. Dr. Nevin

VURAL

Temmuz 2000

NDEKLER
1. BLM TOKSKOLOJK ARATIRMALARDA KULLANILAN YNTEM ve TEKNKLER 1. ANALTK YNTEMLERN TOKSKOLOJK ARATIRMALARDA UYGULANMASI 2. SSTEMATK TOKSKOLOJK ANALZ 2.1. Numune seimi ve alnmas 2.2. Postmortem toksikolojik analiz iin alnacak biyolojik rnekler 2.3. Numunenin korunmas ve laboratuvara gnderilmesi 2.4. Toksikolojik analizde izlenecek yol 2.5. Toksikolojik analizi etkileyen faktrler 2.6. Analitik bulgularn deerlendirilmesi 1 6 6 8 9 11 11 14

3. ZEHRLERN BYOLOJK MATERYALDE DORUDAN ARANMASI. 16 s 3.1. n denemeler 3.2. Biyolojik materyale dorudan uygulanan testler 3.3. Baz metalik zehirlerin biyolojik materyalde dorudan aranmas Reinsh deneyi 4. ZEHRLERN BYOLOJK MATERYALDE ZOLASYON TEKNKLER 4.1. Uucu zehirlerin biyolojik materyalden distilasyonla izolasyonlar 4.2. Uucu zehirlerin mikrodifuzyon yntemi ile izolasyonlar 4.3. Uucu olmayan organik zehirlerin biyolojik materyalden izolasyonlar 4.4. Enzim yklama yntemi ile organik zehirlerin izolasyon ve aranmalar 5. ZEHRLERN TARAMA YNTEMLERNDE KULLANILAN ENSTRUMENTAL TEKNKLER 5.1. nce tabaka kromatografsi 51 51 31 37 40 46 17 18 26 26

5.2. UV ve grnr alan spektrofotometresinin toksikolojik analizlerde kullanlmas.. 59 5.3. Gaz kromatografsinin toksikolojik analizlerde kullanlmas 5.4. Yksek basnl sv kromatografsi 5.5. Atomik absorbsiyon spektrofotometresi 5.6. Ntron aktivasyon analizi 5.7. mmunoassay'n toksikolojik analizlerde kullanlmas 62 65 66 67 68

2. BLM NEML ZEHRLERN BYOLOJK MATERYALDE ANALZLER 1. UUCU ZEHRLER 1.1. Karbon monoksit 1.2. Siyanr 1.3. Metil alkol 1.4. Etil alkol 1.5. Formaldehit 1.6. Formik asit ve format 1.7. Klorlu hidrokarbonlar 1.8. Aromatik hidrokarbonlar 1.9. Fenoller 2. UUCU OLMAYAN ORGANK ZEHRLER 2.1. Barbitratlar 2.2. Benzodiazepinler 2.3. Salisilatlar 2.4. Parasetamol 2.5. Fenasetin 3. KULLANIMI KONTROL ALTINDA OLAN MADDELER (ve NARKOTKLER) 4. DOPNG MADDELER 4.1. Organik bazlar 4.2. Anobolik steroidler 5. PESTSTLER 5.1. Organik klorlu pestisitler 5.2. Organik fosforlu pestisitler 6. METALK ZEHRLER 6.1. Reinsch deneyi 6.2. Kurun Ek. I. LABARATUVARDA LK YARDM Ek.2. NEML REAKTFLERN HAZIRLANMASI NDEKS KAYNAKLAR
vi

77 79 79 93 102
107

121 123 126 130 '40 148 148 156 161 165 169

179 180

194

207 208 208

TOKSKOLOJK ARATIRMALARDA KULLANILAN YNTEM VE TEKNKLER

1
Blm

1. ANALTK Y N T E M L E R N ARATIRMALARDA

TOKSKOLOJK

UYGULANMASI

Kimyasal maddelerin (zehirlerin) kaynaklar, fiziksel, kimyasal ve biyolojik zellikleri, toksik canl organizmada urad deimeler tedavileri, ve etki

mekanizmalar,

dozlar,

zehirlenmelerin

zehirlerin

izolasyonu, nitel ve nicel analizleri, gvenli kullanmlar iin risk analizleri ve standardizasyonlarnn yaplmas bugnk modern toksikolojinin ura analitik itibaren

alandr. Uygulamal bir bilim olan toksikolojinin tarihi geliiminde yntemlerin yeri tartmaszdr. zellikle 1960'l yllardan

enstrumental tekniklerin toksikolojiye girmesi ile ok duyarl ve spesifik analizlerin yaplabilmesi, molekler dzeyde aratrmalara inilebilmesi

toksikoloji alannda byk r amtr. Modern toksikolojinin tarihinde analitik toksikoloji ve forensik (adli)

toksikoloji ilk gelien dallardr. Analitik toksikolojinin ierii ve uygulamalar bilinmeksizin forensik toksikolojiyi incelemek mmkn olamaz. Analitik maddelerin toksikoloji, canl organizmaya zarar veren kimyasal

doku ve vcut

svlarndan

izolasyonlar,

identifkasyonlar,

kalitatif (nitel) ve kantitatif (nicel) analizleri iin gerekli yntemleri aratrr, gelitirir. Genel olarak analizin yapld biyolojik ortam kompleks yapl ve aranacak madde, miktar ok dk olduu iin, kullanlan mikro yntemlerin

duyarl, gvenilir ve tekrarlanabilir olmas gerekir. Bunun iin de "analitik toksikologun" analitik kimyann yntemlerini ve tekniklerini ok iyi bilmesi ve kullanmas gerekir. Dier taraftan analizi yaplacak madde ounlukla, bir ksenobiyotik, organizmada metabolik olaylar sonucunda deiime uramtr. Bu nedenle vcut sv ve dokularnda kimyasal madde yannda

metabolitlerinin de aratrlmas gerekir. Gerek biyolojik ortamn yaps ve gerekse aranacak ksenobiyotik ve metabolitlerin analizi analitik toksikoloun zecei problemleri oluturur. Forensik toksikoloji, " toksikolojinin yasal amalarla kullanm" olarak tanmlanr. Her ne kadar bu geni tanm, dzenleyici (reglatory) toksikoloji. ila suistimali ve bamllnn biyolojik materyalde identifkasyonu gibi alanlar kapsamakta ise de : tarihi geliimi iinde forensik toksikolojinin uygulamas daha ok kriminal olaylarda grlen lm, yaralanma, fizyolojik ve davran bozukluuna neden olabilecek kimyasal maddelerin nitel ve nicel analizleri ile sonularnn yorumu alannda uygulanr. Bu nedenle analitik toksikoloji ve forensik toksikoloji tarihi geliimleri iinde birbirinden

yararlanan toksikoloji dallardr. Dier uygulanmas" taraftan forensik toksikoloji, "pozitif bilimlerin hukuka

olarak tanmlanan forensik (adli) bilimlerin de nemli bir

daldr. Geni anlamda adli bilimler, adli tp, adli toksikoloji, adli odontoloji. adli antropoloji, adli psikoloji, adli kimya ve kriminalistik dallarn kapsar. Adli bilimler gemite olan bir olay bilimsel yntemlerle yeniden

canlandrarak hukuk ve yasalar asndan deerlendirilmesine yardmc olur. Genellikle bu olay bir suun ilenmesi ile ilgilidir; suun ilendii olay yerinin incelenmesi, gerekli delillerin toplanmas ve bu delillerin analizleri ile sulu kiiyi belirlemek adli bilimlerin konusudur.

Adli toksikoloji , adli bilimler tarihinde adli tptan sonra gelien ikinci daldr. Modern toksikolojinin kurucusu olarak bilinen Mathiev J.B. Orfla (1783-1853) ilk kez adli olaylarda bilimsel delilin gerekliliini toksikolojik adan gstermitir. XIX. Yzyla kadar doktorlar, hakimler ve dier hukuk grevlileri (savc, avukat gibi) zehirlenmenin semptom ve iaretleri hakknda son derece yanl nosyona sahiptiler. O zamanlar eer ceset siyah, mavi veya yer yer lekeli ise veya kt

kokuyorsa kurbann zehirlenme sonucu ldne inanlrd. Arsenikle len kiilerin kalbinin veya vcutlarnn atele tahrip edilemeyecei gibi yanl dnceler vard. Eer zehirleyici kii sust yakalanamazsa kurbann

zehirlenmeden ldn gsterebilecek herhangi bir yol (delil) yoktu. te ilk kez Orfla 1814'de zehirlerin kimyasal ve fiziksel yapsnn incelenmesine sistematik bir yaklam getirmitir. Toksikolojinin babas

olarak bilinen Orfla'nn rol o zamanlarda olan mehur ldrme olaylarnda "ekspert tanklk" yapmasdr. rnein o yllarda "zehirleyici" olarak isim yapan Marie Lafarge'nin mahkemesinde, arsenik (As) pheli lm olaylarnda, len kiinin zehirlenmesinden Marsh testini

i organlarnda,

kullanarak, lm nedeninin zehirlenme (As ile) ile olduu bilimsel olarak gstermitir. Adli toksikolojinin geliimi kimyasal maddelerin analizi ile ilgili analitik yntemlerin bulunmas ve gelitirilmesi ile beraber olmutur.

rnein, ilk kez ngiliz kimyager James M. Marsh 1836'da dokularda arsenik tayini iin gvenilir bir yntem gelitirmitir. (Marsh testi). Arkadan, arsenik, antimon, bizmut ve cva gibi metalik zehirlerin ayrlmas ve analizi iin kombine bir yntem olan Reinsch testi (1841); zehirlerin genel olarak taranmasnda Fresenius (1845) ve von Babo (1847) tarafndan gelitirilen yntemler; alkaloidlerin ekstraksiyonu ve ayrlmasnda kullanlan ve halen tm uucu olmayan zehirlere uygulanan Stas-Otto yntemi (1851) ve fosfor
3

identifkasyonunda

kullanlan

Mitscherlich

deneyi

(1855)

gibi

(bilim

adamlarnn isminin verildii) yntemler saylabilir. Zehirlenmelerin neden olduu lm olaylarnda postmortem toksikolojik analiz, alkol ve ilalarn neden olduu trafik su kazalarnn aratrlmas, madde bamllnn neden olduu advers etkilerinin toksikolojik analizleri forensik toksikolojinin

uygulama alandr. Bir kimyasal maddenin biyolojik sistemlerde analitik yntemlerle aratrlmas ve sonucun pozitif bir delil olarak kullanlmasnn adli bilimler iinde nemli bir yeri vardr. Toksikolojinin dier bir uygulama alan teraptik ila izlenmesidir, (therapeutic drug monitoring). Genellikle bir ilaca verilen teraptik cevap ilacn uygulanan dozundan ok kandaki konsantrasyonu ile ilikilidir.Bir ilacn belirli zaman aralklarnda plazma konsantrasyonunun izlenmesi,

ortalama plazma dzeyinden sapmay gsterir ve buna gre doz artrlr veya azaltlr. zellikle teraptik indeksi kk ve yan etkileri asndan nemli olan ilalarn (fenitoin, lityum, prokainamid, teoflin, amitriptilin, digoksin. valproik asit gibi) teraptik izlenmeleri gereklidir. Bu ilalarn kan serumu dzeylerinin kantitatif analizlerinde kesinlik ok nemlidir. Bu nedenle de kullanlan metodolojinin zellikle seici olmas gerekmektedir. rnein

kantitatif tayinde o ilacn hem kendisinin hem de metabolitinin birlikte llmesi teraptik ama asndan ideal deildir. Analizi yaplan ilacn zelliine gre deiik yntemler (kromatografi, immuno assay gibi)

seilmelidir. Bylece teraptik ila izlemesi, temelde analitik toksikolojiye dayanmaktadr. Endstriyel toksikoloji ve regulatory (dzenleyici) toksikoloji

uygulamalarnda kimyasal maddelerin analizleri, maruziyetin biyolojik ve evresel kimyasal izlenmelerinde maddeye analitik yntemlere belirli ihtiya vardr. gre ise Endstride analizi ve

maruziyetin izleme",

standartlara

yorumlanmas

"evresel

kiisel
4

maruziyetin

biyolojik

parametrelere gre biyolojik svlarda analizi ise "biyolojik izleme" olarak ifade edilir. rnein aromatik bir hidrokarbon olan toluenin iyeri ortamnda TLV-TWA olarak tayini, evresel izleme, maruz kalan kiilerin kanlarnda

toluen , idrarlarnda metabolitleri olan hippurik asit ve o-krezol tayini "biyolojik izlemeye" rnektir. Bu analizler duyarl ve gvenilir (standard) analitik yntemlerle gerekletirilir. ortamnda iyi endstriyel hijyenik koullarn salanmas iin iilerin maruz kald zararl miktarda, tehlikeli maddelerin idendifye etmek amac ile evresel izlenmeleri yaplr. Ancak evresel izleme yannda maruz kalnan internal dozun incelenmesi (biyolojik izleme) maruziyetin daha iyi bir

gstergesi olarak kabul edilir. Bu amala da maruz kalnan kimyasal madde veya karmlarnn kan, idrar, sa gibi biyolojik materyalde kendileri ve/veya netabolitlerinin kalitatif veya kantitatif analizleri yaplr. Analizde kullanlan yntemlerin her kimyasal maddeyi tanmlayacak spesifiklikte olmas gerekir. Ayrca kompleks yapdaki biyolojik materyalde ise ok dk miktarda bulunduklarndan dolay bu yntemlerin duyarlklar yksek, ve yeterli

derecede tekrarlanabilir olmaldr. Sonu olarak adli toksikologlar tarafndan toksikolojide uygulamas balatlan analitik yntemlerin eitlilii ve gelimesi devam etmektedir. Zamanmzda toksikolojinin her alannda, toksikolojik problemlerin

zlmesinde bir ok yeni analitik teknik ve cihazdan yararlanlmaktadr. Toksikolojide analitik yntemlerin uygulanmasna ynelik olan bu kitapta zehirlenmelerde ve kimyasal maddelere maruziyetin belirlenmesinde kullanlan genel analiz yntemleri ile nemli toksik maddelerin biyolojik materyalde idendifkasyonu ve tayinlerinde kullanlan yntemlere rnekler verilecektir.

2. SSTEMATK TOKSKOLOJK ANALZ

Zehirlenme

olaylarnn

identifkasyonunda

doru

numune

seimi,

numune alma ekli, numunenin saklanmas, laboratuvara gnderilmesi ve analize hazrlanmas belirli bir sistematik dzen iinde yaplr. Numuneyi alan kiinin ve analizi yapan toksikoloun kimyasal maddenin bozulmas,

metabolizmas, metabolitleri ve kontaminantlarnn neler olabilecei, analizi nasl etkileyeceini bilmesi gerekir. Zehirlenmelerde zehirlenmeye neden olan kimyasal maddenin identifikasyonu, kalitatif ve kantitatif analizinde izlenen yntem aadaki sraya gre yaplr : 2.1. Numune seimi ve alnmas Akut zehirlenmelerde, mesleki veya evresel kimyasal maddelere akut ve kronik maruz kalmann deerlendirilmesinde, ve teraptik ila ila suistimali ve lm

bamllnn

aratrlmasnda

izlenmesinde,

olaylarnda toksikolojik analiz iin "biyolojik materyal" olarak tanmlanan vucut sv ve dokularndan rnek alnr. drar ve kan genelde en ok kullanlan rneklerdir. Alnan numunelerin uygun numune kaplarna alnmas ve etiketlenmesi gerekir. Etiketle numunenin kime ait olduu, numune cinsi ve numunenin alnd tarih ve saat yazlr. drar : Toksikolojik analizlerde bir ok kimyasal maddeler ve

metabolitlerinin taranmasnda tercih edilen bir svdr. En nemli stnl; ila ve kimyasal maddelerin idrardaki konsantrasyonunun kana gre daha yksek (100 kere daha fazla olabilir) olmas ve proteinlere bal olmadan atlmasdr. Ancak baz ilalar idrarla sadece metabolitleri eklinde atlr ve ana madde bulunmaz. rnein
6

p 9 -tetrahidrokannabinol

ve

birok

benzodiazepinler kendisinin dier

metabolitleri bir vcut

aklinde svs

atlr.

Byle veya

durumlarda

ilacn

(kan)

dokusunda

aranarak

identifkasyonu yaplmaldr (Moffat, A.C. ve ark. 1986). Genel olarak 100 ml idrar rnei yeterlidir. Kural olarak hibir koruyucu konulmamaldr. Bilinci olmayan hastalardan idrar kataterize edilerek alnr.Bu durumda idrar rneinin kateter svs (ou kez lidocaine gibi bir lokal anestetik ierir) ile kontamine olabilecei gz nnde bulundurulmaldr. lm olaylarnda alnabildii kadar idrar rnei toplanmaldr. drar kesesinin bo grld durumda idrar kesesinden "temas" yolu ile rnek alnr. Bo idrar kesesinde bulunabilecek glukoz veya aseton mikro yntemle tayin edilir. Bu analiz zellikle diabet durumunun belirlenmesinde yararldr. nk postmortem kanda glukoz tayini bu adan bir nem tamaz. Kan : lalarn tanmlanmasnda ve kantitatif analizinde en uygun rnektir. Akut zehirlenmelerde, hastaneye getirilen hastadan 2-3 ekilde kan rnei alnr : 10 ml. Heparinize edilmi kan rnei (CO ve birok ila

zehirlenmesinin tehisi iin); %1 NaF ieren 2 ml. kan rnei (alkol tayini iin) ve hibir koruyucu veya antikoagulan iermeyen 10 ml kan rnekleri ayr ayr tplere alnr. Kan alnrken, alkol veya heparin ieren fenoll koruyucular ieren dezenfektan "swab"ler kullanlmamaldr. Postmortem kan rnei en az 2 tane alnr. lmden hemen sonra kalp kan alnabilir, fakat perifer kan (femoral ven) tercih edilmelidir. Vcut boluuna szan kan hibir zaman alnmamaldr. nk dier vcut svlar, mide ierii ile kontamine olabilir. Rutin analizlerde 20-30 ml kan yeterlidir. CO, siyanr, alkoller, dier depresanlar, trankilizan gibi birok ila ve toksik maddeler iin koruyucu konmaz. Alkol analizi iin en az % 1 orannda NaF ieren 10-20 ml kan rnei ayrca alnr. Sodyum florr, prezervatif olarak
7

kullanlr ve kann mikrobiyel putrifkasyonunu ve bylece "endojen alkol oluumunu veya alkol kaybn" nler. Cam tplere alnan kan rnekleri az skca kapatlarak analize kadar buzdolabnda saklanr. Mide ierii veya mide ykama suyu : Mide ierii, mide ykama suyu, kusmuk ve elbise zerinde kalan kusmuk kalnts analiz iin kullanlr. lk mide ykama suyu toksikolojik analiz iin daha nemlidir. Numuneler ayr ayr alnr. Her birinin total hacimleri kaydedilir. Kantitatif deerlendirme

iin bu gereklidir. Mide ierii ile ilgili rnekler plastik kaplar iinde toplanr. Analiz iin en az 50 ml numune gereklidir. Mideden alnan rnekler ilalarn ve toksik maddelerin taranmas iin uygundur. Henz absorbe olmam ve bozulmam ila kapslleri, tabletleri, bitki paracklar gzle bile grlebilir. Oral yolla zehirlenmelerde genel olarak toksik madde en yksek konsantrasyonda mide ieriinde bulunur. lm olaynda ayrca mide ierii ile birlikte mide de alnr. ki

tarafndan ligatre edilerek, mmkn mertebe ekli bozulmadan uygun bir kap iinde laboratuvara gnderilir. 2.2. Postmortem toksikolojik analiz iin alnacak biyolojik rnekler Yukarda lm olmayan aklanan idrar,kan, mide (lm halinde) ve ierikleri hem zehirlenmelerde (antemortem) hem de lmden sonra

(postmortem) toksikolojik analiz iin alnr. lmden sonra otopsi srasnda en ounlukla mide muhtevas, kan, idrar, karacier, safra, beyin ve bbrek rnek olarak alnr. Tablo l ' d e postmortem toksikolojik analizde kullanlan biyolojik materyal, miktar ve hangi zehirlenmelerde seilecekleri

gsterilmitir.

Tablo 1- Otopsi srasnda toksikolojik analiz iin alnacak biyolojik materyal. Numune Beyin Karacier Bbrek Kan (kalp) Kan (femoral v e n ) Vitrz humor Safra idrar Mide muhtevas Akcier Miktar 100 g 100 g 50 g 25 ml 10 ml Hepsi Hepsi Hepsi Hepsi 200 g Kullanld analiz Alkol ve dier uucu zehirler Bir ok toksik maddeler Metaller (Hg, Cd gibi), sulfanamitler Alkol, CO, CN, depresanlar, trankilizanlar Alkol, CO, CN, depresanlar, trankilizanlar Alkol Morfin, metadon, glutetimid ve dier ilalar Metaller, uyku ilalar gibi birok ilalar Zehirlenmeden veya lmden ksa bir sre nce alnan zehirler Inhalasyon zehirleri

Yntemler gelitike alnmas gereken biyolojik rnek miktar da azalmaktadr. rnein karacier rneinde daha nceleri 250-500 g alnmas istenirken son yllarda 100 g yeterli grlmektedir. (Cravey, H.R. ve Baselt R.C., 1975; Poklis, A. 1995) Eer phelenilen zehir uucu bir madde ise beyin (100 gram) ve akcier rnei (200 gram) istenir. Cesetin bozulmas ya

durumunda beyinden her zaman rnek alnmaldr. Pestisitler gibi dokusunda biriken maddelerle zehirlenmelerde (kloiu

hidrokarbonlu

insektisitler, PCB'ler gibi) adipoz dokudan (50 gram) da rnek alnmaldr. Kronik metal zehirlenmelerinde kemik dokusundan rnek almak

gerekir. Sa rnei ise hem lm olmayan kronik zehirlenmelerde ve hem de postnortem analizlerde kullanlan nemli bir biyolojik materyaldir.

Olay yeri kalntlar : Zehirlenme olaynn olduu yerde (olay yeri), zehirlenen kii ve lnn evresinde bulunan ieler, kaplar, dier pheli

materyal zehirlenme olay ile ilgili olabilir. Bu nedenle "olay yeri kalnts " olarak isimlendirilen bu materyal analiz iin alnr. Bu tip materyalden alnan numuneler ancak destekleyici olabilir. Deerlendirmede asl olan biyolojik numunedir. Olay yeri kalntsndan birka miligram rnek yeterli olabilir. Alnan rnek kat ise birka mililitre su veya uygun bir organik zc iinde zlr. Her test iin kk bir miktar kullanlr. 2.3. Numunenin korunmas ve laboratuvara gnderilmesi deal olan numunenin almndan hemen sonra laboratuvara

gnderilmesi ve analizin yaplmasdr. Ancak analize kadar numunenin bir sre beklemesi gereklidir. Bu durumda bekletme srasnda analizi yaplacak maddenin (biliniyorsa) bozulmama koullar salanmaldr. Genel olarak ise gerek antemortem gerekse postmortem alnan rnekler birka gn iinde analizi yaplacaksa (+4)C de ; daha uzun sre bekleyecek rnekler ise (20)C de saklanr. Ancak bu durumda alnan numunenin analizden nce iyice ezilip, homojenize edilmesi gerekir. -10C den aa scaklklarda numunenin saklanmas srasnda CO, H 2 S ve zellikle HCN'in znm olduklar organ svlardan ayrlabilecekleri hatrlanmaldr. Koruyucu madde ilavesinden

ounlukla kanlr. Ancak doku ve svlarn bozunmasndan etkilenecek toksik madde analizlerinde numuneye %1 orannda sodyum florr ilavesi yaplabilir. zellikle etil alkol analizinde bu ilave zorunludur.

10

2.4. Toksikolojik analizde izlenecek yol

Laboratuara gnderilecek biyolojik materyalde aadaki emaya gre gerekletirilir :

toksikolojik

analiz

1. Numunenin ambalaj almadan nce d grn ambalaj ekli, mhr ve zerindeki etiket) incelenir.

(bykl,

2. Numunenin net arl veya hacmi saptandktan sonra 1/3' analiz iin hazrlanr, dier kalan ksm gerektiinde incelenmek zere saklanr. 3. Mide ierii, idrar ve kanda, izolasyon yapmadan nce, n denemeler uygulanr. 4.Biyolojik materyalden kimyasal maddenin ayrlmas iin izolasyon

yntemleri (mikrodifzyon, ekstraksiyon, enzim, dijestiyonu gibi) uygulanr. 5. zole edilen zehirlerin nitel (kalitatif) analizleri iin genel tarama testleri uygulanr. Ultraviyole spektroskopisi (UV), ince tabaka kromatografisi (TK) ve gaz kromatografisi (GLK) en ok kullanlan yntemlerdir.

mmunoassay de tarama testleri arasnda saylmaktadr. 6. Kimyasal maddenin kesin identifikasyonu (destekleyici testleri) ve kantitatif tayini yaplr. Bu amala GLK, yksek basnl sv kromatografisi (HPLC) ve gerektiinde gaz-ktle spektrometresi (GC-MS) kullanlr. 7. Metalik zehirler iin Reinsch testi; atomik absorbsiyon ve emisyon spektroskopisi ile kalitatif ve kantitatif analiz yaplr. 8. Toksik anyonlarn dializ yntemi ile ayrlmas ve analizleri yaplr.

2.5. Toksikolojik analizi etkileyen faktrler

1) Toksikolojik analize balamadan nce baz faktrlerin gz nne alnmas gerekir. Bu faktrler arasnda, alnabilen numune miktar, aranacak

1 1

kimyasal

maddenin mahiyeti ve zehirlenmeye neden olduu

dnlen

pheli maddenin biyotransformasyonu ve zellikle postmortem doku veya svlarda oluabilecek bozunma maddeleri hakknda bilgi edinilmelidir. Oral yol ile zehirlenmelerde ncelikle mide ierii analiz edilir. nk letal doz veya stnde bir miktarda alnan zehirin absorbe olmam ksmn ierebilir. Arkadan idrar analizine geilir. nk bbrek bir ok zehirlerin atlm organdr, bu nedenle yksek konsantrasyonda toksik madde ve /veya metabolitlerini ierebilir. la ve zehirler gastrointestinal sistem ve dier yollardan absorbe olduktan sonra, genel sistemik dolamdan nce karaciere tanrlar. Bu nedenle kimyasal maddenin karacierdeki konsantrasyonu kana gre ok yksek (enaz 100 misli) olabilir. Eer belirli bir maddeden

pheleniliyorsa veya biliniyorsa bu durumda toksikolog ncelikle zehrin konsantre olduu doku veya svlar analiz materyali olarak seer. rnein CO zehirlenmesi phesi varsa kan (COHb eklinde bulunur) ncelikli analiz svs olarak kullanlr. Toksikolojik analiz yapan kiinin (kimyasal toksikolog) ila ve

kimyasal maddelerin biyotransformasyonunu bilmesi gerekir. Ana madde ile birlikte (ana majr) metabolitinin de izole edilmesi gerekir. Baz durumlarda sadece metabolitlerin bulunmas zehirlenme nedeni olan ila veya zehir iin bir delil olabilir. "mmunoassay" gibi tarama yntemleri ana maddeden ok idrardaki metabolit analizine dayanr. rnein kokain bamllnn

saptanmasnda, balang testi olarak immunoassay yntemi ile idrarda majr netaboliti olan benzoilekgonin aranr. Eer tkrk veya sa biyolojik

materyal olarak kullanlacak ise o zaman dorudan kokain aranr. Daha ileri testlerle (GC ve GC/MS gibi) kokain ve majr metabolitleri (benzoilekgonin ve ekgonin metil esteri) ayrlarak kantitatif analizleri yaplr.

12

Kural olarak lmden sonra, otopsi ve toksikolojik analiz en ksa zamanda yaplmaldr. eitli nedenlerle otopside ve numune almadaki

gecikmeler, analizi etkileyen birok interfere edici maddelerin olumasna neden olur. lmden sonra oluan "Thanatokimyasal" deiimleri bilmek ok nemlidir. Cesedin bekletilmesi srasnda, ortamn scakl, nemi ve sresi gibi eitli etkenlerle cesette enzimatik ve nonnzimatik proseslerle bozunma olur. Ayrca mikrobiyel metabolizma cesette bulunan zehiri paralayabilir

veya "ptomain" veya "kadaverik alkaloidler" ad verilen diaminlerin (putresin ve kadaverin) olumasna neden olur. Bu kadaverik alkaloidlerin fiziksel ve kimyasal zelliklerinin sklkla rastlanlan zehirlere benzedii ve bozunmu cesetten izole edilen bu maddelerin morfin ve benzeri ilalar gibi ayn renk reaksiyonlarn verdikleri 1870'li yllarda bile biliniyordu. Daha sonralar oluan dier endojen maddelerin de ilalara benzer zellikleri gsterilmitir, (rnein fen i 1 alaninin bakteriyel dekarboksilasyonu ile oluan

feniletilaminin amfetamine ok yakn zellik gstermesi gibi.) Cesete kt koku veren bu aminler dnda, mikrobiyel bozunma sonucu birok endojen maddeler oluur. Analizi etkileyen bu maddelerin mahiyeti, fiziksel ve kimyasal zellikleri ile ilgili bir ok ayrntl almalar bulunmaktadr.

Putrefaksiyonun derecesi ve mikrobiyel aktiviteye bal olarak kandaki CO (COHb), siyanr, etil alkol gibi maddelerin konsantrasyonlar azalabilir veya artabilir. Bunun yannda barbitratlar, striknin ve civa gibi toksik maddeler ise ok dayankldr ve lmden uzun yllar sonra bile tanmlanabilirler. Stolman, 1969; Gadamer, 1965; Poklis, 1995) 2) Reaktifler ve ila standartlar : Kullanlan kimyasal maddeler saf olmaldr. zerlerindeki etiketlerinde spesifkasyonlar belirtilenler

13

kullanlmaldr. Kimyasal maddelerin ve standardlarn gerektiinde

ince

tabaka kromatografisi ve.UV spektrumlar ile saflklar kontrol edilmelidir. 3) Analiz niteliinin gvenirlilii (quality assurance) : Analiz yaplacak numune ile birlikte almaldr. Negatif bilinen pozitif ve negatif kontrol numunelerle paralel, kontrol numunesi (blank: kr), analiz srasnda

kullanlan cam v.s. gibi malzeme ve reaktiflerden gelebilecek "yanl pozitif sonucu" kontrol etmek iin kullanlr. pheli pozitif sonu grldnde kullanlan malzemenin kimyasal olarak temizlii tekrarlanmal, reaktiflerin doru hazrlanm olmas ve stabilitesi kontrol edilmelidir. Pozitif kontrol numunesi, analizi yaplacak madde ile hazrlanm standard ierir. Kantitatif testlerde yntemin doruluu, tekrarlanabilirlii ve verimi aratrlmaldr. Analizi yaplacak madde standard ile beraber ve gerektiinde yntemin kontrol iin d veya i standartlar kullanlr. Kullanlan yntemin duyarl (mg/1 veya |Jg/ml olarak), deteksiyon limiti (kullanlan cihaz ile

ilgili), ve seicilii ile ilgili parametreler de incelenerek, analiz sonucu verilecek raporda belirtilmelidir. 2.6. Analitik Bulgularn Deerlendirilmesi Numunenin analizinden sonra toksikolog, bulgularn ve

konsantrasyonunu tayin ettii maddenin ilgili kiinin zerindeki fizyolojik ve davran hakknda etkilerini yorumlamaldr. yapmal, Maddenin uygulama yolu ve dozu

deerlendirme

biyolojik

materyalde

saptanan

konsantrasyonun kiinin lm iin yeterli olup olmayaca davranlarn deitirerek lmne neden olup

veya kiinin cevabn

olmayaca

vermelidir. Adli toksikoloun ounlukla karlat en g problem, analitik bulgularn fizyolojik anlamn yorumlamaktr. Uygulama yolunun belirlenmesi iin, toksikolog eitli biyolojik sv ve doku rneklerinde yapt analiz sonularna bakmaldr. Genel bir kural
14

olarak, zehir uygulama yerinde en yksek konsantrasyonda bulunur. Bu nedenle zehirin gastrointestinal (GI) sistem ve karacierde daha yksek konsantrasyonda bulunmas oral yolla almn; dier organlara gre akcierde daha yksek konsantrasyonda bulunmas ise inhalasyonla alndn gsterir. Kokain, eroin ve fensiklidin gibi bamllk yapan maddeler ounlukla sigara ile ime eklinde alnr. Bu durumda bu maddelerin kendileri yannda piroliz (yanma) rnleri de inhalasyonla alnr. Bu maddelerin kendileri ile birlikte yanma rnlerinin de idrar, dier vcut svlar ve dokularnda bulunmas duman eklinde alndn gsterir. rnein duman eklinde alman kokainin piroliz rn "crack" anhidrekgonin metilesteridir. Bu maddenin idrar veya dier vcut svlarnda ve kokainle birlikte yksek miktarda bulunmas, kokainin "sigara ime" eklinde alndn gsterir. Genel olarak, ilalarn ve ksenobiyotiklerin , kan serum veya plazma konsantrasyonlar ile fizyolojik etkileri arasnda bir korelasyon vardr.

Kimyasal maddelerin kandaki dzeyleri normal (ila durumunda teraptik), toksik ve letal olarak snflandrlabilirler. lm durumunda kimyasal maddenin "postmortem kandaki"

konsantrasyonu deerlendirilir. Postmortem kan dzeyine, ilalarn alm ile lm aramda geen sre, postmortem deiimler, kann alnd blge ve dier farmakokinetik zellikler etki eder. Kalp kan, femoral ven, thoracic aorta gibi deiik yerlerden alnan kan rneklerinde analizi yaplan maddenin konsantrasyonlar arasnda nemli farklar bulunabilir. Etil alkol, digoksin ve imipramin gibi maddelerle yaplan aratrmalarda bu farkllk (Poklis.A. 1996). Bu farkllklarn bilinmesi lm gsterilmitir

nedeninin yorumunda

faydal olur. Bu nedenle; toksikolojik analizin (zellikle adli olaylarda) deerlendirilmesinde farkl yerlerden alnan kan ve doku rnekleri ile

sonularn birlikte incelenmesi gerekir.

15

Toksikolojik analiz sonucu bir rapor eklinde hazrlanarak makama gnderilir. Adli toksikolojik analiz sonucu ile ilgili raporda: a) b) c) Otopsi yaplan kiiye ait genel bilgiler; Alnan numune eitleri ve miktar ;

ilgili

Numunelere uygulanan izolasyon ve identifikasyon, kantitatif

analiz yntemleri (yararlanlan literatr de belirtilir); d) Vcut sv ve dokularnda saklanan madde miktarnn lme imzas

neden olup olmayacann yorumunu ve analizi yapan toksikologun bulunmaldr.

lmle sonulanmayan akut zehirlenmelerde ve madde bamllna ynelik toksikolojik analiz sonular da benzeri ekilde belirli rapor

rneklerine gre hazrlanr. 3. ZEHRLERN ARANMASI Akut zehirlenmelerde en nemli olay mmkn olan en ksa sre iinde zehirlenmeye neden olan maddenin identifkasyonu ve gerektiinde kantitatif analizinin yaplmasdr. Kiinin kurtarlmasnda, antidot ve dier tedavinin yaplabilmesinde zehirlenme etkeninin belirlenmesi hayati nem tar. BYOLOJK MATERYALDE DORUDAN

Zehirlenmeye neden olabilecek maddelerin snf ve says ok eitlilik gsterir. Genelde zehirlenmeye neden olabilecek maddelerin says en az 1500'n stndedir ve bunlardan 250-300 kadar ile de sk zehirlenmeye rastlanmaktadr (Fazla bilgi iin Vural,N. 1996 ve Ellenhom, M.J. 1997' ye baknz). Bilinmeyen bir madde ile zehirlenmede, mmkn olan en ksa srede zehirlenmenin mahiyeti hakknda bilgi toplamak gerekir. Bu nedenle mide muhtevas, idrar ve kanda nce dorudan (direkt) n denemeler yaplr. Daha sonra izolasyon ve destekleyici tarama testlerine geilir.

16

3.1. n denemeler Zehirlenmeye neden olan maddenin identifikasyonnda yardmc

olacak ve ksa zamanda sonuca ulatracak n denemeler mide ierii, idrar ve kan rneklerine uygulanr. Bu rneklerde yaplacak organoleptik ncelemeler (renk, koku), pH ve kimyasal testler aada aklanmtr. kullanlan reaktiflerin hazrlanmas kitabn sonunda verilmitir. Numunenin kokusu : Karakteristik kokusu olan maddeler numuneye kendi spesifik kokularn verirler. Bu nedenle idrar ve mide ieriinde bu kokular alglanabilir. rnein : a) Aromatik kokular > fenoller, krezoller; > eter; > kloroform, aseton; > siyanr; > turpentin; > nikotin; > alkol ve esterler; > kloralhidrat; Bu testlerde

Fenolik koku Eterli koku Tatlms koku Ac badem kokusu Meneke kokusu Ttn kokusu Meyvemsi koku Armut kokusu

Ayakkab cilas kokusu > nitrobenzen;

ile ilgilidir. Bunun dnda hidrojen slfr, karbon tetraklorr, benzen, piridin, naftalin, metil salisilat, formaldehit, anilin, merkaptanlar, amilnitrit. bromoform, iyodoform, vanilin gibi maddeler kendine zg kokular ile tannrlar. b) Batc koku : Anorganik asitler, uucu organik asitler ve

formaldehitle alnr. c) Sarmsak kokusu : Elementel beyaz fosfor ve arsenik (kakodil oksit deneyinden sonra) ile ilgilidir. d) Burunda aksrtc etki ve koku salisilik asit ve veratrin tarafndan verilir.

17

Numunenin rengi : Renkli bileikler bulunduu znerek, numuneyi boyarlar.

biyolojik svda

a)Mide suyunun rengi : Anorganik tuzlar veya boyalar mide suyuna kendi renklerini verirler. rnein: Potasyum permanganat : pembe, viyole ; Bakr tuzlar Nikel tuzlar Kobalt tuzlar Pikrik asit, nitrik asit Merkurokrom : yeil, mavi; : yeil; : pembe; : sar; : parlak krmz renklenmeye neden olurlar.

Slfirik asit, okzalik asit ile siyah ve kahve telvesi eklinde granller grlr. la kapslleri boyalar ile mide suyunu renklendirirler. rnein, sekonal krmz; nembutal, efedrin ve pronestil sar; delvinal turuncu renk verir. b) drarda renklenme : drarda kahverengi siyah rengin bekleme ile iddetlenmesi, fenoller, naftol, nitrobenzen, pirogallol, rezorsinol, krezol, porfirinler ve melanin ile grlr. Krmz kahverengi klorokin, ibuprofen, pamakin, fenasetin.

fenotiazinler, fenitoin, trinitrofoneller ile oluur. Alkali

idrarda ise bu renk,

antrokinon laksatifleri, levodopa, metildopa, parahidroksifen, piruvik asit ve fenazopiridin ile grlr. Krmz veya pembe renk gibi aminopirin, maddelerle anilin boyalar, Alkali antipirin, ortamda

iboprufen, fenasetin, fenitoin

grlr.

antrakinon laksatifleri, eosin, rabarb, santonin, brom sulfalein; asit ortamda anisindion, pancar ve brtlen idrara pembe veya krmz renk verir. Asit idrarda anisidindion, metronidazol, methemoglobin sar

kahverengi renk verir (Ellenhorn, M.S ve ark. 1997).

18

3.2. Biyolojik materyale dorudan uygulanan testler

Renk reaksiyonlar : Bir ok ila ve zehirler, yeterli konsantrasyonda ve intaferans yapan maddelerin yokluunda, uygun reaktiflerle karakteristik renk verirler. Bu testlerin bir ksm pratik adan spesifiktir. Ancak ayn fonksiyonel grubu ierenler de reaksiyona girerler. Kullanlan renk

reaksiyonlarnn bu zelliklerini ayrt etmek gerekir. Renk reaksiyonlar deney tpnde, kk porselen kapsl ve tplerde uygulanabilir. Kullanlan malzeme ve reaktiflerin safln kontrol etmek iin (yaln pozitif kontrol) kr (blank) deney yaplmaldr. Ayrca aranacak madde standard ile (yanl kontrol) parelel olarak renk testi uygulanmaldr. idrara dorudan uygulanan testler G l u k o z ve ketonlar " L a b s t x " testi v e y a F e h l i n g deneyi ile aranr. " L a b s t i x " gibi u y g u n bir reaktifle e m p r e n y e edilerek hazrlanm

eritler 10-15 saniye idrar iine daldrldktan sonra o k u n u r . drarda g l u k o z m e v c u d i y e t i n d e , kan glukoz k o n s a n t r a s y o n u d a tayin edilerek aralarndaki k o r e l a s y o n aratrlr. Keton iin pozitif sonu alnmas durumunda aseton veya

izopropilalkol ile zehirlenmeden phelenilir. Bu test ayrca alkta veya diabetik ketozisde de pozitif kar. Fehling deneyi : drarda glukoz ve ketonlar iin Fehling deneyi de uygulanabilir: 1 ml idrar, 1 ml Fehling reaktifi (Fehling I ve II karm) ile yarm saat kaynar su banyosunda bekletilir. Sar krmz kelein meydana gelmesi, serbest aldehit veya keton grubu olan bileiklerin (glukoz, fruktoz, glukuronik asit, laktoz, mannoz) varln gsterir. Ayrca kloroform,

kloralhidrat, trikloroetilen, ok deerli fenoller, morfin, salisilatlar, amigdalin,

19

mentol, a-naftil tiore (ANTU) gibi bileikler de Fehling, deneyine pozitif cevap verirler. Uucu indirgen bileikler (alkol ve aldehitler) dikromat testi ile aranr : Deney tpne, 1 ml idrara 1 ml %10 sodyum dikromat (%50 H 2 S 0 4 iinde) ilave edilir. Eer idrarda %50 mg stnde etil alkol varsa 10 saniyede ; %75 mg alkol varsa 45 saniye iinde oda scaklnda yeil renk meydana gelir. Deney, scakta yaplrsa (karm kaynar su banyosunda en az 2 dakika bekletilirse) %20 mg alkoln tannmas mmkn olur. Etil alkol dnda dier alkoller (metil alkol, izopropil alkol gibi) ve aldehitler de dikromat indirgeyerek bu deneyle pozitif sonu verirler. Demir-3- klorr deneyi (genel) : Bir deney tpnde, 2 ml idrara, 2 damla %5 lik demir-3-klorr (ferri klorr: FeCh) zeltisi damlatlr. Soukta salisilatlarla viyole renk oluur, bunun dnda fenol, enol grubu ieren

bileiklerle : a) 1 dakika soukta bekletme; b) scakta; c) 3 damla 2 N HCI ilavesinden sonra stma ile aadaki renkler elde edilir. (Tablo 2)

20

Tablo 2- FeCl 3 testi ile renk veren kimyasal maddeler zelti veya zeltinin rengi Oda ssnda 1 dakika sonra Renkler
Mavi Mavi-viyole Krmz Kahverengi Ak Sar Pirogallol Bir deerli fenoller (fenol, krezol, morfin, dilaudid gibi Mavi-viyole Kahverengi ak sar Ak sar Floroglusin, pirazoller(piramidon, novaljin, veramon), rezosin Viyole Viyole Viyole ahsilik asit ve salisilatlar, kodein, santonin Yeil Krmz, kahverengi Yeil Beyaz kelek Krmz Akkrmz A k krmz Antipiin Krmz, kahverengi A p o m o r f i n , adrenalin, g u a j a k o l p-naftol

Scakta

3 damla 2 N-HCI ilavesinden ve stmadan sonra

Renk veren maddeler

kelek
Krmz sar Krmz sar z n m e olur B e n z o a t , ftalat ve kafur Beyaz Mavi Mavi Viyole Mavi Mavi z n m e olur Mavi znr a-naftol Ferrosiyanr Gallik asit ve tuzlan

21

Salisilat

aranmasnda

destekleyici

deney

olarak

Trinder

testi

uygulanr: 1 ml idrara 5 damla Trinder reaktif (FeCI 3 , HgNO ? ve HCI ile hazrlanr) damlatlr. Viyole renk salisilat veya salisilamid varln gsterir. Teraptik dozda alnan aspirin veya aminosalisilik asit pozitif sonu verir. Trinder reaktif, salisilatlarn tayininde kantitatif amala blme baknz.) Trikloro bileikleri iin Fujiwara deneyi : 1 ml idrara 1 ml %10 da kullanlr (zel

NaOH ve 1 ml tekrar distillenmi piridin ilave ederek 2 dakika kaynar su banyosunda tutulur. Hibir renk meydana gelmezse 2 ml idrar ilave edilir ve tekrar stlr. Piridin faznda pembe krmz rengin meydana gelmesi trikloro bileiklerinin (kloroform, kloral, klorbutal, trikloroetanol, tikloroasetik asit) bulunduunu gsterir. Deney , blank (kr) olarak seilen idrar ve standart trikloroasetik asit zeltisi ile (kontrol) paralel olarak yaplr. nk

laboratuvar ortamnn reaktiflerle kontamine olmas pozitif sonu verebilir. Karbon tetraklorriin metabolitleri (triklorometil bileikleri) Fujivvara testi ile pozitif sonu verebilir. Ancak karbon tetraklorir ksmen

triklorometile metabolize olduu iin, her zaman pozitif sonu alnmayabilir. Bu nedenle CC14 zehirlenmesinden sphelenildiinde, ayrca hepatotoksisite testleri yaplmaldr. mipramin, desipramin ve trimipramin iin Forrest deneyi : 1 ml idrara, 1 ml Forrest reaktif ilave edilir. mipiramin, desipramin veya

tripiramin olduunda yeil renk meydana gelir. Fenotiazinler iin FPN deneyi : 1 ml idrara 1 ml FPN reaktifi ilave edilir. Fenotiazin trevlerinden birinin mevcudiyetinde pembe, krmz,

turuncu viyole ve maviye kadar giden bir renk deiimi grlr. Primer aminler iin anaftol-sodyum nitrit deneyi : Seyrettik

hidroklorik asitle asitlendirilmi 2 ml idrara, 3 damla %1 "Na N 0 2 ve 3 damla

22

taze hazrlanm %1 a-naftol %10 NaOH iine ilave edilir. Pembe rengin varl p-aminofenol varln gsterir, veya dier primer amin ieren bileiklerden birinin p-aminopenol fenasetin, parasetamol ve anilinin

metabolitidir. Parasetamol iin krezol-amonyak testi : 0.5 ml idrara 0.5 ml hidroklorik asit ilave edilir ve 100C de 10 dakika kaynatlr. Dier bir tpte, karmn 2 damlasna 10 ml su, 1 ml %10 hk krezol (su iinde hazrlanm) ve 4 ml 2M amonyum hidroksit ilave edilir. Mavi rengin olumas

parasetamol varln gsterir. Test ok duyarldr ve teraptik dozlarda da pozitif sonu elde edilir. Ar dozda almndan gnlerce sonra ana madde ve konjuge metabolitleri tanmlanabilir. Pozitif sonu alndnda, hemen

parasetamol plazma dzeyi tayin edilmelidir. Etklorvinil iin difenilamin testi : 2 ml idrar stne birka mg difenilamin slfat serpilir. Tp eilerek yandan 1 ml slfirik asit ilave edilir. Etklorvinil varlnda difenilamin kristalleri zerinde krmz renk oluur. Bu test sperifktir ve teraptik dozda da pozitif sonu verecek duyarlktadr. Parakuat ve dikuat iin ditionit testi : 1 ml idrara taze hazrlanm %0.1 lik sodyum ditionit zeltisinden (1 M-sodyum hidroksit iinde) ilave edilir. Mavi rengin belirmesi parakuat gsterir. Dikuat ile yeil renk elde edilir, ancak parakuat da bulunabilir. Parakuatn almndan 4 saat sonra alnan idrar rneinde de koyu mavi renk elde edilmesi iyilemenin gereklemediini gsterir. Zehirlenmenin iddeti plazma-parakuat dzeyinin llmesi ile desteklenir.

23

Mide ieriinde uygulanan n deneyler Mide ierii yukarda akland gibi nce koku, renk, grn (bitki paralar, yemek artklar, yabanc madde kalntlar) olarak incelenir. pH' saptanr. pH'nn yksek olmas alkali alndn gsterir. Salisilatlar: Trinder testi ile aranr. 2 ml numuneye 2 ml 0.1 M hidroklorik asit ilave edilir. 10 dakika kaynatldktan sonra gerekirse szlr. Sznt 0.1 M sodyum hidroksitle ntralize edilir ve 3 damla Trinder reaktifi ilave edilir. Viyole renk salisilat varln gsterir. Aspirin hidroliz edildikten sonra, Trinder reaktifi ile pozitif sonu verir. Oksidan maddelerin (hipoklorit, bromat, klorat, iyodat, nitrat ve nitritler) iin difenilamin testi uygulanr. 2 damla numune mide ierii sznts slfrik asit iinde hazrlanan 1 ml %1 lik difenilamin zeltisine ilave edilir. Hemen oluan koyu mavi renk oksidan bir anyonun varln gsterir. zellikle oksidan anyonlarn dier anyonlardan ayrlmasnda

kullanlan bir testtir. Ak mavi renk organik maddeden kaynaklanabilir ve bu nedenle gz nne alnmamaldr. Etlerde prezervatif olarak kullanlan nitrit ve nitratlar da (mide ieriinde bulunabilecek etten kaynaklanan) pozitif reaksiyon verirler. Ferro (Fe ++ ) ve ferrik (Fe +++ ) iyonlarnn tanmlanmasnda

ferrosiyanr ve ferrisiyanr deneyi kullanlr. 2 damla rnee 3 damla 2 M hidroklorik asit ve 1 damla %1 lik potasyum ferrisiyanr zeltisi ilave edildiinde oluan mavi kelek (Turnbull mavisi) ferro iyonunun

mevcudiyetini

gsterir.

Test,

ferrisiyanr

zeltisi

yerine

ferrosiyanr

zeltisi kullanlarak tekrarlanr. Bu durumda oluacak koyu mavi kelek (Berlin mavisi) ferri iyonunun varln gsterir.

24

Organik fosfat yapsndaki ve dier kolinesteraz inhibitrlerini aranmas : Kolinesteraz inhibisyonu reaksiyonuna dayanr. 2 ayr tpe 3 ml ditiyobisnitrobenzoik asit zeltisi 0.1 ml %5 asetil tiyokolin iyodr ve 20 mikrolitre (|il) normal serum ilave edilir. Birinci tpe 0.2 ml su (kr deney), ikinci tpe 0.2 ml mide ierii sznts ilave edilerek 2 dakika bekletilir. 2 tp arasndaki renk fark, organik fosfat esteri veya baka bir kolinesteraz inhibitr varln gsterir. Fenotiyazinler, imipramin grubu, trikloro bileikleri, etklorvinilj parakuat ve dikuat mide ierii szntsnde daha nce idrarda aklanan testlerle aranr. Kana dorudan uygulanan testler Kanda glukoz ve re tayini yaplr. Kan ekeri inslin, hipoglisemik maddeler eker ve alkolle der. Ayrca parasetamol zehirlenmesinde oluan karacier hasarnn ilk dneminde de hipoglisemi grlr. Kanda (serum veya plazma) salisilatlar, uucu indirgen maddeler ve kolinesteraz inhibitrleri daha nce aklanan yntemlerle aranabilir. Bu yntemler kantitatif amala da kullanr. Yntemlerin ayrnts ilgili maddeler blmnde aklanacaktr. Karbonmonoksit, karboksihemoglobin (COHb) eklinde aranr. Kan rnei 0.01 M amonyak ile (1:20) orannda seyreltilir. Beraberinde deney normal kan ile tekrarlanr. Amonyakla seyreltilen normal kann rengi hemen sarya dnerken %20 ve st oranda karboksihemoglobin ieren kan birka dakika dayanan pembe renk verir. Sonucun dier deneylerle de desteklenmesi gerekir. Destekleyici deney olarak spektroskopik incelemeler ile yaplr : Kan rnei 0.01 M amonyum hidroklorrle 1:200 orannda seyreltilir. COHb sar ve sar-yeil alanda (568 ve538 nm de) maksimum absorbans gsterir. Normal
25

kanda oksihemoglobin ( 0 2 H b ) daha uzun dalga boyunda (576 ve 541 nm de) maksimum absorbans gsterir. Kanda %40 ve stnde COHb olduunda OHb ve COHb bandlar ayrlabilir. COHb bandlarnn daha iyi grlmesi iin numuneye indirgen (sodyum ditionit gibi ) bir madde ilave edilir. Bu durumda 0 2 H b band kaybolarak, 555 nm de daha az iddetle hemoglobin (Hb) den ileri gelen maksimum absorbans grlr ve COHb bandlar daha belirgin olarak seilir.

3.3. aranmas

Baz

metalik

zehirlerin

biyolojik

materyalde

dorudan

Arsenik, antimon, cva, bizmut, selenyum ve tellryum gibi bakrdan daha soy metalik zehirler (metal ve ametaller) biyolojik materyalde izolasyon yapmadan dorudan aranabilirler. n deneyler grubuna gre bu testler arasnda en nemlisi Reinsch deneyidir. Reinsh Deneyi Reinsh deneyinin prensibi, asit ortamda bakrdan daha soy metal veya ametal iyonlarnn (cva, gm, bizmut, arsenik, antimon, telleryum.

selenyum, kkrt) metalik hale geerek bakr levha zerinde toplanmasna dayanr. Dorudan doruya, yklama ilemi gerekmeksizin. biyolojik madde (kan, idrar, doku) kullanlabilir. Bakr levha veya bakr spiral tel zerinde toplanan metal veya metal karmlarnn kesin tanmlanmalar, Gettler ve Kaye (1961) tarafndan gelitirilmi bir seri destekleyici deneylerle

(confirmatory tests) gerekletirilir. Bu testler yar kantitatif amala da kullanlabilir. Deneyin yapl : Biyolojik materyal olarak mide ierii, bbrek veya idrar kullanlabilir. 25 g doku Waring blender veya benzeri bir

26

homojenizatrde uygun bir miktar su ile masere edilir. Numune olarak idrar kullanlacaksa 10 ml, organ ieriinden ise 10 g alnr. Bir erlenmayer iine konulan biyolojik madde zerine 3-5 ml konsantre hidroklorik asit (HCI) ilave edilir, numunenin asit konsantrasyonu %2-8 arasnda kalmaldr. 1 cm 2 den daha byk olmayan bir bakr levha kullanlr. Bakr levhay tutmak iin platin veya nikrom telden yararlanlr. Bakr levha (1:1) seyreltik HNO3 iine ve sonra distile su iine daldrlarak temizlenir. Bakr levha biyolojik materyal ve asit ilave edilerek hazrlanan karm iine daldrlr ve kaynar su banyosu zerinde 1-2 saat stlr, (bizmut 2 saat ister). Karmn azalan hacmi, stma esnasnda %10 HCI ilave edilerek, tamamlanr. 1 saat sonra bakr levha alnr ve distile su ile yakandktan sonra levha, filtre kad arasnda bastrmadan kurutulur. Bakr zerinde toplanm maddenin rengi, metalik zehirin cinsi

hakknda bize n bilgi verir. yle ki: Tel zerindeki gmi bir renk : cva (Hg) Parlak siyah renk : bizmut (Bi) Mat siyah renk : arsenik (As) Mor renk : antimon (Sb) olduunu gsterir. (Bu test ile 20 ml zeltide bulunan 50 (a.g civa, 5 |J,g arsenik, 20 |J.g antimon, 20 ja. bizmut tannabilir). Bakr levha zerinde toplanan metallerin kesin identifkasyonlar (Destekleyici deneyler): Cva aranmas : Bir saat camna filtre kad yerletirilir ve sras ile : 1-2 damla (100 ml suda 5 g potasyum iyodr ve 20g sodyum slfit :

KI+Na 2 S03 7 H 2 0 ile hazrlanan) zeltiden ve 1-2 damla %5 bakr slfat (5g C u S 0 4 . 5 H 2 0 , 100 ml 1 N-HCI iinde zlr) ilave edilir. Distile su ile ykanm ve kurutulmu bakr levha bu karmn (kuprz iyodr : Cu 2 I2 )
27

zerine konur. Saat cam ile kapatlr. 1 saat bekletilir. Bakr levha zerindeki birikinti cva ise, Cu 2 l2 ile reaksiyona girerek , sar krmz bir renk (kuprz merkurik iyodr) belirir. Bizmut aranmas : Hg aranmasndan sonra bakr levha alnr bir tpe konur. zerine sras ile mi %5 lik sodyum slft, 1 ml %15'lik nitrik asit (HNO3 ) konarak karm 5 dakika alkalanr. Bizmut varsa zeltiye geer. zelti dier bir tpe aktarlr. zerine 1 ml distile su, 1 ml kinin-Ki reaktifi (1 g kinin slfat, 100 ml %0.5 lik HNO3 iinde zlr. 2 g K ilave edilir, (znmesi salanr). Bizmut olduunda turuncu renk oluur, (kinin-bizmutiyodr.) Arsenik ve antimon aranmas : Bakr levha 0.5 ml %10 (KCN) ile alkalanr. As zeltiye geer. Bu nedenle zeltide As, bakr levhada ise antimon Gutzeit testi aranr. Gutzeit Deneyi 1) Gutzeit deneyi en basit ekli ile bir tp iinde yaplr. (ekil la) Deney tpnn iinde 1 ml yukarda hazrlanan KCN'l zelti (veya kalnt olan bakr levha), 1 ini %20 lik H 2 S 0 4 , 1-2 saf granl inko, 1-2 damla kalay klorr (SnCL) ilave edilir ve tpn az skca bir mantar tpa ile kapatlr. Arsenik varsa, mantarn kenarndaki Cva-2-klorr %5 lik (HgCl 2 ) veya gm nitrat ( A g N 0 3 ) ile emprenye edilmi filtre kadnda konsantrasyona bal olarak sar, turuncu, kahverengi ve siyah renge kadar deien renk tonlar (AgNOj ile siyah) grlr. Gutzeit testi, antimon mevcudiyetinde de pozitif sonu verir. Fakat bu halde meydana gelen renk sar-siyahtr ve renk daha ge meydana gelir. Ayrca konsantre HCI dumanlar ile temasta,

antimon ile meydana gelen renk kaybolduu halde arsenik ile meydana gelen renk sabit kalr.

28

Gutzeit deneyinde, Reinsch testi uygulanan bakr levha kullanlabildii gibi,organik maddeleri yklanm idrar, kan, sa, trnak gibi biyolojik

materyal (asit dijestiyon zeltisi) de kullanlabilir, (yklama ve klletirme iin baknz: Kaya, S., 1961; Gley, M., Vural, N., 1975) 2) Gutzeit deneyi: As iin yar kantitatif olarak da uygulanabilir. Bu amala ekil lb deki aparey kullanlr. ekil lb de grlen erlenmayenin azna lastik bir tpa ile yerletirilen kurutma tpne kurun asetat ile nemlendirilmi pamuk konur. Bu tpn stne hazr olarak salanan veya yaptrlabilen kanatlar yerletirilir.

Kanatlarn ls ve ekli ekil l b de gsterilmitir. Bu kanatlar arasna cva2 bromr (merkric bromr) ile emprenye edilmi kuru filtre kad

(Whatman no:40 yuvarlak filtre kad, %95 lik alkolde %5 konsantrasyonda hazrlanan cva-2 bromr ile 2 dakika emperenye edilmi) yerletirilir. Erlenmayer iine, Reinsch testi uygulanm bakr levha veya yklama uygulanm biyolojik materyalin asit dijestiyon zeltisinden 20 ml konur, 15 ml %10 luk slfirik ve 5 g arsenik iermeyen inko granl ilave edilir. Hidrojen ve arsin gazlarnn aa kmas iin 30 dakika (gerektiinde 1 saat) bekletilir. Reaksiyon sonucu arsin HgBr 2 ile emprenye edilmi filtre kadnda konsantrasyona bal olarak sardan kahverengiye kadar deien renk verir. Safszlk olarak bulunabilecek kkrtl hidrojen, kurun asetatl tarafndan tutulur. Standart arsenik zeltisi ile hazrlanan renk skalas ile karlatrlarak test yan kantitatif olarak da kullanlabilir. 5 |ig arsenik detekte edilebilir. pamuk

Zehirlerin izolasyon yntemlerine gre snflandrlmalar Analitik amala bir ok toksikologlar, zehirleri uygulanan izolasyon tekniklerine gre balca be snfta toplanr: a) Uucu zehirler : Biyolojik maddeden distilasyon veya difzyon yolu ile ayrlrlar. (CO, siyanr gibi gazlar ve alkoller, benzen gibi organik zcler). b) Uucu olmayan organik zehirler : Biyolojik ortamdan sv

ekstraksiyon yntemi ile izole edilirler (barbitratlar, alkaloidler, birok ilalar). c) Metalik zehirler: Biyolojik maddeden kuru veya ya klletirme (oksidasyon) ilemi ile ayrlrlar (kurun, kadmiyum, cva gibi). d) Toksik anyonlar : Biyolojik ortamdan dializ veya iyon deitirme (ionexchange) teknikleri ile ayrlrlar (klorat, fosfat, tiosiyanat gibi). e) eitli zehirler : (zel olarak aranmas gerekenler): Yukardaki izolasyon teknikleri ile aranamayan ve her biri iin zel ektraksiyon ilemleri, iyon deitirme, iyon ifti oluturma gibi yntemlerin uygulanmas gereken maddeleri kapsar (pestisitler, proteinler, glikozitler gibi). 4.1. izolasyonlar Bilindii gibi distilasyon sv bir maddevi, kaynama noktasna kadar Uucu zehirlerin biyolojik materyalden distilasyonla

SD VW (W U I S ASM LD E E T O N SE BE ) I T
% 5 HgCl 2 le emprenye kat

ED V W N I E

VlO0L U VW B.I E E I (I G E U ) S L NT N

MRUC BO D ECR RMC I I S NI IE E . E S 2D P K T

C TO UR6 AE OT f I PEM TO t * T LA AEAC WH EO CTT I

Numune % 20 H 2 S 0 4 ve Zn, SnCI 2

ekil 1- Basit (a) ve modifiye (b) Gutzeit apareyi

4. ZEHRLERN BYOLOJK M A T E R Y A L D E N TEKNKLER

ZOLASYON

Toksikolojik analizlerde, ok sayda eitli kimyasal maddelerin (2000 stnde) aranmas gerekmektedir. Bu maddelerin analizleri iin deiik analitik kimya ve fizikokimyasal tekniklerden yararlanlmaktadr.

ounlukla aranlan zehirli madde ok az miktarda (miligram ve hatta mikrogram dzeyinde) olduundan ncelikle bunlarn bulunduu ortamdan ayrlmas ve saflandrmas iin kullanlacak izolasyon yntemleri ok gre

nemlidir. Analitik toksikolojide, zehirler bu ayrma yntemlerine

snflandrlmtr. Bilinmeyen veya pheli bir zehir nce bu genel izolasyon yntem ve tekniklerine gre ayrldktan sonra, nitel ve nicel analizleri yaplr.

30

yava distile edilir.

Bu ekilde soutucudan geerek buz iinde soutulan

toplama kabnda distilat toplanr. Bu distilat uucu zehirlerin aranmas iin kullanlr. Kaynama noktas 100 altnda olan nemli uucu zehirlere rnek

olarak: Eter, etil bromr, petrol eteri, aseton, kloroform, metil alkol, etil alkol, izopropil alkol, benzen, etilen klorr, trikloroetilen verilebilir. Su buhar distilasyonu ile ayrma : Her sv maddenin scaklk derecesine bal olarak belirli bir buhar basnc vardr. Bir gaz akm ile buhar sv zerinden uzaklatrlrsa, o madde tekrar dengeyi salamak iin

buharlar. Uygulamada bu amala su buhar kullanlr. Genellikle kaynama noktalar suyunkinden olduka yksek olan maddelerin iine su buhar

yolland zaman, bu maddeler o scaklktaki buharlama basnc orannda buharlar. Sonra bu buharlar, su buhar ile birlikte soutucudan geerek

younlarlar. ekil (2) de su buhar distilasyonu apareyi grlmektedir. Numune "B" balonuna 1/3 n gemeyecek ekilde konur ve gelen su buharn

younlamamas iin nceden balon " B " stlr. Balona uygun bir soutucu balandktan ve nne toplama kab (C) yerletirildikten sonra, kuvvetli bir su

Zehirlerin izolasyon yntemlerine gre snflandrlmalar Analitik amala bir ok toksikologlar, zehirleri uygulanan izolasyon tekniklerine gre balca be snfta toplanr: a) Uucu zehirler : Biyolojik maddeden distilasyon veya difzyon yolu ile ayrlrlar. (CO, siyanr gibi gazlar ve alkoller, benzen gibi organik zcler). b) Uucu olmayan organik zehirler : Biyolojik ortamdan sv

ekstraksiyon yntemi ile izole edilirler (barbitratlar, alkaloidler, birok ilalar). c) Metalik zehirler: Biyolojik maddeden kuru veya ya ktletirme (oksidasyon) ilemi ile ayrlrlar (kurun, kadmiyum, cva gibi). d) Toksik anyonlar : Biyolojik ortamdan dializ veya iyon deitirme (ionexchange) teknikleri ile ayrlrlar (klorat, fosfat, tiosiyanat gibi). e) eitli zehirler : (zel olarak aranmas gerekenler): Yukardaki izolasyon teknikleri ile aranamayan ve her biri iin zel ektraksiyon ilemleri, iyon deitirme, iyon ifti oluturma gibi yntemlerin uygulanmas gereken maddeleri kapsar (pestisitler, proteinler, glikozitler gibi). 4.1. Uucu zehirlerin biyolojik materyalden distilasyonla

izolasyonlar Bilindii gibi distilasyon sv bir maddeyi, kaynama noktasna kadar starak buhar haline getirmek ve bu buhar younlatrarak ayr bir kapta toplamaktr. Uucu zehirlerin distilasyonu, kaynama noktas ve su buhar ile srklenmelerine gre 2 ekilde yaplmaktadr. Normal distilasyonla kaynama noktalar (k.n. ) 100C altnda kullanr.

zehirlerin ayrlmalar: Bunun iin normal distilasyon apareyi

Distilasyon balonuna bir miktar mide ierii, kusmuk, idrar veya kan gibi

31

incelenecek rnek konur ve kaynar su banyosunda veya bek alevinde yava yava distile edilir. Bu ekilde soutucudan geerek buz iinde soutulan

toplama kabnda distilat toplanr. Bu distilat uucu zehirlerin aranmas iin kullanlr. Kaynama noktas 100 altnda olan nemli uucu zehirlere rnek olarak: Eter, etil bromr, petrol eteri, aseton, kloroform, metil alkol, etil alkol, izopropil alkol, benzen, etilen klorr, trikloroetilen verilebilir. Su buhar distilasyonu ile ayrma : Her sv maddenin scaklk derecesine bal olarak belirli bir buhar basnc vardr. Bir gaz akm ile buhar sv zerinden uzaklatrlrsa, o madde tekrar dengeyi salamak iin

buharlar. Uygulamada bu amala su buhar kullanlr. Genellikle kaynama noktalar suyunkinden olduka yksek olan maddelerin iine su buhar

yolland zaman, bu maddeler o scaklktaki buharlama basnc orannda buharlar. Sonra bu buharlar, su buhar ile birlikte soutucudan geerek

younlarlar. ekil (2) de su buhar distilasyonu apareyi grlmektedir. Numune "B" balonuna 1/3 n gemeyecek ekilde konur ve gelen su buharn

younlamamas iin nceden balon " B " stlr. Balona uygun bir soutucu balandktan ve nne toplama kab (C) yerletirildikten sonra, kuvvetli bir su buhar akm (A) balon iinde geirilmeye balanr. Distilasyona soutucudan akan damlalar berrak oluncaya kadar devam edilir. Toplama kab buz iinde soutulur.

32

Tablo-2 Aldehitler Alkoller Aseton Benzen Benzin Benzoik asit

Su buhar ile uan zehirler Fuzel Yalar Guayakol yodoform Kafur Karbon tetraklorr Karbon slfr Kloral hidrat Kloroform Koniin Krezoller Kroton ya Ksilen a - ve P- nofrol Nikotin Nitrobenzen Paraldehit Piridin Salisilik asit ve esterleri Siyanr Tribromoetanol Timol Toluen

Esansiyel yalar Eter Fenoller Formaldehit Fosfor (sar)

33

Su buhar ile uan zehirleri, distilasyon ortamna gre ayrabiliriz:

ikiye

1) Asit ortamda su buhar ile uan zehirler : Asit veya ntral yapdaki uucu bileikler asit ortamda su buhar ile uarlar. Bunun iin analiz maddesinin 1/6 s balona konur. Eer numune asit ise nce doymu sodyum bikarbonat zeltisi ile ntralletirilir. Sonra %10 tartarik asit veya seyreltik slfirik asitle pH 5'e getirilir ve 50 ml distilat toplanacak ekilde su buhar ile distile edilir. 2) Kalevi ortamda su buhar ile uan zehirler : Numune seyreltik NaOH veya kat magnezyum oksit (MgO) ile pH 8 olarak ekilde

kalevilendirilir. Anilin, amfetamin, kloral, hidrat, kloroform (kloral hidrat kalevi ortamda kloroforma dnerek distile olur), nikotin, koniin alkali ortamda distile olurlar. Distilatta uucu zehirlerin aranmas : Elde edilen distilatta uucu zehirler, aadaki ekilde aranr: a) Distilatn kokusu kontrol edilir. Bir ok bileikler karakteristik

kokusu ile tanmlanabilir (fenol, benzen, CS 2 gibi) b) Distilatn reaksiyonu kontrol edilir (Turnusol kad ile asit veya kalevi zellii aratrlr). c) Distilatta kimyasal n denemeler yaplr. Bu n denemeler iin ok eitli reaksiyonlar yapmak mmknse de. en uygun olan fonksiyonel gruplara dayanarak yaplan genel deneylerdir. Organik bileie alkol, aldehit, keton gibi zellii veren gruplarn tanma reaksiyonlar ile distilattaki maddenin kimyasal snfn tayin etmek

mmkndr. Bu reaksiyonlar ya renkli bileiklerin oluumuna (kromotropik asit, Fujivvara deneyleri gibi), karekteristik koku olumasna (iyodoform deneyi, izonitril deneyi gibi) veya kelek (karekteristik renkte) olumasna (ksentogenat deniyi gibi) dayanmaktadr.

34

d) Genel fonksiyonel grubu belirlenmi maddeyi, hem kendi grubu iinde hangi bileik olduunu ve hem de yukardaki ilk bulgularn sonularn kesinletirmek iin zel reaksiyonlar tatbik edilir. Uucu organik zehirlerden baka, uucu olmayan organik zehirlere de uygulanan bu genel ve ayrt edici zel reaksiyonlar tablo 4'de gsterilmitir. Deneylerin yapl zehirlerin zel aranmalar blmnde aaklanmtr. Bu deneylerin bir ksm daha nce "biyolojik svlara dorudan uygulanan deneyler ksmnda da aklanmtr. 4.2. Uucu zehirlerin mikrodifzyon yntemi ile izolasyonlar Az miktarda uucu zehirlerin dokulardan izole edilmesinde kullanlan dier bir teknik mikrodifzyon yntemidir. lk kez Feldstein ve Klendshoj tarafndan uygulanan bu teknik iin Comvay'in mikrodifzyon dzenei kullanlmaktadr. (ekil 3) Bu yntemle ayrca uucu zehirlerin identifkasyonu ve kantitatif analizi de yaplabilir. Prensip : Kapal bir sistemde analizi yaplacak biyolojik materyal ve bu rnekten uucu zehiri aa karacak reaktif (liberating agent) d odackta ve serbest hale geen uucu zehiri tutan zc (absorban) ise i odackta bulunur. Oda scakl veya 37C de d odackta buhar veya gaz haline geen uucu zehir, bu kapal sistemde difzyona urayarak i

odacktaki zc iinde znr. Bu ekilde sistemde bozulan buhar basnc dengesinin salanmas iin biyolojik materyaldeki uucu zehir bitinceye kadar, buharlama, difzyon ve i odacktaki absorpsiyon olay devam eder. Bylece biyolojik maddedeki uucu bileiin saf bir zc iine aktarlmas yani izole edilmesi mmkn olur. odaca ilave edilen uygun bir reaktifle uucu bileiin tannmas i odackta yaplabildii gibi, uucu maddenin znd zelti bir mikro tpe alnarak kalitatif ve kantitatif analizini yapmak mmkndr.

35

Tablo 4- Distilasyonu ile izole edilen uucu zehirlerinn grup reaksiyonlar:

Genel reaksiyonlar Asit ortamda kromatla oksitleme Fehling zeltisinin indirgenmesi Nesslereaktif ile: a.Renk reaksiyonu b. ndirgenme Schiff reaktif ile renk reaksiyonu Kromotropik asit deneyi Legal deneyi (pentasiyano nitrozo demir-3 ile) Fujivvara reaksiyonu (piridin+NaOH+s) zonitril reaksiyonu (Anilin+NaOH+s) ndofenol reakisyonu (Fenol+Oksijen veya nitrz asitle) Demir-3-klorrle Kk molekll aminler, amonyak ve amonyum tuzlar. Aldehitler, pirimer ve sekonder alkoller, kloroform, kloralhidrat Aldehitler ve alkoller (oksitlendikten sonra) Formaldehit, metil alkol (oksitlendikten sonra) Aktif metilen grubu olan bileikler (ketonlar, asetil aseton, indol, pirol, rezorsin gibi) Polihalojenik bileikler (kloroform, trikloroasetik asit gibi) Klorlu hidrokarbonlar, primer aminler ve hidrolizle bu bileikleri verenler Anilin ve hidrolizle anilin veren bileikler (asetanilid, fenasetin, anestezin, novakain, slfonamid, dulsin gibi) Fenol ve fenol trevleri, enol grubu veren maddeler (asetil aseton, piramidon, tiyoslfat, ferrosiyanr) Fenoller (serbest ve p-substite fenoller) Aromatik primer aminler (anilin ve hidrolizle anilin veren bileikler) C S 2 , primer alkoller Etil alkol, asetaldehit, aseton, laktik asit Siyanrler Siyanr ve pikrik asit Uyguland gruplar Alkoller, aldehitler, doymam hidrobarbonlar Aldehitler, kloroform, kloralhidrat

Millon reaksiyonu (Metalik cva+HN0 3 ile nitrolama) Diazo reaksiyonu Ksentogenat reaksiyonu (ROH+CS 2 +KOH) lyodoform reaksiyonu (Etil alkol+iyot+NaOH) Prusya mavisi olumas Guignard deneyi (izopurpurat olumas)

36

Conway mikrodifzyon apareyi : Mikrodifzyon yntemini ilk defa Convvay , biyolojik materyalde amonyak tayini iin uygulamtr. Bu amala gelitirdii apareye "Convvay mikrodifzyon cihaz" adn vermitir. Deneyin Yapl : ekil 4'de grld gibi Convvay mikrodifzyon apareyi petri kutusuna benzeyen cam, porselen veya polietilen iki odackla, da sznt vermeyen kenarlar tral bir kapaktan meydana gelmitir. Genel olarak uygulama aadaki ekilde yaplr:

stten grn

70 mm - 40 mm

10 miflj

Enine kesit

ekil 3- Conway mikrodifzyon apareyi. a) Conway mikrodifzyon cihaznn d odacna, uucu zehirin

aranaca biyolojik materyal ilave edilir. Genellikle 2-5 ml kan, idrar veya

37

homojenize organ numunesi konur. Ayn yere uucu zehri serbest hale geirecek reaktiften 1 ml ilave edilir. b) odaca ise bu uucu zehri aborbe edecek ve renk reaksiyonu verecek olan reaktiflerden 2'er ml ilave edilir. c) Bu ilemlerden sonra apareyin az derhal kapatlr ve diftizyon iin bekletilir. Genellikle kan ile alrken oda scaklnda 2 saat, dokularla alrken 37C de 3 saat beklemek yeterlidir. Tablo 5'de, eitli uucu zehirlerin Conway mikrodifzyon cihaz ile aranmasnda kullanlan reaktifler gsterilmitir.
Tablo 5- C o n w a y mikrodifzyon apareyinde uucu zehirlerin aranmas DI O D A C I K Aranacak Zehir CO Siyanr Klorlu hidrokarbonlar Alkoller (etil-metil-, izopropil-) Metil alkol Fenoller Fosfr Doymu N a 2 C 0 3 % OH2SO4 Doymu N a 2 C 0 3 H 2 SO 4 Doymu N a 2 C 0 3
-

O D A C I K karan A b s o r b a n reaktifler R e n k reaktifleri ve sonu P d C l 2 - > Siyah % l O N a O H FeS0 4 +HClmavi i 1 ml saf toluen 1 ml % 30 N a O H + saf piridinkrmz

Zehiri aa reaktifler % OH2SO4 % OH2SO4

Ansties reaktifiYeil (K2Cr204+H2S04) Kromotopik asitviyole

% l O N a O H Folin-fenolftaleinmavi HNO3 % 5 AgN0 3 kahverengi i % 10 A m o n y u m molibdat+ s sar i

Slfr

% OH 2 SO 4

% lONaOH

a)% 10 Pb a s e t a t ^ s i y a h i b)% 10 Cd asetat sar i

38

4.3. Uucu olmayan organik zehirlerin ekstraksiyonla biyolojik materyalden izolasyonlar Uucu olmayan organik maddeler, analitik ve forensik toksikologlarn ilgilendii en byk grubu (hemen tm maddelerin %90') oluturur. Bu grupta kaynama noktalar yksek sv ve kat haldeki maddeler rnein tbb ilalar, bamllk yapan maddeler, pestisitler, doal kaynakl zehirler, evre kirleticileri, endstriyel maddeler bulunur. Bu maddelerin biyolojik

materyalden izolasyonlarnda sv-sv, kat-sv gibi fraksiyonlu ekstraksiyon yntemleri kullanlr. Ekstraksiyon koullarna gre organik zehirler, tekrar alt snflara ayrlr. Akut zehirlenmelerde, biyolojik materyal olarak kullanlan kan, idrar ve mide ierii gibi rneklere ekstraksiyon ilemleri dorudan uygulanr. Ancak lm halinde, karacier ve dier doku rneklerine dorudan ekstraksiyon uygulanamaz. Doku homojenatlarna n ilem olarak ok eski bir yntem olan Stas-otto, ok daha yeni bir teknik olan enzim dijestiyon yntemi uygulanr. Bu yntemlerin prensibi ksaca aada aklanmtr. Sulu fazn hazrlanmas iin kullanlan toksikolojik yntemlerin

ounun dayand prensip, biyolojik maddenin ihtiva ettii protein, lipit, selloz,boya gibi maddeleri uygun zc ve ilemlerle dayanmaktadr. Bu amala kullanlan yntemlerin en eskisi ilk kez Stas (1850) tarafndan postmortem dokudan nikotini izole etmek iin gelitirilen "Stas" yntemidir. Daha sonra bu yntem Otto tarafndan modifye edilerek "StasOtto" yntemi olarak literatre gemitir. Klasik bir yntem olan Stas-Otto teknii ile alkaloidlerin ve dier organik zehirlerin dokulardan izolasyonu uzun ve yorucu bir alma gerektirdii ve ayrca yabanc tamamen uzaklatrlmamas maddelerin uzaklatrmaa

nedeniyle daha sonraki aratrclar tarafndan

39

modifiye edilmitir. Bu tekniklerde, eitli organik zehirlerin asit veya kalevi ortamdaki znrlkleri ile birlikte seici znrlkleri de gz nnde tutulmutur. Stas-Otto-Ogler, Feldstein-Klendshoj, Umberger, Daubney-Nikolls'un yntemleri bu prensiplere gre gelitirilmitir. Aada uygulama alan geni ve yz yldan daha fazla bir zamandan beri kullanlmakta olan modifiye Stas-Otto teknii aklanmtr. Bu yntem halen lkemizde Adli Tp Kurumunun toksikoloji laboratuvarlarnda

kullanlmaktadr. Modifiye Stas-Otto Yntemi : 200 g dondurulmu ve kylm

(homojenize edilmi) doku, tartarik asitle asitlendirilir, 400 ml etil alkol ile blenderde homojenize edilir. Karm su banyosunda bir saat bekletilir. Isya dayanksz alkaloidler olma ihtimali varsa, scaklk 60C altnda tutulmaldr. Daha iyisi karm bir gece bekletilmelidir. (Doku+etil alkol) karm

soutularak szlr. Ayn ilem bir kere daha kalntya etil alkol ilave edilerek tekrar edilir. Geni azl bir kapsl iinde birletirilen szntler hafif scak hava akmnda su banyosu zerinde uurulur (vakumda distilasyon tercih edilir). 100 ml scak etanol ilavesiyle urup kvamnda bir zelti elde edilir. 100 ml scak etil alkol, kk porsiyonlar halinde ilave edilerek

kartrlr. Elde edilen ekstrakt dekante edilir. Sonuta granl halde kuru bir kalnt kalr. Eer kalnt halen yapkan grnmde ise o zaman scak alkolle ayn ileme devam edilir. Dekante edilen szntler birletirilerek uurulur. Elde edilen bu kalntlar birka damla slfrik asitle asitlendirilmi 100 ml su ile ekstrakte edilir ve

mmknse bir gece bekletilir. Aksi halde bir erlenmayer iinde asitli su ile I saaat alkalanr. Eer bakiye yal ise sulu ekstrakt dekante edildikten sonra 100 ml asitli su ile ekstraksiyon tekrarlanr. ki ekstrakt soutulduktan sonra

4 0

birletirilir ve szlr (pilili Whatman No 1 filtre kadndan). Bylece elde edilen sznt ikinci kademedeki fraksiyonlu ekstraksiyon iin hazrlanm olur. Ekstraksiyonla zolasyon Bilindii gibi ekstraksiyon sulu fazda znm bir maddenin, su ile karmayan organik bir zcye alkalayarak bu organik faza geirilmesi ilemidir. Sulu fazda znm bir ok maddeler iinden, uygun ortam ve zc seimiyle arayacamz organik zehri organik faza alarak

saflandrmak mmkn olur. Biyolojik materyalden n ilemlerle (Stas-Otto veya modifye metodlar) elde edilen ekstrakt veya kan, idrar, mide ierii gibi svlardan ekstraksiyonla organik zehirler ayrlabilir. Prensip olarak, iyonize halde olmayan Bu organik nedenle maddeler, uucu organik zc fazna

geirilebilirler.

olmayan

organik

zehirlerin

ekstraksiyonunda 2 faktr rol oynar : a) Organik maddelerin kimyasal yaps (asit, baz, ntral veya

amfoter zellii); b) yonlamam halde olan organik maddenin, organik zcde

znebilme zellii. zc olarak en ok eter veya kloroform kullanlr. Bunun dnda etil asetat, izopropil alkol, btil alkol, petrol eteri, siklohekzan da koullara gre kullanlabilir. Sulu fazda bir maddenin iyonlama derecesi, o maddenin kimyasal yapsna bal olarak pKa deerine gre deiir. Buna gre asit karakterdeki maddeler asit ortamda, kalevi yapdaki maddeler ise alkali ortamda serbest organik molekl (noniyonize) halde bulunurlar:

41

RCHoCOOH + H 2 0 R-NH 2 + H z O

A A

RCH,CO + [H 3 0] + [RNH 3 ] + + OH

Ntral maddeler ise asit veya kalevi ortamda organik faza geebilirler, nk ortamn ekildedirler. Uucu olmayan zehirlerin ekstraksiyon koullarna gre pH sna baml olmakszn ounlukla iyonlamam

snflandrlmalar Uucu olmayan organik zehirleri, organik faza geebildii ekstraksiyon koullarna gre 5 snfta toplamak mmkndr. Organik kuvvetli asitler; organik zayf asitler; organik bazlar; organik ntral maddeler ve organik amfoterik maddeler. A) Asit ortamda ekstrakte edilebilen zehirler (Organik asitler ve ntral maddeler): Bu maddeler asitli sulu ortamdan (pH 2) eter veya

kloroformla ekstrakte edilebilirler. Asit ortamdan organik zcye geen organik maddeler kuvvetli asit, zayf asit veya ntral zellikte olabilir. O halde bu grubu 3 alt snfta toplayabiliriz : aO Kuvvetli asitler : asitli ortamda eter veya kloroform fazna geen bu maddeler, sulu sodyum bikarbonatla (NaHC0 3 , pH 7.5) ile ekstrakte

edilebilirler. (A fraksiyonu) Asetil salisilik asit, p-amino benzoik asit, inkofen (cinchophen) sitrik asit, okzalik asit, sakkarin, salisilik asit, sulfisoksazol (sulfisoxazole) rnek verilebilir. a 2 ) Zayf asitler : Bu grup maddeler ise, eter veya kloroform fazndan daha kuvvetli kalevi ortamda (NaOH li ortamda) sulu faza geerler. NaHCO zeltisinde (pH 7.5) znmezler. (A 2 fraksiyonu) Barbitratlar, glutetimid, fenil butazon, parasetamol rnek verilebilir.

42

Numune (idrar, mide ierii, kan veya serum, sv doku ekstrakt)

U
pH 3'e ayarlanr (kuvvetli asit ortam)

li
Organik zc ile (eter veya kloroform) ekstraksiyon

Organik zc faz Asit ve ntral maddeler

NaHCOj zeltisi ile ekstraksiyon

f I

1
Sulu faz Bazlar ve amfoter maddeler

pH 8'de organik zc ile ekstraksiyon

Sulu faz Kuvvetli asitler (A, fraksiyonu) (UV'de incelenir)

Organik faz zayf asitler

Organik faz Bazlar (B) fraksiyonu) (ITK,GC,GC/MS'de incelenir) hidroliz

Sulu faz Amfoter maddeler

NaOH ile ekstraksiyonu

pH 3'de HC1 ile hidroliz

Sulu faz Zayf asitler (A2 fraksiyonu) (UV'de incelenir)

Organik faz Ntral maddeler (C) fraksiyonu (TK,GC ve GC/MS'de incelenir)

1 1

PH 8.5-9.5 ayarlanr,

i
Organik zc ile ile ekstraksiyon

Organik faz amfoter maddeler (D) fraksiyonu (TLC,GC,GC/MS de incelenir.

ekil 4- Fraksiyonlu ekstraksiyonla organik zehirlerin ayrlmas.

43

a 3 ) Hidrofob ntral maddeler : Asit eterde znen maddeler, NaOH veya N a H C 0 3 ' l sulu faza geildikten sonra eter veya kloroform faznda ntral maddeler kalr. Bunlar organik fazda znebilme zelliinde

olduklarndan "hidrofob ntral maddeler " adn alrlar.(C fraksiyonu) Asetaniliid, asetofenetidin, amidopirin, antipirin, bromural, kafein, emetin, mebrobamat, fenil salisilat rnek verilebilir. B) Kalevi ortamda seyreltik N a O H ile kalevilendirilmi eter veya kloroforma geen bileikler : b) Kalevi zellikte maddeleri ierirler. Bir ok alkaloidler, amfetamin, amitriptilin, imipramin, kafein, kinin gibi azotlu bazlar bu gruba girerler. (B fraksiyonu) b 2 ) Sulu faz ise organik amfoter (morfin gibi) maddeleri ierir. Bu maddeler, sulu fazn konsantre HCI ile stlmasndan sonra, pH 8,5 - 9,5 da organik zc ile ekstrakte edilerek ayrlrlar (amfoter maddele : D fraksiyonu). ekil 4'de kan, idrar ve mide svsna uygulanan fraksiyonlu

ekstraksiyon emas ( sistemik ekstraksiyon ) gsterilmitir. 4.4. Enzim yklama yntemi ile organik zehirlerin izolasyon ve ayrlmalar Adli t o k s i k o l o j i d e , p o s t m o r t e m m i d e ierii, k a n v e idrardan

toksik m a d d e l e r y u k a r d a a k l a n a n e k s t r a k s i y o n y n t e m l e r i ile izole edilebildikleri gibi "immunoassay yntemleri" ile de dorudan

analizleri yaplabilir. A n c a k l m l e s o n u l a n a n olaylarda k a r a c i e r gibi d o k u rnekleri de analiz iin kullanlr. Dokulardan zehirlerin izolasyonunda kullanlan Stas-Otto ve

ekstraksiyon yntemi, klasik protein ktrme yntemleri yannda "enzimatik

44

yklama: dijestiyon yntemi" zehirlerin genel tarama yntemlerinde, n ilem olarak tercih edilen bir tekniktir. Bylece proteini uzaklatrlm doku fltratna sistematik ekstraksiyon uygulanabilir. Aada anabilim dalmzda eitli pestisit ve ilalarn karacier homojenatnda uygulanan "enzimatik

yklama" yntemi ksaca aklanmtr. (Ayrntl bilgi iin :Vural, N, Aksu, an, N., 1994'e baknz.) Enzimatik yklama ynteminin prensibi, plazma ve dokularda proteine balanm ilacn (protein-ila) proteolitik bir enzimle serbest hale

geirilmesinden sonra

ekstraksiyona tabi tutulmasdr. Bu amala papain,

tripsin, subtilisin gibi enzimler kullanlr. Bu enzimlerle doku homojenat, enzimin maksimum aktivite gsterdii optimum koullarda (rnein papain ve tripsin iin optimum pH 7-8, optimum scaklk 30C dir) belirli bir sre inkbe edilir. Teknik : Zehirlenme phesi ile alnan karacier dokusundan 5 gram kesit tartlarak, 10 ml su ile teflon balkl homojenizatrde homojenize edilir. Yklama iin papain kullanlacaksa, homojenata gram doku bana 500 mg papain (500 mg papain/g doku), 0,002 M EDTA ve 25 ml 0.02 M pH 7.4 olan fosfat tamponu ilave edilir. 37C de 2 saat termostatl alkalamal su banyosunda inkbe edilir. Tripsin kullanldnda 1 mg tripsin /g doku olarak enzim ve pH 7.4 olan fosfat tamponu kullanlr. nkbasyon 37C de 3 saat olarak uygulanr. nkbasyondan sonra karm 30 dakika elektrikli su banyosunda stlr ve szlr. Szntden genel ekstraksiyon emasna gre uucu olmayan organik zehirler (ve ilalarn) izolasyonu yaplr. zolasyon verimini arttrmak iin Amberlite XAD-2 (batch) yntemi ile ekstraksiyon yaplmas uygun olur. Aada bu yntem aklanmtr.

45

Amberlit XAD-2 ile organik zehirlerin ekstraksiyonu Polimerik zellikte adsorbanlarn zehirlerin biyolojik materyalden

izolasyonlar son 20-30 ylda nem kazanmtr. Amberlit XAD-2 porz ve hidrofobik zellie sahip olan apraz bal polistiren divinil benzen

polimeridir. 20-50 mesh byklnde, beyaz suda znmeyen krelerdir. Geni yzey alan ve noniyonik zellii nedeniyle bu reine suda znen organik maddeleri adsorbe eder. Bu adsorbe edilen maddeler polimerden uygun bir zc ile (elsyon zcs) geri elde edilebilirler (ele

edilebilirler). Amberlit XAD-2 reinesi ile ekstraksiyonda,

ekstraksiyon

verimi (1) biyolojik materyalin (idrar, kan, doku homojenatndan elde edilen szntnn ) pH'si; (2) numune (ml)/reine (g) oranna; (3) elsyon

zcsn polaritesine baldr. Amberlit XAD-2 ile izolasyon ve ekstraksiyon ilemi idrar, kan, safra suyu ve karacier homojenatna (dorudan veya enzimatik yk lama

ileminden sonra) veya biyolojik materyalden hazrlanan rnee reine ilave ederek (batch teknii) uygulanabilir. Aada batch yntemi aklanmtr. (Vural,N; Burgaz, S 1984; Vural, N; a n , N ; 1994).

Reinenin hazrlanmas : Amberlit XAD-2 reinesi en az 6 saat etil asetat ile srekli Soxhelet apareyinde ekstrakte edilerek saflatrlr. Sonra reine (1:1) orannda uzaklatrlr. lem st faz berraklancaya kadar (4-5 kez) tekrarlanr. Metanol uzaklatrmak iin 8-10 kez distile su ile ykanr. Reine az cam kapta distile su iinde +4C de saklanr. 5 gram karacierden hazrlanan homojenat, fltrat ve enzim

yklamasmdan elde edilen fltrat; veya idrarla allacaksa 20 ml 2500 rpm de santrifj edilerek berraklatrlan idrar rnei, 5.1 gram ya XAD-2 (g kuru reine karl) ieren polipropilen
4 6

tplere

konur.

Bazik

ilalarn

ekstraksiyonu iin ortamn pH's 0.01 N K 2 C 0 3 ile pH 10, ntral ilalar iin pH 7; asidik ilalar iin 0.1 N HCI ile pH 3, organik fosfat esterleri iin pH (2-3)'e ayarlanr. Karm 20 dakika alkalanr, 3 dakika 4000 rpm de

santrifj edilerek su faz ayrlr. Kalnt 2 kez (0.1 N HCI ve su ile) ykandktan sonra elsyon iin tpe 15 ml eter ve 5 ml 0.1 N HCI ilave ederek 20 dakika alkalanr. 5 dakika 4000 rpm de santrifj edilir. Elsyon zeltisi susuz Na 2 S04 den geirilerek uurulur. Kalntda kimyasal maddeler tarama yntemleri ile (TK ve GLK gibi) aranr. Amberlit XAD-2 ile bazik, ntral ve asidik ilalarn ou; pestisitlerden organik fosfat esterlerinin ekstraksiyonlarnda olduka yksek verim elde edilir. Amberlit XAD-2 dnda Dowex 50 AGW-X8 (100-200 mesh) batch teknii ile idrardan dipiridil grubu herbisitlerin ekstraksiyonunda

kullanlabilir. Katyon deitirici bir reine olan Zeokarb 225 (H + ) ise kolon teknii ise parakuat ve dikuatn idrardan ekstraksiyonunda kullanlabilen verimi daha yksek olan bir yntemdir. (Vural,N; Burgaz,S; 1984). ekil 5'da enzimatik yklama ve Amberlit XAD-2 batch teknii ile karacier homojenatndan organik zehirlerin izolasyonu ve ekstraksiyonlar iin kullanlan teknik ematik olarak gsterilmitir.

47

(5 g. Karacier + 10 ml su) homojenat

25 ml fosfat tamponu 0.02 M;pH 7.4

25 ml fosfat tamponu 0.02 M;pH 7.4

2.5 g. Papain +0.002 M EDTA

I I

veya

5 mg. trpsm

I I

37C de 2 saat inkbasyon

37C de 3 saat inkbasyon

'

T
30 dakika su banyosunda stma ve szme

'

i
Sznt + 5.1 g. Amberlit XAD-2, pH (asit, ntral ve bazlarn ekstraksiyon kouluna gre ) K 2 C0 3 veya 0 . 1 N HCI ile ayarlanr. 20 dak. alkalama, 23 dakika 4000 rpm de santrifj Kalnt O.INHCI ve su ile ykanr " ' S u faz atlr

i
Ekstraksiyon kouluna gre PH ayarlanarak 15 ml eterle Ekstraksiyon

zc Na 2 S0 4 ile kurutulur

Kalnt metanolde zlerek TK ve GK ile tarama ve identifkasyon

ekil 5 : Enzimatik yklama ve Amberlit XAD-2 "batch" yntemi ile organik zehirlerin karacierden izolasyonlar.
48

5. ZEHRLERN T A R A M A ve DENTFKASYONLARINDA KULLANILAN E N S T R U M E N T A L ANALZ TEKNKLER

Biyolojik materyalden daha nce aklanan yntemlerle izole edilen kimyasal maddelerin identifikasyonlar ve kesin tanmlarl, kantitatif

analizleri klinik toksikoloji ve adli toksikoloji asndan byk nem tar. Toksikolojik tarama testleri sonucunda, zehirlenmeye madde veya maddelerin belirlenmesi, zehirlenmenin neden olan

spesifik

(antidot)

tedavisinin yaplabilmesi iin gereklidir. Kimyasal maddelerin kan ve serum dzeylerinin kantitatif olarak saptanmas zehirlenmenin iddeti hakknda bilgi verir. Ayrca kantitatif analizin belirli aralarla yaplmas "teraptik ila izlenmesinde" de nemlidir. Dier taraftan kimyasal madde ve ilalarn toksikolojik tarama testleri sonucunda, analizin yorumu, bulunan madde cinsine gre deiir. rnein suistimal edilen veya bamlla neden olan bir maddenin kiinin o anda alnan idrar rneinde identifkasyonu, bamllk durumu ve kullanma skl ve ekil asndan bir bilgi vermez. Dier klinik bulgularla desteklenmesi gerekir. Forensik (adli) toksikolojik analizde, postmortem dokularda toksik maddelerin taranmas ve kantitatif analizi lm nedeninin aklanmasna

yardmc olur. Karbon monoksit, etil alkol, benzodiazepinler, antidepresanlar, d-propoksifen, asetaminofen, salisilatlar, barbitratlar gibi bir ok maddelerin postmortem analizleri bu nedenle nemlidir. Kimyasal maddelerin biyolojik materyalde identifikasyonlar ve

kantitatif analizlerinde kullanlan teknikleri aadaki ekilde sralayabiliriz:

49

1) Kromatografik Yntemler nce tabaka kromatografsi (TK) Gaz-kat ve gaz-sv kromatografsi (GK ve GSK) Yksek basnl sv kromatografsi (HPLC) 2) Spektroskopik Yntemler : Ultraviyole spektrofotometresi (UV-Spektrofotometre) Grnr alan spektrofotometresi (Visible spektrofotometre) Infrared spektrofotometresi (IR spektrofotometre) Emisyon spektrografisi Atomik absorbsiyon spektrofotometresi (AAS) Plazma emisyon spektrofotometresi (PES) Spektroflorimetri Ktle spektrometresi (MS) Ntron aktivasyon analizi (NAA) 3)Gaz kromatografisi-ktle spektrometresi (GK-MS) 4) Immunoassay teknikleri 5) Dier yntemler (Elektrometrik yntemler, optik kristallograf gibi) Yukarda ad geen teknikler, maddenin fzikokinyasal zelliklerine gre gelitirilmi enstrumental analiz yntemleridir. Bu yntemlerin prensibi, buna gre gelitirilen aletlerin yaps, kullanm ekilleri ve uygulamalar ile ilgili bilgiler baka derslerde ayrntl olarak verilmektedir. Bu nedenle, bu kitapta bu aletlerin rutin toksikolojik analizlerde kullanmlarndan

bahsedilecektir. 5.1 nce tabaka kromatografisi Kromatograf, kimyasal yaplar birbirine yakn madde karmlarnn birbirinden ayrlmasnda kullanlan bir tekniktir. Kromatograf deyimi, ilk kez

50

zolasyon ilemleri 1) Asidik ekstraktn hazrlanmas (ekstrakt A): 30 ml lik santrifj tp iine analizi yaplacak idrar rneinden 10 ml konur. 1 ml seyrettik

hidroklorik asit ve 10 ml kloroform ilave edilir. alkalayarak 5 dakika kartrlr ve 10 dakika santrifj edilir. Kloroform faz (alt faz ) 15 ml lik kapal bir cam tpe alnr. Ekstrakt su banyosunda 60C de hava akmnda kurulua kadar uurulur. 2) Bazik ekstraktn hazrlanmas (Ekstrakt B): drar rneinden 10 ml daha alnarak 30 ml lik dier bir santrifj tpne konur. 2 ml amonyum klorr tamponu ve 10 ml (kloroform:propan-2-ol:9:1) karm ilave edilir. 5 dakika alkalandktan sonra 10 dakika santrifj edilir. Organik faz (alt faz) 15 ml lik kapakl cam tpe aktarlr. 0.5 ml metanoll hidroklorik asit ilave edilir (uucu bazlarn kaybn nlemek iin). Ekstrakt 60C deki su banyosunda hava akmnda kurulua kadar uurulur. Mide ierii ekstraksiyonunun purifkasyonu Mide ierii, idrar rneine uygulanan ekilde ( ekstrakt A ve

ekstrakt B) uurma ilemine kadar hazrlanr. Ekstraktlara geebilen ve TK de interferansa neden olabilen maddelerin uzaklatrlmas iin daha ileri ekstraksiyonlarla aada aklanan ekilde purifkasyonu yaplr. 1) A ekstraktna (uurma ilemi yaplmadan nce) 5 ml seyreltik sodyum hidroksit; B ekstraktna 5 ml seyreltik hidroklorik asit ilave edilir; 5 dakika alkalandktan sonra (tercihan mekanik kartrc ile), 10 dakika santifj edilir. Organik fazlar atlr. 2) A ekstraktndan elde edilen sulu NaOH fazna 5 ml seyreltik hidroklorik asit; B ekstraktndan elde edilen sulu hidroklorik asit fazna 5 ml amonyum klorr tamponu ilave edilir. 5 dakika alkalandktan sonra

53

(tercihan mekanik kartrc ile) 10 dakika santrifj edilir. Organik fazlar atlr. 3) Ekstraktlar kurulua kadar 60C de hava akmnda uurulur. nce tabaka kromatograflsine uygulama : 1) Durucu faz olarak 20x20 cm boyutunda cam levha zerine 0.25 mm kalnlnda kaplanan silikagel G (20 pr tanecik byklnde) tabaka kullanlr. Silikagel ile kaplanm tabaka kurun kalemle 8 kolona ayrlr.

Tabakaya 1 cm ykseklikte hafif bir izgi izilir. Developman ykseklii 10 cm olarak iaretlenir. (ekil 6) 2) Numune ekstraktlar 100 pl (kloroform:propa-2-ol) karmnda zlr.25 pl ekstrakt A, 25 er pl ekstrakt B, ekilde grld numune uygulama yerlerine uygulanr. 3) Standart ila karmlarndan ekilde iaretlendii ekilde (asidik. bazik ve fenotiazin karmlar) 10 pl uygulanr. 4) Kurutulan tabaka (etil asetat: metanol: konsantre amonyum kolonlardaki

hidroksit: 85:10:5 ) karmndan oluan devolopman zeltisi ile devolope edilir. ( ekil 6 ) 5) aretlenen ykseklie kadar devolope edilen tabaka tanktan karlr ve eker ocakta hava akmnda kurutulur. 6) Kurutulmu tabaka UV de 254 nm ve 366 nm de incelenerek

floresan veren lekeler iaretlenir. 7) Tabaka ters evrilerek: a) 1 ve 2. kolonlara merkrz nitrat reaktifi; b) 3 ve 4. kolonlara asitlendirilmi iyodoplatinat reaktifi; c) 7 ve 8. kolonlara (500 ml/1) orannda sulandrlm slfrik asit pskrtlr (ekil 7).
54

A, 10 N L

A2 25 |0.1

B, 10 M L

B2 25 ( L O

B, 10 JlI.1

B2 25 M L

C 10 M L

B, 25 L0.1 |

... 0 1

O 2

0 3

...0

-0 5

...0

...0

0 S

ekil 6- la ekstraktlarnn TK ya uygulanmas N : Numune uygulama ( balang ) yeri; S : developman snr; A, Asidik karm ( 1 ) ; A 2 : Asidik numune ekstrakt ( 2 ); B 2 : Bazik ila karm ( ); B 2 : Bazik numune ekstrakt ( 4, 6, 8 ); C : Fenotiazinler karm

A,

A2

B,

B2

B,

B2

Mekrz Nitrat reaktif

Asitlendirilmi yodoplatinat Reaktifi

Mandelin Reaktifi

Slfirik asit
( 5 0 0 ml/1)

ekil 7- Kromatogramlarn pskrtme reaktifleriyle grnrletirilmesi.

55

Her reaktifle pskrtmede, pskrtme yaplmayacak kolonlar temiz bir cam levha ile maskelenir. (Reaktiflerin hepsi ok toksik olduundan,

pskrtme ilemi eker ocak iinde yaplmaldr.) 8) Pskrtmeden sonra hevha tekrar UV de (254 nm ve 366 nm de) incelenir. zellikle Mandelin reaktifi pskrtlen kolon nemlidir. 9) Mandelin reaktif ile elde edilen lekelerin rengi, gerekirse 100C de 10 dakika bir etvde bekletilerek rengin kuvvetlenmesi salanr. Elde edilen kromotogramlarn R deerleri ve renkleri standartlarla karlatrlr. Labratuvarmzda yaplan bir aratrmada asidik, bazik ve ntral

yapdaki ilalarn deiik developman sistemlerinde verdikleri R, deerleri ve renk reaksiyonlar Tablo 6'da gsterilmitir (anl, N., 1995). Bu tabloda I, II, III ve IV rakamlar sistemleri aada aklanmtr: 1: Etil asetat: metanol : deriik amonyak (85:10:5) II: Kloroform : aseton (4:1) III : Metanol : deriik amonyak (100 : 1,5) IV: Kloroform : metanol (90 : 10) ile gsterilen developman

56

Tablo 6 : Baz asidik, bazik ve ntral ilalarn TK verileri

la Ad Kullanlan Reaktif zc Sistemi (Rf)* I 0,52 0,14 II 0,20 0,06 Ak kahverengi Viyole Akkahveengi sar Ak sar floresans Kahverengi Koyu meneke Aksar kahverengi Kzl kahverengi Mor meneke Renk

Asetaminofen Salisilik asit

Metokarbamol

Indometasin

Fenobarbital

%5 FeC, %1 K M n 0 4 %5 FeC, %1 K M n 0 4 UV (254 nm) %1 K M n 0 4 Asidik iyodoplatinat zeltisi %1 K M n 0 4 Asidik iyodoplatinat zeltisi Cva Oksit / Difenilkarbazon

0,66

0,16

0,07

0,04

0,77

0,45

Asetil asit

Zvvikker salisilik UV (254 nm)

0,17

0,09

Pembe Ak sar floresans

Klorpromazin

Klorfeniramin maleat

Dragendorf Ninhidrin FPN Marquis Asidik iyodo platinat Dragendorf Ninhidrin FPN Marquis Asidik iyodo platinat Dragendorf Ninhidrin FPN Marquis Asidik iyodoplatinat Dragendorf Asidik iyodoplatinat i Asidik iyodoplatinat Ninhidrin

III 0.69

IV 0.44

0.46

0.24

Turuncu Ak sar Skleman pembe Pembe Koyu kahverengi Koyu turuncu Sar Ak mave Viyolo Kzl Kahverengi Turuncu Sar Mrekkep mavisi Mavi Kzl kahverengi Turuncu Kzl kahverengi Kahverengi Sar

Imipramin

0.55

0,47

Amitriptilin Niketamid

0,6 0,8

0,47 0,65

57

5.2.

UV

ve

grnr

alan

spektrofotometresinin

toksikolojik

analizlerde kullanlmas zel blmde maddelerin kantitatif analizlerinde UV (200-400 nm) ve grnr alan (400-800 nm) spektrofotometrisine dayanan yntemler

aklanmtr. Bu teknikte karlalan en byk sorun, analizi yaplacak madde dnda bulunabilecek maddelerin interferansdr. Bu nedenle nce analizi yaplacak madde veya maddelerin biyolojik materyalden izolasyonlar ve purifikasyonlar gerekir (ekstraksiyon, mikrodifzyon gibi yntemlerle). Spektrofotometrik analizlerde gvenilir sonu almada monokromatrn doru almas nemlidir. Monokromatrn kontrol, bilinen bir referans zeltisinin maksimum absorbanslar (A.*) llerek yaplr. Bu amala en ok sulu slfrik asitte (0.005 mol/1) hazrlanan % 0.6 lik (60.00 mg/l) potasyum dikrormat zeltisi kullanlr. Bu zeltinin 235 nm ; 257 nm; 313 nm ve 350 nm de gsterdii spesifik absorbanslar sras ile 124.5 ; 144.0; 48.6 ve 106.6 olmaldr. Ayrca spektrofotometre kvetlerinin standardizasyonu ve temizlii nemlidir. UV spektrofotometrelerinde kuartz, grnr alan spektrofotometrelerinde ise cam veya belirli zellikte plastik kvetler kulanlr. Spektrofotometrik analizde en nemli sorun, ekstraksiyon ilemi

srasnda beraber ekstrakte edilen endojen ve dier yabanc maddelerinin intereferans riskidir. Numune ekstraktnn UV spektrumunun incelenmesi

ekstraktn purfkasyonu hakknda bilgi verebilir. Mide ierii ekstrakt ve olay yerinden alnan rneklerin UV

spektrumlarnn incelenmesi kalitatif bilgi asndan yararl alabilir.

58

UV Spektrofotometresi ile ekstraksiyon fraksiyonlarnn taranmas

UV spektrofotometresi maddelerin kalitatif ve kantitatif analizinde kullanlr. Maddenin identifkasyonunda (nitel analizinde), o maddenin UV alannda maksimum absorbans gsterdii dalga boyu ( A.max) kullanlr. Ayrca maddenin spesifik ve molar absorbans ve minimum absorbsiyon gsterdii dalga boyundan da yararlanlabilir. Toksikolojik analizde, uucu olmayan organik maddelerin

izolasyonlarndan sonra

fraksiyonlara

ayrlan ekstraktlarn aada ksaca

akland ekilde UV spektrofotometresinde spektrumlar incelenir. Ancak biyolojik idrar, mide ierii ve kan ekstraktlar ile alldndan biyolojik

materyalde bulunan endojen maddelerin ila spektrumlarn interfere edecei bilinmelidir. zellikle postmortem toksikolojik analizlerde, eitli nedenle numune almnn gecikmesi, analizde yanltc olabilir. Bu nedenle

destekleyici deneylerin yaplmas gerekir. Bilinmeyen ila tabletleri veya biyolojik olmayan numunelerle daha gvenilir sonular alnr. Zayf asit (B) fraksiyonunun incelenmesi Sistematik ekstraksiyonda kuvvetli asitler ayrldktan sonra eter faznda 0,5 M NaOH ile ayrlan zayf asitleri ieren faznn (B fraksiyonu ) dorudan UV spektrofotometresinde spektrumu alnr. Blank (kr deney) olarak 0.5 M NaOH kullanlr. Ntral maddeleri ieren eter faz (C fraksiyonu uurulduktan sonra) 3 ml. kuru metanolde zlerek, 220 nm. ile 320 nm. arasnda taranr. Blank olarak metanol kullanlr.

59

Barbitratlarm aratrlmas:

Zehirlenmelerde babitrat

zehirlen-

melerine sklkla raslanr. B nedenle bilin kayb olan kiilerde ncelikle barbitratlar aranmaldr. Burada aklanm olan UV yntemi ile barbitratlarm birbirinden

ayrlmalar ve B fraksiyonuna geen dier maddelerin da taranmas yaplr. B fraksiyonunun UV spektrumlar farkl incelenir. 0.5 M NaOH ile ayrlan B fraksiyonunu (pH 13), UV spektrofotometresinde 220-400 nm arasnda 0,5 M NaOH'e kar (kr) taranr, maksimum pH'da (pH:13,10 ve <2)

absorbans gsteren dalga boylar kaydedilir. B fraksiyonu (numune) ve blank'a 1 ml %16 lk amonyum kloriir ilave edilerek pH 10'a drlr. 220-400 nm arasnda spektrumlar tekrar alnr. Kvette bulunan numune ve kre, birka damla 10 M slfirik asit ilave ederek PH nin 2 veya daha altnda olmas salanr. UV alannda ( 220 - 400 nm ) tarama tekrarlanr. Ekstraksiyon emasnda B fraksiyonuna geen maddelerin farkl PH'da maksimum absorbans gsterdikleri dalga boylar tablo 7 de gsterilmitir. (Moffat ve ark. 1986)
T a b l o 7- B fraksiyonuna geen maddelerin eitli pH'larda maksimum

a b s o r b a n s gsterdikleri dalga boylar (X) Madde X max (nm)

Klorpropamid Parasetamol Fenilbutazon Barbitratlar N-metil substite 5.5 substite S-substite

p H 13 232 257 264 246 254 303

PH o

264 246 239 303

pH < 2 232 245 237 absorbansn sonu absobansn sonu 285

60

C ve D fraksiyonlarnn incelenmesi: Ntral maddeleri ieren eter faz (C fraksiyonu uurulduktan sonra 3 ml kuru metanolde zlerek,220 nm ile 320 nm arasnda taranr. Blank olarak metanol kullanlr. Bazik maddeleri ieren kloroform faz (D fraksiyonu) uurulduktan

sonra kalnt 4 ml. 0.05 M slfrik asitle zlr. 220 - 360 nm. de UV'de taranr. Asitli numune seyreltik NaOH ile kalevi yapldktan sonra tekrar

taranr. Ayrca kalan zelti kloroformla ekstrakte edilerek UV'de ilem tekrarlanr. 5.3. Gaz kromatografisinin toksikolojik analizlerde kullanlmas Gaz kromatografisi analitik ve forensik toksikolojide biyolojik

materyalden izole edilen kimyasal maddelerin tarama testlerinde ve kantitatif analizlerinde kullanlr. ITK ve UV ile n taramalar yaplan maddelerin kalitatif analizlerinde gaz kromatografisi destekleyici (confirmatory) deney olarak nem tar. Gaz kromatografsinde hareketli faz gazdr. Sabit faz ise kolon iine yerletirilmi adsorban bir maddedir. Bu durumda gaz-kat kromatografisi

adn alan sistemde (GK) maddelerin ayrlmas adsorbsiyona dayanr ve daha ok basit gazlarn analizinde kullanlr. Gaz kromatografisinin daha ok kullanlan ekli gaz-sv kromatografisi (GSK) dir. Bu sistemde kolon iindeki yzeyi geni deaktive edilmi kat madde, kaynama noktas yksek yams bir sv ile kaplanr. Burada

maddelerin dalm katsaysna gre ayrlmalarn salayan bu sv - sabit faz grevini grr. 700'n stnde olan bu sv maddeler kaynama noktalar ve polaritelerine gre snflandrlmlardr. Maddelerin sistematik ayrlmasnda sabit faz maddesi ok nem tar.

61

Gaz

kromatografsinde

kolon

eidi

de

nem

tar.

Normal

kromatografk analizlerde dolgulu kolon kullanlr. Cam veya elik olan kolonlarn i ap 3.2 mm. ile 4 mm.; d aplar 3.2 mm. ile 6.4 mm.;

uzunluklar da 0.5 m. ile 4 m. arasnda deiir. Kapiler kolonlarla ayrma ilemi daha etkin olur. Alkonma zaman (Retention time) maddeler ayrlabilirler. Kapiler kolonlar ok ince ok yakn olan

(0.2 mm-0.5 mm. i

apnda) ve ok uzundurlar (10 m. - 60 m. uzunluunda) . Toksikolojik analizlerde (Head - Space) denilen dzenekleri ieren gaz kromatografsi tekniinden de ok yararlanlr. Bu teknikle dorudan kan, serum gibi biyolojik svlarda uucu maddelerin identifkasyonlar yaplabilir ve bu ekilde kolon materyalinin kirlenmesi minimuma indirgenir. Kk bir cam tpe (7 ml. kadar sv alabilecek byklkte), 0.2 - 0.5 ml. numune konur, az politetrafloroetilen yapsnda bir kapakla skca kapatlr. Bu ekilde hazrlanan numuneler kromatograftaki "head-space" dzeneine

yerletirilerek uygun bir scaklkta 10 dakika dengeye braklr. Bylece uucu madde gaz fazna gemi olur. Bu gaz fazndaki numune minimum otomatik sistemle kolona enjekte edilir. Bu dzenekle kanda alkol ve dier uucu bileikleri, evlerde vernik, cila gibi karmlarn iindeki uucu maddelerin analizleri yaplabilir. Gaz kromatografisinde maddelerin ayrlmasnda sv fazn cinsi, tayc gazn hz, kolonun etkinlii, boyutlar ve scakl, kullanlan detektr tipi rol oynayan nemli faktrler arasndadr. Gaz kromatografsi ayrca kantitatif amala da kullanlr.

(Uygulama ile ilgili rnekler zel blmde verilmitir).

62

Biyolojik materyalden izole edilmi zehirlerin gaz kromatografisi ile taranmalar Daha nce bahsedilen izolasyon (ekstraksiyon) ileminden sonra uucu olmayan organik zehirlerin gaz kromatografisi ile ayrlmasnda en ok dimetilsilikon durucu faz (SE-30; OV-17; OV-lOl) kullanlr. Uucu

aminlerin ayrlmasnda ise potasyum hidroksitle kaplanm Apiezon L gibi alkali kolonlar etkili olur. Detektr olarak en ok Alev yonlatrc Detektr (FID: Flame Ionization Detector) kullanlr. Gaz sv kromatografisi uucu olan maddelerin (gazlar ve svlar) taranmasnda da uygun bir yntemdir. Gaz kromatografsinde maddelerin ayrlmas kaydedici ile kaydedilir. Elde edilen kromatogramda maddeler ayn koullarda standartlarla elde edilen kromatogramla karlatrlr. Bu

karlatrmada en nemli kriter alkonma zaman (Retention time) dr. Kantitatif analiz ise elde edilen "piklerin" bykl eitli yntemlerle llerek ve i veya d Standard kullanarak yaplr. 5.4 Yksek basnl sv kromatografisi Yksek basnl sv kromatografisi (HPLC) ayrma gc ve duyarll gaz kromatografisine gre daha yksek olan bir tekniktir. lk kez 1969'da kullanlmaya balanmtr. 1970'lerin sonunda rutin analiz yapan pek ok labaratuvarda kullanma gemitir. HPLC, stn kromatografisinin bir eklidir. Baz ynleri ile gaz kromatografisine benzemesine karn (kalitatif ve kantitatif tayinin ayn ilemle gerekletirilmesi, karmdaki maddelerin ayr ayr pikler vermesi gibi), mobil fazn sv olmas ve yksek basncn gl bir pompayla salanmas bakmndan gaz kromatografisinden ayrlr. Gl bir pompa ve basnca dayankl bir sistemle mobil fazn kolonda bulunan sabit fazdan geii kolaylamakta ve ksa zamanda bu ayrlma salanabilmektedir. Mobil faz

63

olarak kullanlan zc nce gl bir pompa yardm ile tm sistemden geirilir. Daha sonra ayrlmas istenen karm, bir mikroenjektrle sisteme verilir. Mobil fazla srklenen maddeler kolona geerler, kolonda (sabit faz ierir) maddeler dalm, adsorbsiyon, iyon deitirme zelliklerine gre ayrlrlar. Kolonu bu ekilde terkeden maddeler gaz kromatografsinde

olduu gibi uygun bir detektrle (UY absorbsiyonu, refraksiyon, floresans len) kalitatif ve kantitatif deerlendirmeleri (kaydedici ile piklerden alnan kromatogramlar ile) yaplr. HPLC'nin gaz kromatografsine gre stnl, daha iyi bir ayrma ve duyarlk dnda, bozunan maddeler, iyonik maddeler ve yksek molekl arlkl maddelerin (proteinler, peptitler gibi) analizinde kullanlabilmesidir. Toksikolojik analizlerde HPLC'nin geni bir uygulama alan vardr. Bir ok organik zclerin biyolojik izlenmelerinde (metil alkol, benzen, toluen. ksilen gibi), fenolik maddelerin birbirlerinden ayrlmalarnda (fenol ve

krezoller gibi) HPLC tercih edilmektedir (zel blme baknz). 5.5. Atomik absorbsiyon spektrofotometresi ( AAS ) 1955 spektroskopisi atomlarnn ylndan (AAS) sonra yksek gelitirilmi scaklkta nlar gaz olan atomik absorbsiyon element

halinde

bulunan

elektromagnetik

absorblamas

zerine

kurulmutur.

Absorblanan elektromagnetik nlar genellikle ultravyiole ve grnr alan nlardr. AAS, genelde alev spektroskopisinin bir eklidir. Alev spektroskopisi, serbest atomlar zerine kurulmu bir spektroskopi daldr. Alev

spektroskopisinde, molekler spektroskopide grlen absorbsiyon bantlar yerine absorbsiyon ve emisyon izgileri grlr. Serbest atomlar elde etmek iin madde ya alevde veya bir elektrik dzeneinde stlr. Bunun iin analiz yaplacak elementi bileik halinde
64

(tuzu) ieren zelti, zel bir dzenekle ok kk krecikler halinde alev iine pskrtlr. Alev iine pskrtlen zeltinin nce suyu buharlar, geride kalan tuzlar gaz moleklleri haline dnrler. Gaz halindeki tuz moleklleri ise ayrarak serbest element atomlarn verirler. Gaz halindeki atomlarn alev scaklnda termal enerji absorblamas ve ondan sonra absorblad enerjiyi ksmen veya tamamen spektral izgi halinde vermesi olay atomik emisyon veya alev emisyon spektroskopisi adn alr. Alev iinde bulunan, bir atom trnn, dardan baka bir kaynaktan alev iine gnderilen kendine zg n demetini ksmen absorblamas ve geride kalan karekteristik n iddetinin derecesini lme zerine kurulmu

spektroskopi dalna da atomik absorbsiyon spektroskopisi denir. Bu amala gelitirilmi cihazlara da atomik absorbsiyon spektrofotometresi (AAS) ad verilir. AAS, adli bilimlerde (patlayc madde kalntsnda antimon, baryum, kurun gibi elementlerin identifkasyonunda), adli ve analitik toksikolojide ar metal zehirlenmelerinin biyolojik materyalde tayininde sk kullanlan bir cihazdr. Ayrca ar metallere mesleksel maruziyetin biyolojik izlenmesinde de kullanlr. 5.6 Ntron aktivasyon analizi ( NAA )

Ntron aktivasyon analizi dier spektroskopik yntemlerden farkldr. NAA birok elemente uygulanabilen hassas bir elementel analiz yntemidir. Prensibi :Numune, nkleer bir reaktrn merkezi gibi yava hareketli bir ntron (termal ntron) kaynann iine yerletirilir. Bu ntronlarn ou atomun ekirdekleri ile birleerek stabil olmayan veya radyoaktif ekirdekler (radyo izotoplar) olutururlar. Bu radyoaktif atomlarn oluumu aktivasyon basamadr. Bu basamaktan sonra, rnek reaktrden karlr ve gama (y) n spektrometresine yerletirilir.
65

Aktivasyon

basamanda

oluan

readyoaktif ekirdek bozunarak kendine zg enerji ile birlikte

yaynlar. Bu gama n spektrumunun incelenmesi ile numunedeki elementin identifkasyonu ve miktar tayini yaplr. NAA, yksek spesifiktik, dayankllk (her metal iin deil) ve miktar tayinine imkan veren bir yntemdir. Ancak pahal ve komplike bir teknik olduu iin ancak bu konuda gelimi zel laboratuvarlarda bulunur. (De Frost, P. ve ark. 1983 ; baknz). NAA ile zamanmzda yaklak 77 element tayin edilebilmektedir. Yntem sulara, kayalara, arkeolojik maddelere, alamlara ve biyolojik numunelere uygulanabilmektedir. Adli toksikolojide uygulamasna tarihi bir rnek olarak, Napolyon Bonapart'n sa rneinin N A A ile tayini rnek verilebilir. N A A yntemi ile arseniin deteksiyon limiti (1 ng), A A S ' e gre (100 ng/ml) daha duyarldr. Ancak N A A ile deteksiyon limitinin duyarl, AAS ile karlatrldnda, element cinsine gre deiir. rnein AAS ile kurun analizinde dedeksiyon limiti (2 pg/ml) N A A ' y e gre (0.1 pg) daha duyarldr. (Fazla bilgi iin baknz: Gndz,T. 1988 ve Piemento G. ve ark. 1986) 5.7. mmunoassay'n toksikolojik analizlerde kullanlmas "mmunoassay" biyolojik svlarda ilalarn dorudan analizine ksa zamanda imkan veren (antijen-antikor) reaksiyonlarna dayanan yntemlerdir. "Teraptik ila izlenmesinde", bamllk yapan maddelerin ve ila Piemento G. ve ark. 1987; Gndz, T., 1988'e

suistimalinin idrarda (snrl olarak kanda) aranmas ve akut zehirlenmelerin aratrlmasnda yntemlerinden uygulanmaktadr. 1960'l yllarn (RIA) banda immunoassay Daha sonraki

"radyoimmunoassay"

biliniyordu.

gelimelerle eitli immunoassay teknikleri ortaya kmtr.

66

nmunoassay tekniinin prensibi : Bu yntemde analizi yaplacak maddeye (antijen) kar gelitirilen spesifik "antikor" ve analizi yaplacak bu maddenin iaretlenmi ekli kullanlr. Tayini yaplacak molekllere kar antikorlarn elde edilmesi immunoassayin en nemli blmdr. Genel olarak ilalarn molekl arl ok dk olduundan antijen zellii gstermezler. Bu nedenle gerekli antikoru elde etmek iin enjeksiyondan nce ila-protein konjugat hazrlanr. ounlukla bu amala albumin kullanlr. Bylece ila taycya balanarak kendisi iin spesifik antikor hazrlanmasna uygun hale getirilir. Burada ila "hapten", ila-protein konjugat ise "immunojen" zellii gsterir. Analizi yaplacak kimyasal maddeyi (ilac) ieren biyolojik svya, belirli konsantrasyonda antikor vs iaretlenmi ila ilave edildiinde

karmla aadaki reaksiyon gerekleir: la + la + Antikor > [la?* - Antikor] + [ la - Antikor]

Antikor yarmal olarak serbest iaretlenmi ila (ila*) ve analizi yaplacak ilala kompleks (bal ila) oluturur. Bu karmda "bal

iaretlenmi ila" molekllerinin, "bal iaretlenmemi ila" molekllerine oran serbest ilacn miktar ile ters orantldr. Uygun bir analitik yntemle lm yaplr ve sonular kalibrasyon grafii ile karlatrlr. Kalibrasyon grafii ila konsantrasyonuna kar bal ila) tayin edilerek hazrlanr. eitli tek-

"bal iaretli ilacn" oran (% mmunoassay

snflandrlmas: lacn iaretlenmesi

niklerle yaplr. mmunoassay teknikleri bu iaretleme yntemlerine gre de bir ok alt snflara ayrlr: Radyo immunoassay (RIA) : Antijen radyoaktif madde ile iaretlenir. Miktar tayini radyoaktivite llmesi ile yaplr.

67

Enzim immunoassay (EIA) : aretleme enzim ile yaplr. Enzim aktivitesi tayin edilerek analizi yaplacak maddenin miktar saptanr. Floro immunoassay (FIA) : aretleme florofor bir madde ile yaplr. Miktar tayini spektroflorimetre ile saptanr. mmuno kemiluminesans : aretleme kemiluminesans veren bir madde ile yaplr. mmunoassay teknii, karma dorudan uygulanabiliyorsa "homojen immunoassay" ; eer karmdan iaretli ilacn ayrlmasndan sonra analitik yntem uygulanabiliyorsa "homojen immunoassay" ad verilir. RIA heterojen; EIA, FIA ise homojen immunoassay'lere rnek verilebilir. Radiyoimmunoassay'da analiz yntemi radyoaktivitenin llmesine

dayanr. Bu amala (3- veya y- n veren radyoaktivite (3- sv sintilasyon saycs; yalnz y- n veren radyoaktivite ise y- kat sintilasyon saycs ile llr. Enzim veya floresan bir madde ile iaretleme yaplan immunoassay yntemleri ile lme ise ultraviyole absorbsiyonunun, floresans veya

luminesansn llmesine dayanr. ad verilir.

Bu yntemlere de "optik immunoassay"

Aada baz nemli immunoassay yntemlerinin prensibi ve uygulama alanlar ksaca aklanmtr. Radyoimmunoassay (RIA) Radyoimmunoassay, reaksiyonlarda yntemdir. RIA kullanlarak ilk kez radyoaktif maddelerin 1959 ylnda atomlarn miktar immuno-kimyasal yapld tayini iin

tayinlerinin inslin

plazmada

kullanlmtr. Daha sonra bu teknik klasik biyokimyasal yntemlerle tayini mmkn olmayan ve vucutta ok dk miktarlarda bulunan (10"' - 10 1

68

gram gibi) 250 den fazla biyokimyasal maddelere uygulanmtr. Snrl da olsa biyolojik svlarda ila analizinde de (amfetaminler, barbitratlar,

digoksin, metadon, morfin, nikotin, penisilinler, fenitoin, tetrahidrokannabinol, tbokrarin gibi) kullanlmaktadar. RIA yntemi duyarl, rikro bir

yntem olup 10-100 pl numuneye n ilem uygulanmadan madde analizine imkan vermektedir. Bu nedenle zamanmzda endokrinoloji, farmakoloji, toksikoloji alanlarnda kullanm artmaktadr. RIA Ynteminin prensibi ve uygulama teknii: Radyoimmunoassay ynteminde temel komponentler: Analizi yaplacak maddenin (ilacn) uygun bir radyoizotopla iaretlenmi analiz yaplacak madde (ila) ile hazrlanm standartlar, bu ilaca kar nceden hazrlanm antikor ieren antiserumdur. lacn radyoaktif izotopla iaretlenmesinde en ok trityum (3 H ), karbon14 (
14

C) ve iyot-125 ( l 2 5 1) kullanlr. Bu radyoizotoplarda trityum ve karbon

- 14, |3- mas, iyot-125 ise X ve y nlar yaynlar. Ancak az sayda ila moleklnde iyot bulunduundan, sentez srasnda molekln iyotlu trevi hazrlanr. rnein 1-125 ile iaretli digoksin hazrlanmasnda moleklne iyot ilave edilmi tirozinle digoksin trevi hazrlanr. Uygulamada, bir tpe belirli bir miktarda antikor ve belirli miktardaki radyoaktif iaretlenmi ila (standart) ve analizi yaplacak ila ieren numune (serum veya idrar) bir tpe konur. Bu karmda, iaretli ve iaretlenmemi

ila ayn antikora balanmak iin yarrlar. aretsiz ilacn miktar ne kadar oksa, o kadar az iaretli ila antikorla balanr. Bu nedenle radyoaktif iaretlenmi bal ila molekllerin miktar iaretlenmemi ila molekllerinin miktar ile ters orantldr. Karmda reaksiyon dengeye ulanca, ayrma ilemine geilir (heterojen immunoassay). RIA tekniinde, ilacn

69

konsantrasyonu,

antikorla

bal

iaretlenmi

ilacn

veya

serbest

ilacn

radyoaktivitesinin llmesine dayanr. Radyoaktivite lmnde (sv sintilasyon veya y- saycs) serbest veya bal ilacn ayrm yaplamaz. ulam karma ayrma Bu nedenle yukarda aklanan ve dengeye uygulanr. Bu amala aktif kmrle

ilemi

adsorbsiyon, ift antikor teknii gibi yntemler uygulanr. Radyoaktivite lm bu ayrma ileminden sonra yaplr. Bu yntem "heterojen

Immunoassay'e de rnektir (Fazla bilgi iin Moffat A.C. ve ark. 1988'e baknz). Optik immunoassay'ler : Optik immunoassay'ler RIA'ya gre birok stnlk tar. Bu yntemlerde kullanlan reaktifler dayankldr ve ayrma ilemi yaplmakszn analiz yaplabilir. aretleme enzimlerle, floresan ve kemilmnesan maddelerle yaplabilir ve bu nedenle uygulama alanlar daha genitir. Analitik yntemler maddenin optik zelliine (ultraviyole,

absorpsiyonu, bulanklk, floresans) dayand iin bu yntemlere "optik ummunoassay'ler"ad verilmitir. Bunlar iinde en ok kullanlan enzim immunoassay (E I A) ve floresans immunoassay (F I A) yntemlerinden bahsedilecektir. Enzim mmunoassay ( E I A ) : Yarmal bir reaksiyon kinetiine dayanan E I A, ilk kez 1971 ylnda kullanlmtr. Rutin analizlere de E I A, daha duyarl bir analiz E 1 A

homojen bir yntem olarak uygulanan

istendiinde serbest ve bal ilacn ayrlmasna dayanan heterojen olarak uygulanr. Homojen

E I A' da analiz yaplacak ila, uygun bir enzimle kovalan ilalarn, astma ilalarnn,

olarak iaretlenir. Bu yntemle antiepileptik

antineoplastik ilalarn, suistimal edilen ve bamllk yapan bir ok ilalarn

70

analizi yaplabilir. Syva firmas EMIT (Enzyme Multipled Technique) patenti altnda bu yntemi gelitirmitir. Bu yntemin dayand biyokimyasal

immunoassay

prensipti) enzimle iaret-

lenmi ilaa kar gelitirmi antikora balanarak inaktive olur ; 2) arkadan ok az serbest ila veya metaboliti de yarmal olarak balanarak, antikor tarafndan inaktive edilen enzim indklenir. Enzimin aktivitesi analizi

yaplacak serbest ila konsantrasyonu ile orantldr. Bu nedenle karmda enzim aktivitesinin lmnden ila konsantrasyonuna geilir. ekil 8 : d e homojen immunosay teknii (EMIT) ematik olarak gsterilmitir.

aretlenmi ila

naktif enzim ekil 8- Homojen EMIT teknii

Aktif e n z i m

Floroimmunoassay

(FIA)

teknikleri : Floresans veren bileiklerin

immunokimyasal iaretleyici olarak kullanlabilecei ilk kez 1941 ylnda ortaya atlmtr. Analizi yaplacak maddenin floresans zelliindeki

deimelere dayanan bu yntemde madde florofor bir molekl ile iaretlenir. Floresan izotiyosiyanat, rodamin B, izotiyosiyanat, umbelliferon gibi florofor maddeler iaretlemede kullanlr. Floresans immunoassay, enzim

71

immunoassay'e gre daha duyarldr. Uygulama ekline gre eitli teknikler kullanlr. Homojen floroimmunoassay yntemleri iinde substratla iaretlenmi floroimmunoassay teknii ticari olarak gelitirilmitir. Bu teknik florofor maddeyi serbest hale geiren bir enzim kullanlr. Analizi yaplacak ila standart florojen bir madde ile (rnein (3-galaktoz-umbelliferon) ile

iaretlenir. Bu madde enzim substratdr. Florojen madde ile iaretlenmi ilata floresans maskelenmitir. Ancak ilave edilen enzimle, floresans rten molekl florojen moleklden ayrldktan sonra iaretlenmi ila floresan zellik gsterir. rnein burada yukarda ad geen florojen madde

kullanldnda enzim olarak (3-galaktosidaz enzimi kullanlr. (3-galaktosidoz hidrolizle florojen maddeden [3-galaktozun ayrlmasn salar. Bylece iaretli ilacn floresan zellii aa kar. laca kar gelitirilmi antikorla balanmak iin iaretli ila ve

numunedeki serbest ila yarr. Enzim antikorla bal iaretli ilac kataliz edemez. Ancak balanmam ilac hidroliz eder. Bu nedenle floresans zellii aa kan ilacn floresans iddeti numunedeki ila konsantrasyonu ile doru orantldr. Floresans polarizasyon immunoassay (FPI) teknii: Bu teknikte,

bal ve serbest florofor moleklle iaretlenmi ilacn polarize k dzlemini evirme fark llr. Ik polarize edici bir mercek veya prizma aracl ile demet halinde dz bir zemin zerine drlir. iaretli ila zerine drldnde n iddeti Polarize k, floroforla (eksitasyon) molekl Floresans eksitasyon

tarafndan polarize k dzleminde emisyon yapar.

nna dik olarak giden emisyon nnn llmesi ile saptanr. Floresans mekanizmas ile ilk defa 1970 ylnda Dandliker ve arkadalar tarafndan

72

denenmitir. Floresans veren bir maddeyle (florofor) iaretlenmi olan ila serbest halde iken ok yava bir floresans polarizasyonu yapar. Antikorla balandktan sonra kompleks molekln hareketi yavalar ve floresans

polarizasyonu artar. Polarizasyondaki bu deiim ila konsantrasyonu ile orantldr. Yntem otomasyona yakndr. lk kez 1981 ylnda Abbot firmas tarafndan bu yntem otomasyona adapte edilmitir. TDX cihaz bilinen bu cihaz "teraptik ila izlenmesi" ve bir ok ilalarla olarak akut

zehirlenmelerde ila dzeylerinin tayininde kullanlmaktadr. (Deniz, G.. Sayg, , 1989; Kp, ; Vural, N, 1992). Bu teknikte duyarllk olduka

yksektir. rnein serum digoksin dzeyinin llmesinde duyarln 0.2 ng/ml olduu bildirilmitir. Immunoassay'n uygulama alanlar mmunoassay tekniklerinden RIA, zellikle kardiyak glikozitler,

inslin, lizerjid, kannabioids ve opiatlar gibi kanda konsantrasyonlar dk ilalarn analizinde veya numune miktarnn az olduu edilen yntemdir. RIA ile pg/ml (10
12

durumlarda

tercih

g/ml) duyarlkta analiz yaplabilir.

9

EMIT ile duyarlk daha dktr (ng/ml. 10 immunoassay ayrca ila

g/ml). taranmasnda, akut zehir-

suistimalinin

lenmelerin analitik olarak aratrlmasnda ve teraptik ila izlenmesinde kullanlrlar. stenilen duyarlk ve spesifklie gre RIA, EMIT veya FPI

teknikleri seilebilir. Bu yntemler yar veya tam otomatik dzeneklere adapte edilmitir. Genel olarak RIA ve EMIT idrarda ok eitli ila analizi iin

uygundur. Ancak gelitirilen eitli antikorlar dier ilalarla apraz reaksiyon verirler. Geni bir spesifklii olan antikor, numunede olan bir veya birden fazla ayn grup ilala balanabilir. Bunu ayrd etmek iin her ila ve

73

metaboliti yksek basnl sv kromatografsi (HPLC) ile fraksiyonlara ayrlarak immunoassay yntemine adapte edilebilir. Akut zehirlenmelerde immunoassay uygulanmasnda da benzeri grubu de

interferans olabilir. rnein ilalarn EMIT antikorla

akut zehirlenmelerde

benzodiazepin

ile taranmasnda farmakolojik olarak aktif metabolitler Tek bir ilacn birden fazla metabolitinin

etkileirler.

apraz

reaksiyon vermesi, sonucun yorumlanmasn zorlatrr. Zorluuna karn, benzodiazepinleri immunoassay yntemi ile ayrt etmek mmkn olduu halde, barbitratlar ancak grup olarak tayin edilebilir. Bu durumda pozitif sonu alndnda, dier yntemlerle hangi barbitrat olduu ayrt edilmelidir. Teraptik ila izlenmesinde ise immunoassay ile aminoglikozit

antibiyotikleri iin abuk ve kesin sonular alnabilir. Sonu olarak immunoassay ile kan ve idrarda yukarda belirtilen amalarla ila analizinde hzl, duyarl ve kesin sonular alnabilir. Ancak her yntemin (RIA, EMIT, FPI) uygulama alan ve analitik zelliklerini bilerek semek gerekir.

74

 N E M L ZEHRLERN BYOLOJK M A T E R Y A L D E ANALZLER

Blm
maddelerin verilecektir.

2.
biyolojik Ayrca

Bu blmde akut zehirlenmelerde, endstride ve yakn evrede eitli nedenlerle materyalde maruz kalnan ve baz nemli kimyasal yer

kalitatif

kantitatif

analizlerine

maddelerin biyolojik izlenmelerinde kullanlan metabolit ve biyokimyasal parametrelerin analizine de o madde ile ilgili yerde deinilecektir. Biyolojik materyal olarak rutin analizlerde en ok idrar ve kan rneinden yararlanlr. Toksik madde konsantrasyonu 24 saatlik toplanan idrarda yaplmaldr. Ancak pratik olarak bu mmkn olmadndan o anda alnan rnekte -spot rnek- analiz gerekletirilmektedir. Ayrca mesleki

maruziyetlerde baz ksenobiyotik veya metabolitleri maruziyet srasnda veya naruziyetten hemen sonra atlrlar. O anda idrarla atlan madde

konsantrasyonuna etki eden dilsyon etkisinin dzeltilmesi gerekir. Bu nedenle de bulunan konsantrasyon deerlerinin ya idrarn standart zgl arlna (1.024) gre veya (g) idrar kreatinin miktarna gre dzeltilmesi gerekir. Kreatinine gre dzeltme yapldnda "spot idrar" rneinde

kreatinin tayini yaplmaldr. Standard zgl arla gre dzeltmede ise idrarn younluu llmelidir, ( Trevisan, A., 1990 ) Bu blmde idrarda kreatinin tayini ve idrar ksenobiyotik dzeyinin kreatinine gre dzeltilmesi aklanmtr.

drarda kreatinin tayini Kreatinin idrarda dorudan spektrofotometrik yntemle tayin

edilebilmektedir. Pikrik asitle oluturduu renkli bileiin absorbans 530 nm

75

de spektrofotometrede okunur ve kalibrasyon erisinden kreatinin miktar tayin edilir (Baselt, R.C. 1980). Uygulama : 5 ml idrar rnei 2000 devirle 15 dakika santifj edilerek szlr. Bu szntden 0.1 ml. alnarak distile su ile 8.0 ml'ye tamamlanr (dilsyon oran 1:80). Seyreltilen zeltiden 5 ml alnr, 2.5 ml suda doymu pikrik asit (% 1.175 lik) ve 0.5 ml %10 luk NaOH zeltisi ilave edilir. Karm reaksiyonun tamamlanmas iin 10 dakika bekletilir ve 15 dakika iinde 530 Standardlarla nm de spektrofotometrede kre kar absorbans hazrlanan kalibrasyon erisinden absorbansa kar okunur. gelen

konsantrasyon okunur. Kalibrasyon dorusunun hazrlanmas: Standart kreatinin zeltisi, stok kreatin zeltisinin seyreltilmesi ile hazrlanr. Stok zelti, 0,1 zldkten sonra gram kreatinin bir miktar 0,1 N HCI iinde

0,1 N HCI ile 100 ml 'ye tamamlanarak hazrlanr.

zeltiye koruyucu olarak 2-3 damla toluen katlr ve buz dolabnda saklanr (Stok zelti: 100 mg kreatin in/100 ml). Standard kreatinin zeltileri ise, stok zeltiden sra ile

25;50;75;100 ve 125 (il alnarak distile su ile 5 ml'ye tamamlanarak hazrlanr. Bylece 0,5mg/100 ml; I mg/100 ml; 1,5 mg/lOOml; 2 mg/ 100 ml ve 2,5 mg / 100 ml 'lik kreatinin Standard zeltileri elde edilir. 5 ml Standard zeltilere 2,5 ml pikrik asit zeltisi ve 0,5 ml % 10 NaOH zeltisi ilave edilerek yukarda akland ekilde 10 dakika

bekledikten sonra 530 nm de absorbanslar kre kar okunur. Konsantrasyona kar okunan absorbanslar iaretlenerek kalibrasyon dorusu hazrlanr. Kreatinine gre dzeltme: drarda konsantrasyonu tayin edilen bir maddenin, kreatinine gre dzeltmesi aadaki rnekle aklanmtr.

76

rnek : Alnan anlk

(spot) idrar rneinde florr konsantrasyonu

1.227 mg/1 ve kreatinin ise 1.315 g/l bulunmu olsun. Bulunan florr dzeyi gram kreatinine gre dzeltildiinde : 1000 1.227 mg/1 x 1315 Genel olarak kreatinin miktar 0,5 g/l altnda (ok seyreltik idrar) ve 3 g/l stnde (ok konsantre) bulunan idrarlarda kreatinine gre dzeltilme = 0,933 mg F/g kreatinin deeri bulunur.

yaplmaz ve deerlendirmeye alnmaz (Trevisan, A., 1990). 1. UUCU ZEHRLER 1.1. Karbon monoksit (CO) Karbon monoksit ile zehirlenme solunum yolu ile olur. Endstride balca maruziyet kaynaklarn havagaz, sentetik gaz (su gaz), jeneratr frnlar, egzos gaz ve tam yanmam yaktlarn duman oluturur.

Diklorometan maruziyetinde de metabolizmas sonucu invivo CO oluur. Endstri dnda otomobil egzos gazlar, snmada kullanlan tam ve iyi yanmayan yakt sistemleri yangn srasnda oluan dumanlar karbon monoksit kaynadr. Ayrca sigara duman da aktif ve pasif iici olarak kiilerin C O ' e maruz kalmasna neden olur. Karbon monoksit kanda hemoglobin ile birleerek karboksihemoglobin (COHb) meydana getirir. Kanda oksijen yerine karbonmonoksitle birleen hemoglobin yzdesine "karboksihemoglobin satrasyon % si" denmektedir. Kanda COHb satrasyonu %20 stnde olduunda akut zehirlenme belirtileri balar. Bu deer %60'a ulatnda koma ve lm grlebilir. Sigara

ienlerde COHb yzdesi, iilen sigara miktarna gre % 3-8 arasnda deiir. ok fazla (gnde 30-50 sigara) ienlerde ise bu deer %10 COHb dzeyini

77

aabilir. Karbonmonoksit zehirlenmesinin iddeti

kanda % COHb tayini ile

belirlenir. Endstride CO'e maruziyet derecesinin biyolojik izlenmesi kandaki COHb veya ekspirasyon havasnda CO tayini ile yaplr. Ayrca i yeri ortamnda (evresel izleme) CO tayin edilmelidir. Kanda (n deneyler) i) ki kk porselen kapsl alnr. Birine 1 ml zehirlenme phesi olan kan, dierine 1 ml normal kan konur ve su banyosunda yavaa stlr. Normal kan kmrleerek kahverengi-siyah renk ald halde, dieri tula krmzs renkte kalr (duyarlk % 40 COHb satrasyonudur). ii) 1 damla, nmune kan, bir tpte 10-15 ml su ile seyreltilir. Ayn ekilde seyreltilmi normal kan ile karlatrlr. Karbonmonoksit bulunan kann rengi pembedir (duyarlk %50 satrasyonudur). iii) Yukarda akland ekilde seyreltilen kan nmunelerine, 5 er damla %20 NaOH ilave edilerek kartrlr. Normal kan, hemen saman sars renge dnt halde CO ieren kan pembe rengini bir sre devam eder. Pembe rengin iddeti miktar ile orantl olduundan kantitatif tayin de %20 ve stnde COHb satrasyonunun saptanmas

yaplabilir. Bu deney CO iin zel olup, duyarl %20 COHb satrasyonudur. Pirotannik asitle COHb %'si tayini (yar kantitatif) Yar kantitatif zel bir deney olan bu testle %20 ve stndeki COHb satrasyonu saptanabilir Bunun iin 1 ml kan cam kapakl 25 ml lik bir tp veya mezr iinde 9 ml su ile seyreltilir. 10 ml pirotannik asit zeltisi ilave edilir. Tpn az kapatlr ve alkalandktan sonra 15 dakika bekletilir. Normal kan gri kahverengi bir kelek verdii halde, CO ihtiva eden kan pembe renk alr. Rengin iddeti satrasyon derecesine baldr. Renk iddeti belli miktarda CO ihtiva eden kan nmuneleri ile hazrlanm standartlarla karlatralarak miktar tayini yaplr.

78

Not : a) Pirotannik asit hazrlanmas : 1 g pirogallik (pyrogallic) asit ve 1 g tannik (tannic) asit 100 ml suda zlr. b) C O ihtiva e d e n k a n standardlarnn h a z r l a n m a s : N o r m a l k a n % 1 0 0 C O H b v e r e c e k ekilde saf C O ile d o y u r u l u r % 2 0 - 1 0 0 ihtiva e d e n standardlar u y g u n m i k t a r d a n o r m a l k a n l a COHb

seyreltilerek ihtiva

hazrlanr. D e n e y k s m n d a o l d u u gibi, n o r m a l k a n ve C O H b

e d e n standart kanlarla, p i r o t a n n i k asitle k t r m e ilemi yaplr. B u standartlar azlar sk kapal olarak karanlkta saklanrsa 6 ay

b o z u l m a d a n kalabilir. Spektroskopik yntemle COHb analizi COHb tayininde absorbsiyon spektrumuna dayanan yntemler 1900'l yllardan beri kullanlmaktadr. Bu yntemler hemoglobin (Hb) bileiklerinin (Hb,0 2 Hb, MetHb ve COHb gibi) Soret band (410-430 nm) ve grnen alanda verdikleri

absorbsiyon bandlarna dayanmaktadr. Kanda COHb analizinde kullanlan en eski yntem spektroskopik

yntemlerdir. COHb sar-yeil alanda (568 ve 538 nm de) 2 absorbsiyon izgisi verir. Kann uygun bir ekilde dilsyonu ile bu absorbsiyon izgileri grlebilir. Normal kanda ise 0 2 H b ile ilgili daha uzun dalga boylarnda

(576 ve 541 nm'de) maksimum absorbans grlr. Kanda COHb %40 ve stnde olduunda COHb'ne ait absorbsiyon izgileri, 0 2 H b yannda ayrd edilebilir, ancak yeterli derecede tannamaz. Bu nedenle oksihemoglobini hemoglobine indirgeyen maddeler kullanlr. Bu ekilde 0 2 Hb'nin absorbsiyon bandlar kaybolur ve yerine 555 nm de

maksimum absorbans gsteren Hb band ortaya kar. Bu ekilde COHb absorbsiyon bandlar daha iyi grlr.

79

Teknik : COHb aranacak kan ve normal kan rnekleri su, %0.1 amonyak veya %0.1 sodyumbikarbonat ( N a H C 0 3 ) zeltisi ile (1:100)

orannda seyreltilir. Spektroskopla (bu amala Winkel-Zeiss el spektroskopu veya Hardridge Reversion spektroskoplar kullanlabilir) absorbsiyon bandlar grlen dalga boylar incelenir. Seyreltilmi 20 ml kan rneklerine 10 mg sodyum ditiyonit (Na 2 S 2 0 4 ) v 5-10 damla taze hazrlanm amonyum slfr zeltisi ilave edilir.

ndirgeme ileminden sonra [Ul][U2]tekrar spektroskopla incelenir. COHb mevcudiyetinde COHb absorbsiyon bandlar daha iyi seilir. Bu yntemle %20 COHb ve st tayin (yar kantitatif) edilebilir (Graf. E. ve Preuss F.R. 1969) Spektroskopik yntemle COHb tayini; otopsi banda (el spektroskopu kullanarak) yaplabilir. Bu ekilde CO zehirlenmesi hakknda abuk bilgi edinilmesi asndan (n deney olarak) nem tar. Spektrofotometrik yntemlerle COHb tayini Hemoglobin ve trevlerinin Soret bandnda (400-430 nm) ve grnr alanda verdikleri karekteristik absorbsiyon bandlarndan yararlanarak kanda COHb identifikasyonu ve miktar tayini yaplabilir. Alkali zeltide

oksihemoglobin 576-578 ve 540-542 nm. de; karboksihemoglobin 538-540 nm'de maksimum absorbans verir. ndirgenmi hemoglobin (Hb) ise 555

nm'de geni bir band gsterir. Zayf bir alkali seyreltilmi kan rnei sodyum ditiyonit gibi bir indirgen ilavesinde 0 2 H b (varsa methemoglobin: MetHb) indirgenmi hemoglobin (Hb) ne dnr, COHb etkilenmez. COHb satrasyon yzdesinin tayininde kullanlan birok

spektrofotometrik yntemler bulunmaktadr. Bu yntemlerin dayand genel prensip, 2 veya daha fazla seilmi dalga boylarnda; veya seilen tek dalga boyunda absorbansn okunmas arkadan karmda bulunan ve istenilen Hb

80

bileiini deitiren uygun bir kimyasal madde ilavesinden sonra seilen tek dalga boyunun llmesine dayanmaktadr. Aradaki absorbans fark ve oranndan yararlanarak COHb yzdesi hesaplanr. Burada, laboratuvarmzda aratrmalarda kullandmz mikrospektrofotometrik bir yntem olan Buchwarld yntemi ile; postmortem kan olan

rneklerine de uygulanabilen

klasik bir spektrofotometrik yntem

Dubowski yntemi aklanacaktr. i) Modifiye Buchwald yntemi (mikrospektrofotometrik yntemi) Bu yntemin prensibi COHb, Soret bandnda %100 0 2 H b ne kar %100 COHb ieren kan ve analizi yaplacak kann 414 nm, 421 nm ve 428 nm de absorbanslarnn lmne dayanr. 414 ve 428 nm sras ile 0 2 H b ve COHb nin maksimum absorbans gsterdikleri dalga boyunu; 421 nm ise O^Hb'ne kar COHb'nin gsterdii maksimum absorbans farkdr (resultant absorbans, ekil 9). Teknik: 0.02 ml heparinize kan rnei bir balon jojede seyreltik amonyak ile (younluu 0.88 olan 1 ml amonyak deiyonize su ile 800 ml ye seyreltilir) 26 ml ye tamamlanr. Karm alt st edilerek homojenize edilir. Seyreltilen kan zeltisinden 6'a ml alnarak 3 ' e blnr: a) lk 6 ml dorudan doruya spektrofotometrede lm iin konur kvete

(numune: I) ve az skca kapatlr, b) kinci 6 ml kan rnei bir

deney tpne aktarlr ve iinden 15 dakika oksijen gaz geirilir (%100 0 2 H b , II no.lu tp), c) nc 6 ml dier bir tpe konur iinden 2 dakika saf CO gaz geirilir (% 100 COHb, III no.lu tp). II ve III no.lu tpler sepektrofotometre kvetlerine konularak, %100 O.Hb referans olmak zere, numune (I) ve %100 COHb'nin (III)

absorbanslar (a ve A) 414, 421 ve 428 nm de spektrofotometrede okunur.

81

COHb (428 nm) COHb (421 nm)

0 , H b ( 4 1 5 nm)

A. nm

ekil 9- Soret bandnda 0 2 Hb, COHb ve OjHb'ne kar COHb (diferansiyel) spektumlar. Deerlendirme eitlikten hesaplanr: % COHb = 100 a, /A 3 burada, a, ve A m aadaki eitliklerden bulunur: a, = a 4 2 - 1 / 2 (a4i4+428) : Numunenin ierdii % COHb oran aadaki

Am = A 4 2 | - 1 / 2 (a4i 4 + a 42 g) Yntemin standardizasyonu : 1) Yukarda akland ekilde hazrlanan % 100 0 2 H b ve % COHb ieren kan rneklerinin absorbanslar suya kar spektrofotometrede 400-430 nm de taranarak, maksimum absorbans

gsterdikleri dalga boylan saptanr. Bu dalga boylar (Kak) % 0 2 Hb iin 414 nm, % 100 COHb iin 428 nm olmaldr. 2) Oksijen ve CO, saf olmaldr. Bu amala hazrlanm gaz tplerinden (LB % 999 saflkta) yararlanlr.

82

3) Mikrobir yntem olduu

iin kan rnekleri

parmak

uundan

heparinize kapiler tpler iine alnarak tplerin iki ucu parafilm ile skca kapatlr. Analize kadar buz dolabnda (+4 C de) saklanr. Yntemin duyarl ve pratiklii nedeni ile mesleksel C O ' e maruziyetin biyolojik izlenmesinde de kullanlabilir (Vural,N., Motaceded,Z. 1978). 4) Kullanlan spektrofotometrede, 2 nm den daha kk dalga boyu aralklarnda absorbans llebilmelidir. ii) Dubowski yntemi Yntemin prensibi: Seyreltik kan hemolizatna sodyum ditionit ilave edildiinde oksihemoglobin ve methemoglobin indirgenir, karboksihemog lobin ise etkilenmez. zeltinin absorbans 480 ve 555 nm de llr, absorbanslarn (A) A 555 / A4g0 oran hesaplanr. % COHb konsantrasyonu, COHb standardlar ile hazrlanan kalibrasyon grafiginden bulunur. Kan rnekleri: Heparinize kan tercih edilir. Az skca kapatlan kan rnekleri buzdolab scaklnda uzun bir sore saklanabilir. Teknik : 0.5 ml kan rnei, 10 ml seyreltik amonyum hidroksitle (14.3 ml konsantre NH 4 OH su ile 1 litreye tamamlanr) seyreltilir, kartrlr ve hemoliz tamamlanncaya kadar beklenir. Seyreltik kan spektrofotometrenin kvetine konur, 10 mg sodyum ditiyonit (Na 2 S 2 0 4 ) ilave edilir, kartrlr. Seyreltik amonyaa kar (kr) numunenin 555 ve 480 nm'de absorbans (A) okunur. Absorbans oran (A 555 /A48o) hesaplanr ve karboksihemoglobin

konsantrasyonu kalibrasyon dorusundan tayin edilir.

Kalibrasyon dorusu iin COHb standardlar hazrlanr:

Yakn

zamanda karbonmonoksite maruz kalmam ve sigara imeyen kiilerden kan rnekleri salanr. Kan rneklerinden 10 ml kadar, iki burgulu kapakl 500 ml lik reaktif ielerine konur.ielerin birinin iinden en az 30 dakika saf

83

oksijen gaz (saf 0 2 tp: LB%99.9 gibi) geirilir. Bylece % 100 0 2 H b (%0 COHb) standard hazrlanm olur. Dier ieden benzer ekilde saf CO gaz kk saf CO tp

kullanarak (LB % 99.9 CO gibi) geirilir. (CO gaz geirken CO tp zaman zaman alkalanmaldr. Gaz geirme ilemi eker ocak iinde yaplmaldr). Bylece %100 COHb standard hazrlanm olur. Hazrlanan % 100 0 2 H b ve % 100 COHb kan standardlarndan 0.05 ml alnarak, yukarda akland ekilde, amonyakla seyreltilip, sodyum ditiyonit ilave edildikten sonra spektrofotometrede amonyaa kar 555 ve 480 nin de absorbanslar okunur. Her iki standardn absorbans oranlar (A 555 / A48o) hesaplanr. Absorbans oran %100 0 2 H b iin 3.1; %100 COHb iin 1.95 civarnda olmaldr. Kalibrasyon grafii dorusal olduu iin iki nokta genelde oranlarda

yeterlidir. Ancak istenirse, %100 0 2 H b ve % COHb belirli

kartrlarak ara standardlar (%80; %50; %20 gibi) hazrlanabilir. Grafik % C O H b oranna kar absorbans oranlar iaretlenerek hazrlanr. Daha pratik fakat daha az kesin olacak standardlar u ekilde de hazrlanabilir: Kan rnekleri amonyakla seyreltildikten sonra iki tpe blnr vebirinden 2 dakika CO ve dierinden 2 dakika 0 2 geirilir (%100 COHb ve % 100 0 2 H b standardlar). Yntemin uygulanmasnda dikkat edilecek noktalar: 1) Kalibrasyon iin hazrlanan her COHb standard ile en az 3 lm yaplmaldr. 2) Numuneler az sk ekilde kapal helyum gaz altnda bil irse daha uzun zaman korunurlar. saklana-

84

3) ok duyarl almalarda ara COHb standardlar hazrlanrken (%0 ve % 100 dnda ) nce %100 COHb standardnda serbest bulunabilecek CO'in 5 dakika azot gaz geirilerek uzaklatrlmas gerekir. 4) Kullanlan spektrofotometrede, 2 nm 'den daha kk dalga boyu aralklarnda absorbans llebilmelidir. Kalibrasyon filtreleri ve

spektrofotometre standardlar ile kullanlan cihazn dalga boylan ve dier karakteristikleri kontrol edilmelidir. 5) Bu yntemle %1 ve altndaki COHb dzeyi llebilir. Heparinize postmortem kan rneklerine de uygulanabildii iin adli toksikoloji

labrotuarlarnda kullanlabilir. Dier bir spektrofotometrik yntemle C O H b tayini Heparinize (veya edetik asit, florr, okzalat da kullanlabilir) tam kana uygulanan bu yntemde 540 ve 579 nm'deki absorbanslar kullanlmaktadr.. Prensip olarak bir nce aklanan yntemle ayn olmakla beraber uygulamas daha pratiktir (Flanagan , R.J. ve ark.). Teknik : 0.2 ml kan rnei, 25 ml seyreltik amonyum hidroksit iine (1 ml /1 su) ilave edilir ve kartrlr. Seyreltilmi kan rnei eit olarak 3'e ayrlarak az kapakl tplere konur (a, b, c) . lk tpn iinden 5-10 dakika saf CO veya CO/N 2 gaz

geirilir. Kpk olumamasna dikkat edilir, (a tp : % 100 COHb). nc tp (c tp) iinden 10 dakika saf oksijen gaz veya basnl hava geirilir (% 100 0 2 Hb veya % 0 COHb). kinci tp (b tp) COHb tayini kullanlr. Her tpe de 20 mg kadar sodyum ditionit ilave ederek kartrlr. Ayrca 10 ml amonyum hidroksit zeltisi ieren dier bir tp (kr) iine de sodyum ditionit ilave edilerek iyice kartrlr.

85

a, b ve c tplerindeki zeltilerin absorbanslar (A) 540 nm ve 579 nm de ditionitle ilem grm amonyak zeltisine kar okunur. Sonucun deerlendirilmesi : Numune kandaki (b tp) COHb yzdesi aadaki eitlikten hesaplanr: ( A54o / A579 a tp ) - ( A540 / A579 c tp ) % COHb =
( A 5 4 o / A579 b t p ) - ( A 5 4 0 / A579 C t p )

Yntemle ilgili uyarlar : 1)

%100 COHb ile absorbans oran ile ise absorbans oran 1.1

(A54o / A579 a tp) yaklak 1.5; %0 COHb olmaldr.

Kiilerin Hb miktar farkl olduu iin n deneme ile bu orann

salanmasnda yukarda verilen seyreltme orann deitirme gerei olabilir. 2) Bu yntem MetHb (580-600 nm mak. absorbans) oran yksek olduunda, gvenilir deildir. 3) Lipemik kan bulank zeltiler verebilir. Bu nedenle sonu gvenilir olmaz. 4) Maksimum absorbans farknn alnd bu deneyde (COHb : A, max 540 nm) ve 0 2 H b ve COHb iin eit olan dk dalga boyu (izobestik nokta : 579 nm) spektrumda dik bir dmenin noktasnda olduu iin seilmitir. Dalga boyu ok kritiktir. Bu nedenle aadaki kontroln yaplmas gerekir: a) %0 COHb ieren (a tpndeki) zeltinin absorbans oran (A 540
/A579), 1.1 o l m a l d r .

b) Eer bu gzlenemezse, aletin dalga boyu ayarlanr veya her zeltinin (a,b,c) spektrumlar alnarak lmler buna gre yaplr. ekil 10 ve 11 de 0 2 H b ve COHb nin, grnr alandaki absorbsiyon spektrumlar ve aklanan yntemlerde kullanlan maksimum absorbans dalga boylar gsterilmitir.

86

ekil -10. Dubowski ynteminde kullanlan (COHb ve 0 2 Hb (A) ve sodyum ditiyonitle ilem grm COHb ve 0 2 Hb (HHb'ye dnr) spektrumlar

ekil 11- Grnr alanda maksimum fark ve iyobestik noktadan yararlanlarak COHb tayini.

87

Conway Mikrodifzyon Yntemi ile CO tayini Bu yntem yar kantitatif veya kantitatif olarak kanda COHb tayini

iin kullanlabilir. Yntemin prensibi, kana ilave edilen asit etkisi ile, kandan aa kan CO'in palladyum klorrle (PdCI 2 ) reaksiyona girerek metalik Pd'u aa karmasna dayanr: PdCl 2 + CO + H 2 0 - > Pd + 2 HCI + C 0 2 Yar kantitatif tayin : Mikrodifzyon apareyinin (ekil 3) d oda0.001 N PdCI 2

cna 1 ml kan ve 2 ml %10 H2 S 0 4 konur. odaca 2 ml

konduktan sonra, daha nce ok hafif yalanm kapak hemen skca kapatlr. Kr deney olarak, ilemler d odaca konan CO'e maruz kalmam kiiden alnan kan rneine parelel olarak uygulanr. Yar kantitatif tayin iin, %10 ile %50 arasnda COHb ieren kan rnekleri ile (%10 COHb; %20 COHb ve %50 COHb standardlar) paralel uygulama yaplr. Oluan metalik palladyumun verdii renk iddeti

numunenin verdii renk ile karlatrlr. Karm oda scaklnda 2 saat bekletilir. Bu sre iinde i odackta CO miktarna bal olarak aa kan Pd, ince siyah bir zar eklinde i odacktaki PdCI 2 zerinde toplanr. Kantitatif tayin : Conway mikrodifzyon yntemi ile kandaki CO miktar (hacmen) kantitatif olarak da tayin edilebilir. Ancak bu durumda, kanda Hb tayini de yaplarak COHb miktarnn hesaplanmas gerekir. Genel olarak 1 gram hemoglobin (Hb) 1.34 ml (baz kaynaklarda 1.36 ml) CO gaz ile (O 0 C de 760 mm Hg basncnda) birletii kabul edilir. Bu bilgiden hareketle, Conway yntemi ile tayin edilen % C O (hacmen) miktarndan:

88

% CO (hacmen) % COHb = % Hb (kan) x 1.34 (Fazla bilgi iin Feldstein, M., 1967; Curry A.S. 1972'e baknz.) forml ile hesaplanr.

CO oximeter Kanda COHb miktarnn %10'un altnda olmas halinde de

uygulanabilir bir yntemdir. Ayrca kan rneklerinin

taze veya postmortem

olmas analiz sonucunu etkilememektedir. COHb miktarnn abuk ve gvenli ekilde llmesini mmkn klan bu cihazn prensibi, zel bir absorbsiyon spektrofotometresi olup, internal analog bir bilgisayarla kombine edilmitir. Otomatik olarak seyreltilerek hemoliz edilen kan rneinin 548, 568 ve 578 nu'de aksorbanslar llr. lmler ok ksa zamanda (15 saniye gibi), dijital gstergede % Hb, % 0 2 H b ve % COHb eklinde okunur. Bulunmas muhtemel olan MetHb'nin bozucu etkisi sodyum bislfit ilavesi ile giderilir. Bu amala gelitirilmi otomatik cihaz (CO Oximeter II 182) gelimi labratuarlarda COHb tayini iin kullanlmaktadr.

% C O H b dzeyinin yorumu : Karbon monoksitle akut zehirlenmede ba ars, bulant, kusma, hiperventilasyon, kardiyak aritmi, pulmoner dem, koma ve akut bbrek yetmezlii balca grlen belirtilerdir. iddetli hipoksi durumunda bile cilt ve mukozalar pembe kalr. lm solunum yetmezlii sonucu olaan kandaki COHb dzeyinin yorumu aadaki Tablo 10'da gsterilmitir.

89

T a b l o 10 % C O H b deerinin klinik y o r u m u . % COHb Belirtiler

3-8 < 15 20 20-50 > 50

Sigara ienler (20-30 sigara/gn) ok sigara ienler (30-50 sigara/gn) Akut zehirlenme balangc (kalp hastalar iin tehlikeli Ar akut zehirlenme (mental ve fi-ziksel koordinasyon kayb) Koma, konvuliziyon, kalp ve solunum durmas, lm.

CO uygulanr.

zehirlenmesinin

tedavisinde

antidot

olarak

oksijen

tedavisi

Anabilim dalmzda yaplan bir aratrmada, Dubovvski yntemi ile CO'le zehirlenme sonucu len 18 kiide postmortem COHb dzeyi tayin edilmitir. Bu kiilerde COHb dzeyi ortalama (%73.11 6.90) ve aralk (%63.00-%88.00) bulunmutur. Sigara imeyen kiilerde (n:44), COHb

dzeyi drtalama 0.890.05 (aralk: %0.50-%1.40 COHb); 1 paketten fazla (gnde 20 taneden fazla) sigara ienlerde ise ortalama % C O H b 4.360.14 (aralk: %3.40-5.00 COHb) olarak saptanmtr (Vural,N., Kahraman R. 1994)

1.2 Siyanr Siyanrle zehirlenme hidrosiyanik asitin (HCN) inhalasyonu veya

NaCN, KCN gibi tuzlarnn oral yolla alnmas ile oluur. Bir ok bitki dokusunda, eftali, kays gibi meyvelerin ekirdeklerinde, lima fasulyesinde bulunan siyanogenetik glikozitler (amigdalin gibi) hidrolizle invivo olarak siyanr verirler. Etil tiyosiyanat ve metil tiyosiyanat gibi tiyosiyant esterleri organizmada metabolize olarak siyanr verirler ve ciddi zehirlenmelere yol aabilirler.

90

Siyanr ayrca sodyum nitroprusiyat (vazodilatr) ve baz organik nitril bileiklerinin de metabolitidir. Potasyum ferrisiyanr gibi kompleks siyanr bileikleri ise invivo siyanr vermezler ve bu adan toksisiteleri ok dktr. Siyanr bileikleri, endstride metal cilas, altn gm gibi metallerin zenginletirilmesinde ve metallerin elektrolizle kaplanmasnda, fotoraflk gibi eitli i kollarnda kullanrlar. zellikleri : HCN ok uucu bir svdr (k.n. 26C) ; KCN ve NaCN kristal tuzlardr ve alkali reaksiyon gsterirler. Toksik dozlar (MLD 70 kg insanda) HCN iin 100 mg; KCN iin 150 mg ve NaCN iin 200 mg'dr. Siyanrle zehirlenmelerde, kanda siyanr, lm olaylarnda ise ayrca dokularda siyanr aranr. Mide ieriinde, kaltitatif analiz iin bir ok renk reaksiyonlar vardr. Doku ve vcut svlarnda dorudan siyanr aranmas Schnbein deneyi : Kan, mide ierii veya dokulara dorudan

uygulanan bu yntemde, erit halinde kesilmi filtre kad nce %10 alkoll gayak reinesi ve arkadan %0.1 lik bakr-2- slfat zeltisi ile emprenye (10 g kadar) kk bir balona

edilir. Siyanr aranacak biyolojik materyal

konur ve asetik asitle asitlendirilir. Az skca kapatlarak emprenye flitre kad kapakla birlikte yerletirilir. Kaynar su banyosu Siyanr mevcudiyetinde emprenye kadn zerinde stlr. (guayak

renginin mavilemesi

mavisi) siyanr olabileceini gsterir. Bu yntem ok duyarldr. 100 gr maddedeki 0.005 mg siyanr tannabilir. Ancak dier oksidanlarla (hidrojen peroksit, ozon, klor, azot oksitleri gibi) da pozitif sonu alnr. Renk olumas hemen veya miktara bal olarak 15 dakika iinde grlr.

91

Distilatta siyanr aranmas Siyanr biyolojik materyalden asit ortamda su buhar distilasyonu ile izole edilir. (Genel blme baknz) Distilat siyanr kaybn nlemek iin, %10 NaOH iinde toplanr. Distilatta siyanr aadaki renk reaksiyonlar ile aranr. zopurpurik asit deneyi : 4 ml alkali distilata 3 ml doymu pikrik asit ilave edilir ve hafife stlr. Meydana gelen krmz renk (purpurik asit) siyanr varln gsterir. Kreatin ve kan ekeri de bu reaksiyon sonu verir. Prusya (Berlin) mavisi reaksiyonu ile siyanr aranmas : 5 ml distilat (dorudan mide ierii de olabilir), 1 ml %15 NaOH ile ile pozitif

kalevilendirilir. 3 damla taze hazrlanm %10 demir -2- slfat (ferrz slfat) ve 3 damla taze hazrlanm %3 demir -3- klorr (ferriklorr) ilave edilir.

Karm kaynama noktasna kadar stlr ve soutulur. Kahverengi demir hidroksit znnceya kadar karma konsantre HCI ilave edilir. Mavi renk (Berlin mavisi) olumas siyanrn bulunduunu gsterir. Mavi renk zamanla kelek haline geer. Bu yntemle 20 (J.g HCN / ml tannabilir. Siyanr iin spesifik bir

testtir. Bu reaksiyonda nce oluan demir hidroksit ortamda bulunan siyanr iyonu ile ferrosiyanr kompleksini verir. Fe (OH), +6 CN" > Fe ( C N V 4 + 2 OH"

Ferrosiyanr, seyreltik demir -3- klorr zeltisi ile ferrik ferrosiyanrden ibaret nce kolloidal sonra tpn dibine ken mavi renkli ince kelek verir (Berlin mavisi): 3 Fe (CN)"64 + 4 Fe +3 > Fe4 [ Fe (CN) 6 ] 3

92

Mikrodifzyon yntemi ile siyanr tayini Kantitatif tayinde heparinize tam kan (0.1 -10 ml) kullanlr. Analizde herhangi bir gecikme durumunda, kan rnei +4C da 1-2 gn saklanabilir. (Siyanr, kanda oda scaklnda veya -20 C de daha az dayankldr). Convvay mikrodifzyon apareyi ile siyanr tayininde deiik renk reaktifleri (en eskisi FeS0 4 / HCI in kullanld Feldstein-Klendshoj yntemi; p-nitrobenzaldehit /O-dinitrobenzen yntemi ve piridin/barbitrik asit

yntemi) kullanlabilir. i) p-Nitrobenzaldehit /O - dinitrobenzen yntemi 3 tane mikrodifzyon apareyi kullanlr. Bunlardan birincisi (kr) olarak, ikincisi Standard siyanr zeltisi ile, ncs de numune ile

allmak zere hazrlanr. Bu amala, her mikrodifzyon apareyinin i odacna : a ) 0.5 ml p - nitrobenzaldehit (0.05 mol /1, 2-metoksietanolde

hazrlanm) zeltisi; b ) 0,5 ml 0- dinitrobenzen zeltisi (0.05 mol /1, 2-metoksietanolde hazrlanm) ; c) 0.1 ml NaOH zeltisi (0.5 mol/l) ilave edilir. D odacklara ise sras ile 0.1 ml saf distile su (kr deney); 0.1 m 10 mg/l KCN zeltisi (4 mg/m siyanr iyonu ieren standart) ve nc apareyin d odacna da 0.1 ml kan numunesi ilave edilir. Her d odaca 0.5 ml saf su ve odacn kar tarafna 1.0 ml seyreltik slfirik asit (3.6 mol/l) konur. Apareylerin kapaklar vazelin (veya silikon ya) ile yalanarak

kapatlr ve d odacktaki zeltiler dikkatle kartrlr. Oda scaklnda 20 dakika inkbasyona braklr. Arkadan i odacklara 1 ml sulu metanol (1:1) ilave edilir.

95

 odacktaki karm, 5.0 ml lik balonjojelere aktarlarak sulu metanol (1:1) ile 5.0 ml'ye tamamlanr. Oluan krmz renk 15 dakika dayanr. Standart siyanr ve numuneyi ieren karmlarn absorbans 560 nm de kre kar bir spektrofotometrede okunur. Numune kandaki siyanr konsantrasyonu standart siyanr zeltisini ieren karmn absorbansn karlatrarak hesaplanr. Bu yntemin

duyarl 0.5 mg/1 siyanrdr. ii) Piridin/barbitrik asit yntemi Kullanlan reaktifler 1) Seyreltik sodyum hidroksit zeltisi (0.1 mol/l) 2) Kloramin T zeltisi (2.5g/l; kat kloramin T dayankl deildir. Bu nedenle ambalaj sk sk deitirilmelidir). 3) Sodyum hidrojen ortafosfat zeltisi (fosfat tamponu; 1 mol/l). 4) Piridin-barbitrik asit reaktifi : 6 g barbitrik asit, 6 ml konsantre hidroklorik asit iinde kartrlr (d: 1.18) ve 30 ml piridin ile seyreltilir. zelti su ile 100 ml ye seyreltilir. Bu zelti taze hazrlanmaldr. 5) Seyreltik slfirik asit (1 mol/l suda). Standard siyanr zeltisi : nce 50 mg potasyum siyanr 100 ml seyreltik sodyum hidroksit (0.1 mol/l) iinde zlerek stok zelti hazrlanr. Bu zelti 200 mg/l siyanr iyonu ierir. Kalibrasyon iin Standard siyanr zeltisi, stok zeltinin (200 mg siyanr/l), seyreltik sodyum hidroksit ile (0.1 mol/l), (1:99) orannda

seyreltilmesi ile hazrlanr. Bu zelti 2 mg siyanr/l ierir. Teknik: Kantitatif tayini iin (7) mikrodifzyon apareyi kullanlmas nerilir. (Flanagan R.J., ve ark. W H O 1985). Ancak eldeki olanaklara gre daha az sayda Conway mikrodifzyon hcresi de olabilir. 1 den 7 ye kadar numaralandrlan apareylerin i odacklarna 0.1 mol/l NaOH zeltisinden

96

2'er ml ilave edilir. D odacklara ise aadaki tablo miktarlarda reaktifler konur.

11 gsterilen

T a b l o 11- Piridin-barbitrik asit yntemi ile s i y a n r t a y i n i n d e kullanlan reaktif miktarlar ( ml ) D odack N o 1 (kr) 2 (numune) 3 (numune) 4 (CN 0.2 m g / 1 ) 5(CN 1.0mg/l)

C N standard*

Su 2.0 1.0 1.0 1.9 1.5 1.0

~

Slflrik asit (1 m o l / 1 ) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Kan
~

1.0 1.0
~

0.1 0.5 1.0 2.0

6 (CN 2.0 m g / l ) 7 (CN 4.0 m g / l )

D odaca slfrik

asit zeltisi ilave ederken nce ilave edilen

reaktiflerle karmamas iin odacn kar tarafna ilave edilir. Apareyin az yalanarak skca kapatlr, dikkatle d odacktaki reaktiflerin karmas braklr. nkbasyondan sonra i odacklardaki zeltiden 1 'er ml alnarak 1 den 7 ye kadar numaral kapakl tplere aktarlr. Sras ile 2 ml fosfat tamponu , 1 ml kloramin T zeltisi, 3 ml piridin - barbitrik asit reaktifi ilave edilerek kartrlr. Oda scaklnda 10 dakika bekletilir. Siyanr varlnda krmz-mavi renk oluur. Bu rengin absorbans spektrofotometrede 587 nm de hazrlanan kre kar okunur. Standartlarla salanr ve oda scaklnda 4 saat inkbasyona

97

hazrlanan hesaplanr.

kalibrasyon

erisinden

numunedeki

siyanr

konsantrasyonu

Yntemin duyarl 0.2 mg/l siyanrdr. (Bu yntemde kat kloramin T nin dayankl olmamas nedeni ile sk sk yeni ambalaj kullanlmal; piridinbarbitrik asit reaktifi her deneyde yeniden hazrlanmaldr). Analiz sonucunun deerlendirilmesi Siyanrle zehirlenmenin tans, HCN veya tuzlarna maruz kalma hakknda bilgi olmadnda zordur. Kusmukta siyanrn kendisine zg kokusunun alglanmas tanmlanmada yardmc olabilir. Normal kiilerin kannda 100 ml de 15 mikrograma (pg) kadar siyanr bulunabilir. Fazla sigara ienlerde bu deer 30 pg/100 ml ye kabilir. Siyanr tuzlar (oral yol) ve HCN ile (inhalasyon yolu) ciddi zehirlenmelerde kandaki siyanr dzeyi 0.2-2 m g / l 0 0 ml arasnda deiir. Kalitatif siyanr testleri

kandaki bu deerleri saptamak iin yetersizdir. Kantitatif deneyler ise akut zehirlenme hakknda bilgi verir, ancak zehirlenme phesi olduunda analiz sonucunu beklemeden hemen tedaviye gemelidir. Siyanrle zehirlenme yangna maruz kalm kiilerde de grlr. Yn, ipek. poliretan ve poliakrilonitril gibi sentetik polimerlerin ksm yanmas ve pirolizi sonucu HCN olumas bu zehirlenmelere neden olur. Byle olaylarda kandaki siyanr miktar 20-100 pg /100 ml ye ulaabilir. lm halinde kan dnda, mide ve barsak ierii, karacierde de siyanr analizi yaplmaldr. Postmortem analizde siyanr lmden 2.5-6 aya kadar tannabiiir.Siyanr vucutta aldehit ve keton gruplar ile dayankl siyanhidrin bileiklerini oluturur. Bu nedenle uzun sre (HCN nin

uuculuuna karn) organizmada kalr. Siyanr zehirlenmesinin tedavisinde

98

atidot olarak sodyum tiyoslfat kullanlr. Antidot tedavisinden nce sodyum nitrit kullanm ise antidot tedavisinin etkinliini arttrr. 1.3. Metil Alkol ( CH 3 OH ) Metanol, odun alkol ve denatre alkol metil alkoln sinonimleridir. Molekl arl 32, kaynama noktas 65C dir. Endstride formaldehit ve formik asit yapmnda, labaratuarlarda zc olarak kullanlr. Antifriz iinde (etilen glikol ile beraber), araba camlar ykama suyunda bulunur. Endstriyel etil alkol iinde bulunan metil alkol zehirlenmelere neden olabilir. Ancak saf metil alkol daha ciddi zehirlenmelere yol aar. Yetikinlerde oral yolla 20-50 ml metil alkol lme neden olabilir. Toksikolojik analiz : Metil alkole akut maruziyetten hemen sonra kanda metil alkol dzeyinin tayini toksisitenin en iyi belirleyicisidir. Latet periyottan sonra metil alkol ve toksik metaboliti olarak formik asit dzeyleri birlikte deerlendirilmelidir. Serumdaki format dzeyinin tayini toksisitenin iddetini gsteren en iyi biyolojik gstergedir. Metil alkoln identifikasyonu ndirgen uucu bileikler iin genel test: Bu test su buhar ditilat, idrar ve mide ieriine uygulanabilir. Bir tpe bir ml idrar veya mide ierii konur. 50 |al potasyum dikromat reaktifi ile emprenye edilmi filitre kad, numuneyi ieren tpn boynuna yerletirilir. Tpn az gevek olarak kapatlr ve 2 dakika kaynar su banyosunda bekletilir. Portakal rengin yeile dnmesi metanol gibi uucu indirgen maddelerin bulunduunu gsterir (etil alkol, metaldehit, paraldehit, asetaldehit, formaldehit g i b i ) . (Potasyum dikromat reaktifi : 25 g/l konsantrasyonda, 1/1 orannda su ile seyreltilmi slfrik asit iinde hazrlanr). Destekleyici deney (kromotropik asit ile) : 0.1 ml potasyum dikromat reaktifi yukarda akland ekilde hazrlanan), 1 ml idrara (mide ierii

99

veya distilat) ilave edilerek oda scaklnda 5 dakika beklenir. Bu karma 0.1 ml etanol ve 10 mg kat kromotropik asit ilave edilir. 1 ml. slfirik asit tpn kenarndan dipte ayr faz oluturacak ekilde konur. ki faz arasnda viyole renk olumas metanol varln gsterir.

Formaldehit de bu testle pozitif sonu verir. Bu reaksiyon formaldehitin kromotropik asitle oluturduu p-kinoidal yapda kondensasyon rn ile ilgilidir ve formaldehitin tannmas iin zel bir deneydir. Bu test, metanol iin de (formaldehite oksitlendikten sonra) kullanlr. Bu yntemle 5 mg metanol (100 ml kanda) tanmlanabilir. Sujbert yntemi (Kromotropik asit) ile kanda metanol tayini Bu yntemin prensibi, metil alkoln formaldehite ykseltgenmesi ve oluan formaldehitin kromotropik asitle verdii renkli kondensasyon

bileiinin spektrofotometrik tayinine dayanmaktadr (Sujbert, L., 1966). Teknik : Bir tp ierisine 1.0 ml distile su ve 0.05 ml kan rnei konur. 0.2 ml %20 fosforik asit zeltisinden, 0.2 ml %5 potasyum permanganat

zeltisinden ilave edilir, kartrldktan sonra oda scaklnda 5 dakika bekletilir. Potasyum permanganatn fazlas %10 sodyum bislfit damlatlarak (renk gidinceye kadar) giderilir. 0.5 ml suda hazrlanm %0.5 kromotropik asit zeltisi, 8.0 ml konsantre slfirik asit eklenir. Karm 15 dakika 60 llC de su banyosunda stlr. Metil alkol varlnda viyole renk oluur. Ayrca metanol iermeyen kanla deney paralel olarak yaplr (kr deney). Metanol olmadnda karmn rengi kahverengi - sar olur. Kantitatif tayin iin oluan rengin absorbans 578 nm de kre kar spektrofotometrede okunur ve konsantrasyon kalibrasyon erisinden okunur. Kalibrasyon iin: Konsantrasyonlar 0-300 mg/l00 ml arasnda

deien metil alkol standardlar (0 ; 20 ; 50 ; 100 ; 200 ; 300 mg/l00 ml) kullanlr. 1 ml distile su ieren tplere 0.05 ml Standard zeltiler konarak,

100

yukardaki aklanan ilem uygulanr. Oluan renkli zeltilerin absorbans kre kar 578 nm'de spektrofotometrede okunur ve absorbanslara kar konsantrasyon iaretlenerek kalibrasyon grafigi hazrlanr. Kr (blank) deney metil alkol iermeyen kanla hazrlanr. Metanol standardlarnn hazrlanmas: a) Stok metanol zeltisi, 1.265 ml metanol (younluu 0.79 g/ml), 50 ml distile su ieren 100 ml lik balonjoje iine pipetle konur. Su ile 100 ml ye tamamlanr. Bu zeltinin konsantrasyonu %1 (g/100 ml) dir. (+4C) de saklanr. b) Standart metanol zeltileri ise, stok metanol standart zeltisinden sra ile 0;2;5;10;20 ve 30 ml alnarak su ieren 100 ml balonjojeye konarak 100 ml ye tamamlanr ve kartrlr. Bylece konsantrasyonlar (0-300 mg/100 ml) arasnda olan seri standard zeltiler hazrlanm olur. Not: Yntemin verimi (recovery) hesaplanmasnda, standad metanol zeltileri, su yerine metil alkol iermeyen kanla hazrlanr. Bu yntem biyolojik materyaldeki su buhar distilasyonu ile elde edilen distilat ve idrara da uygulanabilir. Yntemin duyarl 1 Ojag metanol metanol/100 ml kan) dr. Conway Mikrodifzyon Yntemi ile biyolojik materyalde metil alkol tayini Conway mikrodifzyon apareyi kullanarak kan, idrar ve mide ierii gibi biyolojik sv ve dokularda metil alkol tayini daha genel bir reaksiyon olan dikromatla veya formaldehit iin spesifik olan kromotropik asit (20 mg

reaksiyonu ile tayin edilebilir. Toksikolojik analizlerde etil alkol yannda, metil alkoln tanmlanmas ve miktar tayininin yaplabilmesi nem tar. Bu adan metil alkoln kalitatif ve kantitatif analizinde kromotropik asit reaksiyonu tercih edilir. Burada Conway mikrodifzyon apareyi ile metil alkol tayini aklanmtr.

101

Teknik : Apareyin (ekil 3'e baknz) i odacna 2.2 ml slfirik asit, d odaca 0.5 ml kan rnei (veya dier biyolojik sv); ve 1.0 ml doymu potasyum karbonat zeltisi ilave edilir. Apareyin kapa yalanarak skca kapatlr ve ara sra kartrlarak d blmedeki svlarn karmas salanr. Difzyonun tamamlanmas iin oda scaklnda 2 saat bekletilir. Bu sre sonunda i odacktaki slfirik asit zeltisinden 1.0'rer ml

alnarak iki ayr tpe konur. Tplerden birine %5 K M n 0 4 dan bir damla ilave edilir ve kartrlarak 5 dakika beklenir. Arkadan permanganatn doymu sodyum bisiilfit damlatlarak giderilir. kinci tp formaldehit bulunmas olaslna kar kontrol kullanlr, permanganat ile muamele edilmez. Blank (kr) olarak 1.0 ml distile su ieren nc bir tp hazrlanr. Tplerin herbirine % 0.5 kromotropik asit zeltisinden 0.2 ml eklenir ve buz banyosuna yerletirilir. Her tpe 4.0 ml konsantre slfirik asit ilave edilir ve iyice kartrlr. Oda scaklna kadar soutulduktan sonra 10 ml lik olarak rengi

balonjojelere aktarlr ve distile su ile 10 ml ye tamamlanr. Souduktan sonra eksilen hacim su ile tekrar 10 ml ye tamamlanr. Numunelerin absorbanslar 580 nm'de kre kar okunur. Formaldehit yokluunda kontrol tp renksiz kalr. Ancak az miktarda bulunabilecek formaldehit nedeni ile renk oluumu varsa, bu oksitlenmenin (kontrol)

rneinin absorbans, oksitlenmi rnein absorbansndan karlr. Metanol miktar, standard metanol zeltileri ile hazrlanan kalibrasyon grafiinden hesaplanr. Kalibrasyon dorusunun hazrlanmas : Standard metil alkol zeltilerinden 0.5 ml alnarak Convvay mikrodifzyon apareyinde asitle reaksiyondan yukarda sonra

aklanan ekilde ilem yaplr. Kromotropik

absorbanslar 580 nm de kre kar (%0 metanol

ieren kan) okunur.

102

Konsantrasyona hazrlanr.

kar

absorbanslar

iaretlenerek

kalibrasyon

grafii

(Standard metil alkol zeltileri (suda ve kanda) Sujbert ynteminde akland ekilde hazrlanr). Gaz kromatografisi yntemleri ile kanda metil alkol tayini Biyolojik svlarda metanol analizi iin en ok tercih edilen teknik gaz kromatografisidir. Gaz kromatografsinin (GLC) balca stnlkleri, n ilemlere ihtiya duymadan, ok kk hacimdeki biyolojik rneklerle

deiik alkollerin ayn zamanda ve hzl olarak kalitatif ve kantitatif analizinin yaplabilmesidir. Gaz kromatografisi ile metil alkol analizinde Carbowax 20 M; Porapak Q, polietilen glikol-400 gibi sv fazlar ieren cam, paslanmaz elikten yaplm kolonlar (yaklak 2 m uzunluunda, 2 mm i apnda) kullanlr. "Head Space" teknii: Head-space, kat ve sv rnekler ierisindeki yalnz uucu bileiklerin gaz kormatograf sistemine enjeksiyonunu salayan bir nitedir. Bu ynteme "Head Space Gaz Kormatografi (HSGC)" yntemi denir. HSGC ile yaplan analizlerde, kat veya sv rnek (0,2-0,5 ml) HSGC'nin ielerine konur ve az skca lastik bir septumla kapatlr. Bu ieler, stc ve termostat yardm ile, uucu bileiin buhar fazna geerek oluan gaz faz ile rnek arasnda denge salanncaya kadar belirli bir scaklkta tutulur. Denge sabiti, her bileik iin karakteristiktir. Kantitatif analizde bu deerlerin bilinmesi gerekmektedir. Kalibrasyon buhar faznda analiz yaplacak sv maddenin standart rnekleri ile yaplr. Metil alkol ve dier baz alkollerin analizinde kullanlan GLK

yntemleri etil alkol ksmnda aklanmtr.

103

1.4. Etil Alkol ( C 2 H 5 O H ) Etil alkol, molekl arl 46 ve k.n. 78C olan bir svdr. Etanol, hububat alkol sinonimleridir, genel olarak "alkol" denildiinde etil alkol anlalr. Alkolik olmayan yetikin insanda 250-500 gram alkol lme neden olur (MLD). Etil alkolle zehirlenmeler en ok alkoll iki alnmas ile grlr. Endstriyel alkol ile ayrca ierdii metil alkol gibi denaturanlarla da zehirlenmelere rastlanr. Etil alkoln identifkasyonu ( kalitatif testler ) Etil alkol, oksitlenebilen indirgen uucu maddelere ait genel ve spesifik reaksiyonlarla aranabilir. Bu testler biyolojik materyalden elde edilen su buhar distilatna, idrara, mide ieriine, olay yerinden elde edilen kalntlara uygulanabilir. Oksitlenebilen maddeler iin (alkoller, aldehitler gibi) genel reaksiyonu olan (potasyum dikromat + slfirik asit) testi : 1 ml numune ieren tpn kenarna 50 pl potasyum dikromat reaktifi (500 ml/l orannda su seyreltilmi slfirik asit iinde 25 g/l konsantrasyonda ile

hazrlanm)

damlatlm erit halindeki filtre kad konur. Tpn az hafife kapatlarak kaynar su banyosunda 2 dakika bekletilir. Portakal renginden yeil renge deiim etanol ve / veya dier indirgen uucu maddeler olduunu gsterir (n denemeler ksmna da baknz). Ksentogenat deneyi (genel): 1 ml distilata 0.2 gram potasyum hidroksit ilave edilerek stlr. Soutulduktan sonra 2-3 damla karbon slfr konarak tp iyice alkalanr. Ortam asetik asit ile asitlendirildikten sonra 1 damla % 1 C u S 0 4 (bakr slfat) ilave edilir. Sar bir kelein olumas primer veya sekonder alkol olduunu gsterir.

104

yodoform deneyi (etil alkol metil alkolden ayrt edici zel test) : 3 ml distilat % 10 NaOH ile kalevilendirilir. 3 - 5 damla iyot zeltisi ilave edilir ve kartrlarak hafife stlr. Etil alkol varsa iyodoform oluur. yodoform karakteristik kokusu ve sar kristalleri ile tannr (ayn reaksiyonu asetaldehit ve aseton da verir). Biyolojik materyalde etil alkol tayini Alkol tayini iin biyolojik materyal olarak kan, idrar ve solunum havas kullanlabilir. En ok kan alkol dzeyi tayin edilir. Adli tpta alkol ile zehirlenmenin iddeti ve trafikte yasal alkol limitinin alp almadnn deerlendirilmesinde hem antemortem (canl kiilerde) hem de postmortem kanda (lmden sonra) etil alkol tayini nem tar. Daha sonra aklanaca gibi trafikte alkol solunum havasnda da tayin edilir ve sonular kan alkol dzeyi olarak hesaplanr. Kan alnrken, deri yzeyinin HgCI 2 zeltisi ile (alkol iermeyen svlarla) temizlenmesi gerekir. Kan rnekleri (10 ml) % 1 NaF (sodyum flortir) ierecek ekilde NaF bulunan tplere alnr. Tpn az skca kapatlarak analize kadar buz dolabnda saklanr (NaF, antikoaglan ve antibakteriyel etkilidir). Bu ekilde hazrlanan kan rnekleri + 4C de 1 ay kadar dayankldr. Postmortem kan rnekleri ise tercihan femoral damarlardan alnmaldr. Eer rme yoksa kalbin yrtlmam odackiarndan alnr. Postmortem kanda, numune alma yerine gre kan alkol konsantrasyonu deiiklik

gsterebilir (Marraccini, J.V. ve ark. 1990; POKLS, A, 1996; VURAL, N; SAYIN,H. 1994) . Adli tp asndan en uygun kan rnei venz kandr. Alnan kan rnekleri (10 ml) %1 NaF ierecek ekilde, sodyum floriirle korunur.

105

Biyolojik materyalde (kan, idrar ve solunum havas) alkol tayininde kimyasal, enzimatik ve gaz kromatografik yntemlerle tayin edilir. Mikrodifzyon yntemi ile etil alkol tayini Mikrodifzyon yntemi; etil alkol iin yar kantitatif bir teknik olarak kullanlabilir. Pozitif sonu alndnda daha duyarl ve spesifik bir yntemle kantitatif analizin yaplmas gerekir. Reaktifler : Asit - dikromat zeltisi,: 3.70 g saf potasyum dikromat 150 ml distile suda zlr. 280 ml konsantre slfrik asit dikkatlice ilave edilir. Soutulur ve distile su ile 650 ml'ye tamamlanr. Potasyum dikromat zeltisi : Potasyum karbonatn suda doymu

zeltisi hazrlanr. Alkol Standartlar : Stok alkol standard : 0.200 ml etil alkol (% 96'lk, d: 0.8 g / ml), 50 ml lik bir balon jojede 40 ml distile su zerine konur. Su ile 50 ml ye tamamlanr. Kartrldktan sonra az skca (parafilm ile) kapatlr ve + 4 C de saklanr. Bu stok karm % 320 mg etil alkol ierir. Kalibrasyon iin kullanlacak etil alkol standartlar : Yukarda '

hazrlanan stok etil alkol standard % 1 NaF ieren su ile uygun oranda seyreltilerek % 20 ; % 80 ve % 160 mg alkol standartlar hazrlanr. Alkol standartlar ayrca, %1 NaF ieren alkolsz kanla yukarda akland ekilde hazrlanr. Bu standartlar yntemin verimini hesaplamak iin kullanlr. Teknik : Conway - mikrodifzyon apareyinin birinin d odacna 0.8 ml analizi yaplacak kan rnei ; dierine yaknda hazrlanm olan alkol standard (tercihan % 160 mg lk standart); her iki d odaca 1 ml doymu potasyum karbonat konur. odacklara 2 ml asit-dikromat reaktifi konur.

106

Apareyin kapa yalanarak (silikonla) hemen skca kapatlr.Dier nc Conway aparay blank "kr" deney iin kullanlr. Bunun iin d odaca 0.8 ml numune kan (alkol iermeyen) 1 ml doymu potasyum karbonat, i odaca 2 ml asit dikromat reaktifi konur ve apareyin az skca kapatlr. 37 C 'lik Etv'de 1 saat inkbasyon iin bekletilir. Difzyon tamamlandktan sonra otomatik bir pipet yardmyla i odacktaki asit-dikromat zeltisi 10 ml'lik cam kapakl balon jojelere alnr. Eksik hacim distile su ile 10 ml'ye tamamlanr. Daha sonra 450 nm'de spektrofotometre'de suya kar okunur. Kalibrasyon (konsantrasyonlar : Kanda % 20 ile ve suda hazrlanan % 320 mg alkol standartlar ile

arasnda

deien)

Convvay

mikrodifzyon apareyi ile yukarda aklanan ekilde, kr deney de yaplarak allr. 450 mm de absorbanslar okunur. Konsantrasyona kar absorbanslar iaretlenerek doru izilir. Alkol miktar hazrlanan kalibrasyon grafiinden hesaplanabilecei gibi, tek standart kullanarak ta aadaki formlle hesaplanabilir: a - as C = C S ( a -a C: Kan rneindeki alkol konsantrasyonu (mg/100 ml kan) C s : Alkol standardnn konsantrasyonu (mg/100 ml kan) a : Kr deneyin absorbans a : Numunenin absorbans a s : Standardn absorbans Yntemin Deerlendirilmesi: Bu yntemde, reaksiyona girmeyen potasyum dikromat zeltisinin absorbans okunduu iin, konsantrasyonla absorbans ters linearite gsterir. )

107

Standartla

alma,

numune

ile

beraber

tekrarlanmaldr.

Elde

edilen

kalibrasyon grafiine bir rnek ekil 13 de gsterilmitir. Conway mikrodifzyon yntemi ile kanda etil alkol tayini n bir tarama testi olarak toksikoloji laboratuvarlarnda kullanlmaktadr. Bu yntemle 20 mg /100 ml kan alkol tayin edilebilir. Ancak potasyum dikromat, metil alkol ve dier indirgen uucu bileikler ile de ayn reaksiyonu verir.

% mg Alkol

ekil 13- Convvay mikrodifzyon yntemi ile etil alkoln tayininin kalibrasyon dorusu. Conway mikrodifzyon ynteminin daha ksa srede (5 dakikada) sonu veren modifiye ekilleri kk Iaboratuvarlar, ila bamll

merkezlerinde ve acil olaylarda n bir teknik olarak nerilmektedir. Kan ve serumda kesin kantitatif deerlendirme iin destekleyici daha duyarl

yntemler iin kullanlmas gerekmektedir. (Serrano,L. ve ark. 1988) Enzimatik yntemle kanda etil alkol tayini i) Enzimatik yntemle alkol tayininde prensip, alkol dehidrogenaz (ADH) enzimi katalizrlnde, etil alkoln nikotinamid adenin dinkleotid

108

(NAD) tarafndan oksitlenmesine dayanr. Bu reaksiyonda, 1 mol NAD, I mol etil alkol oksitler ve kendisi de NADH'ye indirgenir. NADH'nn dorudan UV alannda (340 nm) veya florimetrik olarak llmesi ile alkol miktar tayin edilebilir. Veya NADH diaforez enzimi karsnda, uygun bir

kromojenle (tetrazolyum tuzlan, fenazin metoslfat gibi) reaksiyona girerek grnr alanda spektrofotometrik yntemle tayin edilir:
ADH

CH,CH 2 OH + N A D Diaforez NADH + MT

CH3CHO + NADH +H +

N A D + MT - formazan

Burada MT, monotetrazolyum boyar maddesidir. ii) Dier bir enzimatik yntemde ise alkol oksidaz ve peroksidaz enzimleri kullanlp, renk reaksiyonu fenol ve 4-amino antipirin ile

gerekletirilir.
alkoloksidaz

Etil alkol + 0 2

asetaldehit+H 2 0 2
peroksidaz

2H 2 0 2 +fenol+4-aminoantipirin

kinonimin+4H 2 0

Enzimatik yntemler iin hazr kitler bulunmaktadr. Bu kitler Standard alkol zeltisi, o yntem iin kullanlacak enzim, renk reaktifleri ve

tamponlar; yntemle ilgili teknik prospekts iermektedir. (Fazla bilgi iin: Sayn,H. 2000'e baknz). Gaz kromatografisi yntemi ile etil alkol tayini Gaz sv kromatografisi (GSK) kanda alkol tayini iin ilk kez 1958 de uygulanmtr. Daha sonra bir ok aratrmaclar tarafndan gelitirilmitir. Gaz kromatografisi ile ok az miktarda (0.2 ml ve daha az) allarak, etil alkol, asetaldehit (metaboliti), metil alkoln (eitli nedenlerle etil alkolle

109

beraber az miktarda bulunur) ayrlabilmekte, kalitatif ve kantitatif analizleri yaplabilmektedir. Sv faz olarak en ok Porapak Q, Polypak-2, PEG-400 (veya 600,1500) kullanlmakta, alev iyonlatrc detektr (FID) tercih

edilmektedir. Normal kolonlar yerine kapiller kolon kullanldnda ayrlma daha iyi olmaktadr. "Head space" teknii ile ok sayda numune ile otomatik alma olana vermektedir. Burada laboratuvarmzda uyguladmz GSK yntemi aklanmtr (Vural, N., Sayg, ., 1981). Yntemin Uygulanmas : Kan rnekleri yukarda akland ekilde %1 NaF ierecek biimde alnr. Standart alkol zeltileri: (% 0; % 50; % 80; %100 ve %200 mg) kan iinde hazrlanr. Bunun iin nce mutlak alkol, %96'lk etil alkoln kalsiyum oksitle (CaO) geri soutucu altnda kaynatlarak ve arkadan distile edilmesi ile hazrlanr. Mutlak alkolden 1 gram, su iinde tartlarak distile su ile 100 ml 'ye tamamlanr. (10 mg etanol / ml'de) bu zeltiden 0; 0.5;0.8; 1.0 ve 2.0 ml alnarak %1 sodyum florrle korunmu, alkol iermeyen kanla cam kapakl fiyoller iinde 10 ml 'ye tamamlanr. Buz dolabnda (+ 4C'de) saklanr. standart olarak n-propil alkol kullanlr. nce %0.1 'lik stok zelti hazrlanr. Bu zeltiden 2 ml alnarak %100 ml 'ye tamamlanr. Bylece 0.2 mg n-propanol/ml ieren zelti " internal : i standart (i.s.)" olarak kullanlr. Gaz kromatografisi koullan : %10 PEG-400 (Chromosorb W-AW,

80/100 mesh zerinde) sv faz ieren cam kolon (2 m uzunluunda x 0.4 mm i apnda); detektr: FID; enjeksiyon giri scakl: 110 C ; kolon scakl : 90 C; detektr scakl : 110 C; tayc gaz : azot (30 ml/dak.); attenuation : 8; range : 2.5 x 10"" amper; kaydedici hz : 0.5 cm/dak. Teknik : Kk bir tpe 0.1 ml analizi yaplacak kan rneine 1 ml i.s. ilave edilir, vortekste kartrlr. Karmdan 1 (al gaz kromatografa enjekte

110

edilir. Deney en az iki defa yaplr. Elde edilen kromatogramda, etil alkol ve i.s.'n" pik ykseklikleri "bulunarak, oranlar hesaplanr. (N: etil alkol pik yiikseklii/propi 1 alkol pik ykseklii). Bulunan bu orann kalibrasyon

dorusunda karl olan (etil alkol % / mg / i.s. % mg) oran bulunarak, etil alkol konsantrasyonu hesaplanr. Kalibrasyon dorusunun hazrlanmas : Yukarda akland

ekilde kanda % 0 ile % 200 mg arasnda, hazrlanan alkol standartlarndan tplere 0.1 ml konur. Her birine 1 ml i.s. ilave edilip, vortekste kartrlr. Karmdan 1 pl gaz kromatografa enjekte edilir. Her standartla ift allr. Kromatogramlar elde edildikten sonra, her standarta ait (etil alkol pik ykseklii / i.s. pik ykseklii) oranlar hesaplanr. Yukarda akland ekilde hazrlanan kan rnei gaz kromatografa enjekte edilerek kromatogramlar elde edilir. Bu kromatogramlardaki ykseklikleri oranndan numunedeki alkol konsantrasyonu pik

grafikten

hesaplanr (ekil-14).

ekil 14- Etil alkoln kalibrasyon grafii

111

ekil

15'de

kanda,

standart

alkol

zeltileri

ile

elde

edilen

kromatogram grlmektedir.

ekil

15- G L K ' d a Kan Alkol K r o m a t o g r a m lan. A: % 2 0 0 mg. .S. ilave

edilmi kan; B : .S. ve % 5 0 m g etil alkol ihtiva eden kan ; C : .S. ve % 100 m g etil alkol ihtiva eden kan enjeksiyonu. 1- Etanol piki; 2 - .S. piki; 3-su

Solunum havasnda etil alkol tayini Adli olaylarda (lm olmad zaman) ve zellikle trafik kazalarnda kiilerin alkol alp almad nce solunum havasnda (ekspirasyon) etil alkol tayini yaplarak aratrlr. Bu amala gelitirilmi bir ok teknikler vardr. Kullanlan apareyler solunum havasndaki alkol miktarn tayin eder, fakat sonular kandaki alkol miktarna gre kalibre edilmitir. Kinetik olarak, ortalama: kan alkol konsantrasyonu/solunum havas alkol konsantrasyonu: 1/2300 bildirilmitir. (Baz kaynaklarda 1/2100) (Fazla bilgi iin: Saferstein. R., 1987; Emerson, V.J. 1998). Al kol metre Lion laboratuvarlar tarafndan gelitirilen Lion-Alcometer SD-2,

elektrokimyasal detektr ve digital gstergeye sahiptir. 1/2300 kan/nefes

112

oranna gre kalibre edilmitir. Bu alete farkl nefes alma tpleri taklarak, baygn kiilerde de lm yaplabilir. lkemizde, Adli Tp Kurumunda, adli olaylarda alkol kontrol, "Lion Alcometer" ile yaplmaktadr. Bu aletle alkol testi u ekilde yaplmaktadr. a) Cihazn hazr kontrol yaplr ve SET dmesine basl durumda bulundurulur. b) Cihazn rnekleme blm, azln kenarndaki delie taklr. c) Test yaplacak kiiden, cierlerini havayla doldurmas, azln kaln ucundan dzenli ve tek bir fleme yapmas istenir. "A" lambasn yakacak kadar kuvvetli, "B" lambasn yakana kadar flemesi salanr. "B" lambas yandnda "Read" dmesine baslr ve flemeyi durdurmas istenir. "Read " dmesine basl vaziyette gsterge maksimum deere ulaana kadar ortalama 30 sn. beklenir ve deer okunur. Gsterge normal olarak kan alkol konsantrasyonunun 100 ml'de kanda mg alkol cinsinden gsterir. (Alkol konsantrasyonu proml olarak da ifade edilebilir) 1 promil = 1 g alkol /I kan = 100 mg/100 ml kan Aadaki resimde LON ALKOLMETRE grlmektedir.

113

Resim - 1. Alkolmetre

Analiz Sonucun yorumlanmas Etil alkol ince barsaktan hzl absorbe olur ve bulank grme, ba dnmesi, inkordinasyon, konfzyon, bulant ve iddetli olaylarda komaya neden olur. Genel olarak kan alkol dzeyinin klinik deerlendirmesi iin aadaki tablo (12) kullanlr.
T a b l o 12- Kan alkol dzeyinin klinik y o r u m u Kan alkol dzevi Belirtiler

yzde kzarma, fori : yetikinlerde belirgin bir klinik etki grlmez. Gen ocuklarda hipoglisemi grlebilir. 1.0 Inkoordinasyon, konumada bozukluk. 1.5 Belirgin inkoordinasyon, sendeleme, pupil dilatasyonu, nistagmus. 3.0 Gros inkoordinasyon, evre ilgisizlii, kusma 5.0 Koma ve lm * Alkol konsantrasyonu 1 promil=lg alkol / 1 kan =100 mg alkol / 100 ml kan

(g/l = promil )* 0.5

114

VVidmark faktrleri lk kez alkol kinetiini inceleyen Widmark, 1919 ylnda birim

zamanda kan alkolnn dme miktarnn (eliminasyon hz) negatif bir eilim gsterdiini ve bu dme hzn da 1 ile ifade etmitir. Ayrca alkoln 3 tm vcut svsnda homojen olarak dalmasndan dolay kiinin ald total alkol miktar (r) sabiti kullanarak hesaplanabilir. (13) ve (r) Widmark faktrleri olarak bilinir (Fazla bilgi iin Vural N. 1996'e baknz). Kan alkol dzeyinin tayininde, Widmark faktrleri olarak bilinen deerlerle : 1) Kiilerin aldklar total alkol miktar ; 2) Kiide kan alkol tayini iin alnan kan rneinin "adli olay" srasndaki gerek alkol dzeyi hesaplanabilir. vcuttaki total alkol miktar ( % g ) 1 ) VVidmark faktrlerinden ( r ) = Kandaki alkol miktar ( % g m l ) olarak ifade edilir, (r) erkeklerde ortalama 0.67 (0.46-0.86), kadnlarda biraz daha dktr. Kandaki alkol dzeyinden, bir kiinin ald alkol miktar ve iki cinsi de biliniyorsa iki miktar hesaplanabilir. rnein : 70 kg arlndaki insann kan alkol %0.12 g saptansn. Acaba bu kiinin vcudundaki alkol miktar ne kadardr? Bu iki cinsi votka ise ne kadar votka imitir? Widmark faktr 0.67 alndnda ; % 0,12 x 0.67 = % 0,080 g vcut alkol konsantrasyonudur. 70 kg. nsan iin : Total alkol miktar : 0,080 x 10 x 70 = 56 gram alkol ki cinsi votka (% 40 arlk/hacim alkol ierir) ise, kii:

115

100

56 x 40

= 140 ml votka almtr.

2 ) Dier bir Widmark faktr P ile gsterilir ve alkoln eliminasyon hz ile ilgilidir. Widmark 1919 ylnda, kan alkolndeki dme hzn ortalama : p = 16 mg/l 00 m l/saat ( 1 0 - 2 5 mg/l 00 ml/saat) nermitir. Bu faktr alnan alkol miktar; beslenme, alnan iki c i n s i , hormonlar, vitaminler, dier ilalarn etkisi ile deiebilir. Ancak pratikte bu deer 16 mg /100 ml kan/saat (veya saatte 0.16 promil)alnr. Bu faktrn adli tpta uygulanmasna aada rnek verilmitir : Trafik kazas yapm bir srcden kan rnei, kazadan 2 saat sonra alnm olsun. Yaplan analizde kan alkol dzeyi % 45 mg (0.45 promil) bulunsun. Acaba bu kiinin kaza anndaki gerek alkol dzeyi nedir? a) %16 x 2 = % 32 mg (0.32) promil kan alkolndeki dme b) Kaza anndaki alkol % mg = % 45 + % 32 = % 77 mg (0.77 promil) Trkiye'de zel oto srcleri iin yasal kan alkol limiti % 50 mg (0.50 promil) dir. Yukardaki rnekte eer alnan kan rneinde bulunan alkol dzeyine gre deerlendirme yaplrsa kii alkol asndan trafik suu ilememi olarak kabul edilir. Gerekte ise kan alkol olay annda yasal limitin stndedir. lkemizde trafik kazalarna ynelik trafik sigorta ilemlerinde p

faktr kullanarak deerlendirme yaplmaktadr. Bunun dnda dier trafik su ve kazalarnda henz kullanlmamaktadr (Vural, N., Sayn, H., 1996). 1.5. Formaldehit ( H C H O ) Formaldehit molekl arl 30 olan renksiz, yanc olmayan bir gazdr, %40'lk zeltisi halinde kullanlr. Formalin, formol sinonimleridir.

116

Sv haldeki formaldehitin (formalin) keskin batc bir kokusu vardr. Gz yaartcdr, uucu olup, k.n : 2lC'dr. Formalin, stabilizr olarak metanol ierir. Formalin dezenfektan, antiseptik ve dokularn korunmasnda

(fiksasyon zeltisi) kullanlr. Polimerize formaldehit (para formaldehit) fumigan, dier polimerleri iin yaptrc, izolasyon maddelerinin

hazrlanmasnda kullanlr. Formaldehit ok abuk olarak (in vivo) formata metabolize olur. Metil alkoln de ara metabolitidir. Akut formaldehit zehirlenmesine az rastlanr. 30 ml formalin insanlarda ldrc olabilir (MLD). Formaldehit aranmas (Kalitatif test) Biyolojik dokulardan su buhar distilasyonu veya mikrodifzyon la ayrlabilir. Distilata veya dorudan idrara uygulanan testler : Oksitlenebilen uucu bileiklere uygulanan dikromat - slfirik asit testi ve Schiff reaksiyonu formaldehitle de pozitif sonu verir (n denemelere baknz). Formaldehit iin spesifik test (Kromotropik asit ile): 0.5 ml test zeltisine 100 mg kadar kromotropik asit ilave edilir ve vortex ile 5 dakika kartrlr. Dikkatle 1.5 ml konsantre slfirik asit ilave edilir. Mor-viyole rengin olumas formaldehit mevcudiyetini gsterir. Yntemin duyarll 20 Ug / ml dir. Fenil hidrazin ile : 10 ml distilata (idrar) 10 damla %5' lik fenilhidrazin hidroklorr zeltisi, 3 damla %0.5 lik sodyum nitroprussiyat zeltisi ve 10 damla %10' luk sodyum hidroksit zeltisi damlatlr. Mavi renk oluumu formaldehit varln gsterir. Asetaldehit krmz renk verir. Formaldehit tayini 1) Kromotropik asit testi spektrofotometrik yntemle formaldehitin

117

kantitatif analizi iin de kullanlr (Metil alkole baknz). 2) 2,4 dinitrofenolle hidrazin oluturularak, HPLC ile de formaldehit tayin edilir. Bu yntem ok duyarldr (pg dzeyinde). Biyolojik materyalden izole edilen distilatta, i yeri ortamnda formaldehit tayini iin kullanlabilir (Fazla bilgi iin Usanmaz, S., 1994'e baknz). l..Formik asit (HCOOH) ve Format Formik asit, molekl arl 46 olan renksiz, sulu zeltidir ve ok korosiftir. Bir ok (descanling) kepek dken zeltiler 500-600 ml / I formik asit ierir. Formatlar, sodyum format (HCOONa) olarak boya, bask ve tabaklama (deri) endstrisinde ve sentetik ara rn olarak kullanlr. Metil alkol ve formaldehitin toksik metabolitidir. Minimum letal doz (MLD), yetikinler iin 30 ml olarak verilmitir. Formik asit'in identifikasyonu (kalitatif testler) Mide ierii ve olay yerinden alnan rneklere uygulanr. 1) n deney : 0,5 ml test zeltisine, 1 ml sitrik asit-asetamid reaktifi (5 g/l sitrik asit ve 100 g/l asetamid, propan-2-ol iinde); 0.1 ml sodyum asetat (300 g/l), 3.5 ml asetik anhidrid ilave edilir. Vorteks'de 5 saniye kartrldktan sonra 10 dakika kaynar su banyosunda stlr. Krmz renk olumas formik asit varln gsterir. Formaldehit

ve format tuzlar bu testle pozitif reaksiyon vermezler. Yntemin duyarl 50 pg/ml 'dir. 2) Destekleyici deney (kromotropik asit deneyi : 0.1 ml numuneye 0.1 ml seyreltik hidroklorik asit (2 mol/1) ilave edilir, vortekste 5 saniye kartrlr. 100 mg kadar magnezyum tozu gaz k duruncaya kadar yava yava ilave edilir. 100 mg kromotropik asit ilave edilir ve vortekste 5 saniye kartrlr.

118

Dikkatle 1.5 ml konsantre slfrik asit ilave edilir. 60C deki su banyosunda 10 dakika bekletilir. Mor-viyole renk oluumu formik asit ve formatlarn varln (Mg tozu ile formaldehite indirgenmi) gsterir. Ayn reaksiyonu formaldehit n ilem yaplmakszn, metil alkol ise K M n 0 4 ile oksitlendikten sonra verirler. Bu yntemin duyarl 50 |ig/ml dir. Formik asitin kantitatif analizi Gaz kromatografk yntem : GSK ile formik asit dorudan veya

trevleri oluturulduktan sonra tayin edilebilir. Formik asit metil format veya dimetil formamit, formanilid trevleri eklinde, FID detektr kullanarak GLK ile tayin edilebilir. Duyarlk 10 ^g/ml olarak bildirilmitir. Head space teknii ile deteksiyon limiti 2,5 ng/ml dir. Enzimatik Yntemler Formik asitin biyolojik svlarda enzimatik yntemle tayini, formatn bakteriyel "format dehidrogenaz" enzimi ile karbondioksit ve suya oksidasyonu srasnda NAD + 'nin NADH'a indirgenmesi reaksiyonuna dayanr.

Burada oluan NADH, diyaforez enziminin katalizrlnde indirgendiinde floresan oluturan bir substrat ile reaksiyona sokulur. Bu amala kullanlan maddelerden biri resazurindir. NADH ile indirgenen resazurin, resofurin isimli floresan madde verir. Bu madde 565 nm de ekstinksiyon ve 590 nm de emisyon dalga boylarnda spektroflorimetrik olarak tayin edilir. Buradan formik asit miktarna geilir. Yntem ok duyarldr (0.2 ji.g/ml) ve spesifiktir. Reaksiyon denklemi aada gsterilmitir:

119

FDH NAD^+HCOOH diaforez NADH + resazurin > NAD * + resorufin (floresan) (2) (FDH : Format dehidogenaz enzimi) Analiz Sonucunun yorumu Biyolojik svlarda formik asit (format) tayini zehirlenmelerde nem tar. Ancak serum metanol ile akut iin rutin NADH + H+ + C0 2 (1)

format dzeyleri

laboratuvar testleri yaygn deildir. Kanda endojen format dzeyi 0-6,3 mg/l 00 ml arasnda deiebilir. Genel olarak st snr 1.2 mg/l00 ml kabul edilir. Ar zehirlenmelerde 93 mg/l00 ml'ye kadar kabilen deerler bildirilmitir. Aada Tablo 13'de metanol zehirlenmesi sonucu oluan 2 lm olaynda, postmortem formik asit analizi sonular gsterilmitir (Tanaka, E. ve ark. 1991).

T a b l o 13 formik asitin p o s t m o r t e m dalm Biyolojik r n e k olay 1 olay 2

Kan (mg/ml) drar (mg/ml) Beyin (mg/g) Karacier (mg/g) Bbrek (mg/g) Mide ierii (total, mg)

0.32 2.27 0.11 0.54 0.13 108

0.23 0.47 1.17 0.51 1.19 23.2

120

2.7. Klorlu Hidrokarbonlar Toksikolojik nemi olan halojenli hidrokarbonlara doymu

haloalkanlardan metil klorr, metil bromr, kloroform, karbon tetraklorr, metil kloroform; etilen yapsnda halojenli doymam hidrokarbonlara ise trikloroetilen ve tetrakloretilen rnek verilebilir. Burada, aada aklanan "Fujvvara" reaksiyonu yaplabilen baknz). Kloroform (CHCU) : Triklorometan yapsnda; molekl ktlesi 119 ile kendilerinin ve/veya metablitlerinin analizi de

klorlu hidrokarbonlardan

bahsedilecektir (Genel

blme

dur. Anestetik ve tbbi amala dezenfektan olarak kullanld gibi, endstride zc olarak ta nemli bir yeri vardr. MLD: 7 g / 70 g insandr. Kloroformun nemli bir ksm deimeden akcierler ve idrarla atlr. Az bir ksm metilen klorr, C 0 2 ve potent hepatorenal toksik bir madde olan fosgene (COCl 2 ) metabolize olur. Karbon tetraklorr ( CCU ) : Tetraklorometan yapsnda molekl

ktlesi 154 olup, piren ve karbona sinominleridir. Temizleme, ya eritici ve ya uzaklatrc olarak, yangn sndrmede, kuru temizlemede kullanlr. MLD : yaklak 4 ml / 70 kg insandr. Karbon tetraklorrn balca toksik etkisi karacier ve bbrek hasarna neden olmasdr. Karbon tetraklorre youn maruz kalma, Fujvvara reaksiyonu ile

detekte edilebilir. Bu reaksiyonu CCI 4 vermez. Bu nedenle bu reaksiyonun muhtemelen CCI 4 minr metaboliti ve ierebilecei kontuminant olan

kloroformdan kaynakland dnlmektedir. 1,1,1,-Trikloroetan (Metilkloroform : CCUCHO : Molekl ktlesi 133 dr. Metilkloroform kuru temizlemede zc, ya uzaklatrr ve daktilo yazlarn dzeltme svlarnda (daksil) kullanlr. Akut zehirlenme kazaen

121

youn bir ekilde maruz kalma veya amal inhalasyonla (uucu zc suistimali) olur. Absorbe olan 1,1,1,-trikloroetann %2 si 2,2,2, trikoroetanole ve sonra trikoasetik asite metabolize olur. Bu metabolit de idrarda fujivvara testi ile aranr. Trikloroetilen ( CHCI = C Cl 2 ) : Trilen, trikol, tiriol gibi sinominleri vardr. Molekl ktlesi 131'dir. Yal madde ekstraksiyonunda, ila ve parfm endiistirisinde, kuru temizlemede ayrca insektisit olarak kullanlr. Tpta genel anestetik olarak kullanlr. Balca toksik etkisi MSS zerinedir, narkotik etkilidir. Narkotik etkisi trikoetanol (TKE) metaboliti ile ilgilidir. nemli bir ksm (% 80). TKE zerinden trikloroasetik asit (TKAA) metabolitine dnr. Bu metabolitte idrarda Fujivvara testi ile detekte edilir. Kloral hidrat, dikloralfenazon gibi hipnotik ilalar da TKAA metabolitine dnrler). Akut zehirlenme kazaen youn maruz kalma veya amal inhalasyon (uucu zc skistimal) sonucu oluur. Tetrakloroetilen : ( Perkloroetilen, tetrakloroetilen ) CC12 = CC2: Molekl ktlesi 166 dr. Tetrakloroetilen antihelminitik ve kuru temizlemede zc, buharla ya uzaklatrc olarak kullanlr. Akut zehirlenme kazaen youn maruz kalma ve amal inhalasyon sonucu oluur. Absorbe olan tetrakloro etilenin ancak % 0.5'i trikloroasetik asite metabolize olur. Bu miktardaki metabolit de idrarda Fujivvara testi ile tannabilir. Klorlu hidrokarbonlarn biyolojik materyalde aranmalar

(Fujivvara deneyi ile) Klorlu hidrokarbonlar doku ve kandan su buhar distilasyonu ile izole edilirler. Asit ortamda btn klorlu hidrokarbonlar su buhar ile srklenirler.

122

Distilat veya idrarda klorlu hidrokarbonlarn kalitatif ve kantitatif analizinde en ok kullanlan genel renk reaksiyonu Fujiwara testidir. Deneyin uygulanmas : Bu test su buhar distilasyonu ile izole edilen

diti lata ve/veya idrara uygulanabilir. Deney numune, blank (kr) ve Standard (triklroasetik asit) ile paralel olarak yaplr. Distilat ile alldnda 5 ml distilata (veya 2 ml idrar) 2 ml %20 lik NaOH ve 2 ml saf piridin ilave edilerek dikkatle kartrlr. Karm kaynar su banyosunda 5 dakika bekletilir. Piridin faznda koyu krmz meneke rengin olumas trikloro bileiklerinin olduunu gsterir. Laboratuar ortamnda kloroform gibi ayn reaksiyonu veren

kontaminatlar dlamak iin distilat yerine 5 ml saf su kullanarak kr deney (Blank) yaplr. Ayrca standard olarak suda hazrlanm %1 lik triklroasetik (10 mg/l) ile deney paralel yrtlr. asit

Bu deneyin duyarl lmg/1 trikloroasetatdr. Klorlu hidrokarbonlar (kloroform, trikloroetilen, metilkloroform, tetrakloroetilen) ve metabolit

olarak oluum trikloroasetik asit dnda kloralhidrat, diklorofenazon gibi trikloroasetik asit metabolize olan ilalar da Fujivvara reaksiyonu ile pozitif sonu verirler. Klorlu hidrokarbonlarn analizleri 1 ml toluen fazna (klorlu hidrokarbon distilatnn topland), 10 ml saf piridin (tekrar distillenmi veya taze analitik zellikte) ve 5 ml 20 NaOH ilave edildikten sonra, karm tam 5 dakika kaynar su banyosunda bekletilir. Buz banyosunda soutulduktan sonra renkli piridin faz hemen ayrlr. Piridin faz, distile su ile 15 ml ye seyreltilir. Bu renkli zeltinin absorbans 530 nm de kre kar bir spektrofometrede okunur. Konsantrasyon Fujivvara reaksiyonu ile kantitatif

123

ayn ekilde standart hidrokarbon zeltileri ile hazrlanm kalibrasyon erisinden hesaplanr. Bu teknikle, 1 ml toluen iinde en fazla 0.4 mg hidrokarbon tayin edilebilir. Habgood ve Powell 1 ml aseton ilavesi ile karbon tetraklorrn piridin faznda verdii rengin iddetlendiini, kloroform olduunda azaldn ve trikloroetilen ile meydana gelen rengin ise etkilenmediini gstermilerdir. drarda Fujiwara reaksiyonu ile trikloroasetik asit (TKAA)

tayini (Soucek ve Vlachova modifikasyonu) Trikloro asetik asite metabolize olan klorlu hidrokarbonlara maruz kalmann biyolojik izlenmelerinde idrarda TKAA tayini yaplmas pratik adan daha uygundur. Bunun iin 2 ml idrara, 8 ml saf piridin ve 5 ml % 20 NaOH ilave edilir. Karm 70 C de 15 dakika su banyosunda bekletilir. Buz banyosunda soutulduktan sonra piridin faz (7.5 ml) 3 ml su ilave edilerek seyreltilir. Renkli zeltinin optik dansitesi 530 nm de kre kar okunur. Sonu, 1-100 mikrogram arasnda hazrlanan TKAA standartlaryla elde edilen kalibrasyon erisinden hesaplanr. Sonucun Yorumu : Bu yntem en ok trikloroetilene maruz kalmada kullanlr. drarda 20 mg/1 TKAA bulunmas, nemsiz derecede trikoloetilene maruz kalndn, bu deerin (150 mg/1 TCAA) stnde bulunmas ise havada msaade edilen limit stnde trikloroetilene maruz kalndn ifade eder. Klorlu hidrokarbonlarn gaz kromatografik yntemle analizi Kan ve idrarda klorlu hidrokarbonlarn gaz kromatografisi yntemi ile taranmalar ve kantitatif analizleri duyarl olarak yaplr. Gaz kromatografisi yntemi ile GA veya tercihen GI sistemi ile taramalar yaplabilir. (Moffat, A.C., ve ark. 1986)

124

a ) Sistem G.A. : %2.5 SE-30 ile kaplanm 80-100 mesh ehromosorb (asitle ykanm : AW ve dimetildiklorosilanla ilem grm) kolon kullanlr. Destek maddesinin tamamen deaktive edilmi olmas gerekir. 2 m x 4 mm i apnda cam kolon tercih edilir. Gaz kromatografsi koullan : Kolon scakl 35C da 2 dakikaya ve sonra dakikada 5C ykselecek ekilde 175 C ye kadar programlanr. 175C da en az 8 dakika tutulur. Tayc gaz olarak azot (45 ml /dakika ak hznda) FID dedektr kullanlr. Sistem GI: 80-100 mesh carbopak C zerine kaplanm % carbowax 0.3

20 M ieren kolon (2 m x 2 mm i apnda) kullanlr. Kolon

scakl yukarda akland ekilde 35C ile 175C arasnda programlanr. Tayc gaz olarak azot (30 ml/dak. ak hznda) kullanlr. Kantitatif analizde ise "head-space" dzenei ieren gaz kromatografsi tercih edilir. 1.8. Aromatik Hidrokarbonlar Aromatik hidrokarbonlarn en basit ve dayankl bileii olan benzen ve homologlar (toluen, ksilen izomerleri, etil benzen) endstriyel ve ticari kimyasal maddeler olarak nem tarlar. Yakt, zc ve kimyasal

maddelerin sentezinde balang maddesi olarak kullanlrlar. Bu nedenle, evrede, i yerlerinde ve endstride evresel ve biyolojik izlenmeleri nem tar. Benzen (C 6 H6> En basit aromatik hidrokarbondur. Benzol, fenilhidrid ve kmr naftas sinonimleridir. Kendisine zg kokusu olan, uucu bir organik svdr. K.n. 81C dir. Akut benzen zehirlenmesinde balca semptomlar MSS depresyonu ile ilgilidir. Kronik maruz kalmada ise hematopoetik sistem etkilenir. Anemi ve

125

lsemiye neden olduu gsterilmitir. MLD : 15 ml /70 kg insan olarak verilmitir. Kronik benzen toksisitesinden benzenin aktif metabolitleri olan fenolik metabolitleri sorumludur. Benzene maruz kalmann biyolojik izlenmesinde kanda benzen, idrarda fenol tayini yaplr. Benzenin biyolojik materyalden izolasyonu ve kalitatif analizi Benzen dokulardan, asit ortamda su buhar distilasyonu ile izole edilir. Bunun iin 10 g doku (veya 4 ml kan) distilasyon balonuna konarak 50 ml su ile kartrlr. (ekil 2). 1 ml konsantre H 2 S 0 4 ilavesinden sonra, uzun soutuculu bir su buhar distilasyonu apareyinde distillenir. Soutucunun u ksmnn nmune toplama kabnn karbon tetraklorr ihtiva eden ksmna kadar uzanan bir adaptrle tespit edilmesi, benzenin umasn engeller. Benzen kokusu duyulmayncaya kadar distilasyona devam edilir. Nmune kabnda toplanan, distilat toplanr ve CCI 4 faznn ayrlmas iin beklenir. Benzen CCI 4 iinde zneceinden bu faz alnarak benzen aranr: Bir tpe alnan (5ml slfrik asit ve 6 ml benzen-karbon tetraklorr) karmna, 9 ml

nitrik asit ilave edilir. Asitlerin ilavesi srasnda tp

devaml kartrlr ve karmn scakl 60C altnda tutulur. Karm, 1 saat 60 C de su banyosunda stlr. Benzen mevcudiyetinde nitrobenzen (k.n: 206) oluur. Karmn soutulmasndan sonra, nitrobenzen karakteristik, ayakkab cilas kokusu ile tannr. Benzenin kan ve dokuda aratrlmas kronik benzen zehirlenmesi bakmndan nemlidir. Ayrca, idrarla atlan metaboliti fenol olduundan kronik benzen zehirlenmesinin saptanmasnda dier aratrmalar (kan

forml, hemogram, hematokrit gibi) yannda, fenol tayini deerli bir kriterdir (fenol blmne baknz).

126

Toluen (Metil benzen) :C 6 H 5 CH 3 Bal Molekl ktlesi 92 ve kaynama noktas 109-111 C olan bir organik zcdr. Toluen yaptrc, boyalar iin zc olarak ve ayrca endstride yaygn olarak kullanlr. zc olarak ou kez, tiner gibi ticari karmlar (dikloro-metan, ksilen, metil etil keton gibi dier zcler ierir) eklinde kullanlr. Akut toluen zehirlenmesi youn ekilde toluene maruz kalma veya bamllk eklinde inhalasyonu ile (yaptrc koklama, uucu zc tipi bamllk) grlr. Toluenin nemli bir ksm (%80 i) benzoik asite metabolize olur. Benzolik asit glisinle konjuge olarak idrarla hippurik asit (HA) eklinde atlr. ok az miktarda da krezollere (o-, p- ve m-krezol) dnr, o-krezol spesifik minr metaboliti olup son yllarda, dk konsantrasyonda toluene maruz kalnann biyoindikatr olarak idrarda tayini tercih edilmektedir. Toluene evresel ve mesleki maruziyetin biyolojik izlenmesinde kanda ve alveolar havada toluen, idrarda hippurik asit tayini yaplr. Fenolik metabolitleri olan krezollerin (zelikle o-krezol) tayini de spesifik metabolit olarak nem kazanmtr. Kanda toluenin gaz kromatografik yntemle tayini Toluen kan ve dokularda gaz kromatografisi yntemi ile tayin

edilebilir. Sistem olarak GA veya GI kullanlr. Alkonma zaman 24.8 dakikadr (Moffat, A.C. 1986). drarda HA tayini Spektrofotometrik yntemler Hipprik asit, mg/l dzeyinde renk reaksiyonlar ile spektrofotometrik yntemle tayin edilebilir. Renk reaktif olarak (piridin + benzensulfonil klorr) veya p-dimetilbenzaldehit kullanlr. Burada hipprik asitin p-

127

dimetilbenzaldehitle kondanse olarak oluturduu renkli bileiin 458 nm de llmesine dayanan spektrofotometrik yntem aklanacaktr. (Flanagan ve ark. WHO, 1995) Reaktifler: Seyreltik hidroklorik asit (0,05 mol/I) Dimetilaminobenzaldehit reaktifi : p-dimetilaminobenzaldehit (40 g/l) konsantrasyonda, iinde birka kristal (0,5 g kadar) susuz sodyum asetat ieren asetik anhidrid iinde hazrlanr. Sodyum klorr (kat) ktrlm silika Standardlar : Kr (blank) olarak idrar kullanlr. Standardlar kr olarak kullanlan idrarda hippurik asit 0,2; 0,5 ; 1,0 ve 2.0 g/l konsantrasyonda olacak ekilde hazrlanr. Bu zeltiler +4C de karanlkta saklandnda 1 ay dayanr. Teknik : 1 ml idrar rnei (veya Standard) hidroklorik asit zeltisi ile 2 ml ye seyreltilir ve doygunlua kadar sodyum klorr ilave edilir. zeltiye 2 ml dietileter : metanol (9:1) ilave ederek, vortekste 1 dakika kartrlr. 5 dakika santrifj edilir. st faz atlr ve ikinci kez ekstraksiyon ilemi dietileter : metanol (9:1) ile tekrarlanr. Eter ekstraktlar birletirilir ve iinde 0,5 g silika ieren tpe, ekstraktan 1 ml ilave edilir. Eter faz hava veya azot akmnda uzaklatrlr. Kalntya 3 ml dimetilaminobenzaldehit reaktifi ilave edilerek 135C de 5 dakika stlr. Soutulan karma 4 ml metanol ilave edilir 1 dakika vortekste kartrlr, 5 dakika santrifj edilir. Metanol ekstrakt dier bir tpe aspire edilir. Kalan silika faz ikinci bir (4 ml) metanolle ekstrakte edilir.

128

Metanol ekstraktlar birletirilir ve 460 da absorbans, ayn ekilde hazrlanm "kr idrar" ekstraktna kar okunur. Kalibrasyon : Kalibrasyon erisi, idrara ilave edilmi hippurik asit standardlar ile yukarda akland ekilde analizleri yaplarak (absorbansa kar konsantrasyon) hazrlanr. Numune ile elde edilen absorbansn hippurik asit dzeyi, kalibrasyon erisinden hesaplanr. Benzoat ieren diyetlerin alm nedeni ile HA atlm normal kiilerde de olduu iin, kr ve Standard hazrlamada ayn idrar rnei

kullanlmaktadr. Yntemin duyarll 0,1 g/l hippuattr. drarda gaz kromatografisi yntemi ile HA ve M H A tayini drarda GLK ile HA tayininde, HA'in metanol ile metil trevi

oluturulur. standart olarak heptadekanoik asit kullanlr. Ayn yntemle, ksilenin metaboliti olan metil hipprik asit (MHA) tayini de yaplr. . Burada laboratuvarmzda, tiner kullanm nedeni ile toluen ve ksilen maruziyetinin aratrlmasnda idrarda HA ve m-MHA tayini iin

kullandmz yntem aklanmtr (Doanyiit., R. 1999). Kullanlan reaktif ve standardlar: Trevleme reaktifi : 4 ml % 37 lik hidroklorik asit, susuz metil alkolle (maksimum %0,001 H 2 0 ieren) balonjoje iinde 100 ml ye tamamlanr. nternal (i) Standard : 50 mg heptadekanoik asit metil alkol ile 100 ml ye tamamlanr. Standard HA zeltileri : 50-250 mg/50 ml arasnda konsantrasyonlar deien, seri Standard HA zeltisi metil alkol iinde hazrlanr. Standard metil hippurik asit (m-MHA) zeltileri : 25-150 mg/ 50 ml arasnda deien konsantrasyonda olacak ekilde, m-MHA, metil alkolde zlerek standard zeltiler hazrlanr.

129

Gaz

kromatografisi

koullan :. Kolon dolgu maddesi

%3 SE-30

(Chromosorb WHP, 80-100 misli zerinde); detektr: FID; Enjeksiyon giri scakl; 240C; frn scakl : 200 C; tayc gaz (azot) ak hz: ml/dk.; hidrojen ak hz : 300 ml/dk. Teknik : 1 ml idrara 200 p.1 i standart ve 200 |il i standart ve 200 JX 1 L 0,5 N-HCI ilave edilerek 3 ml etil asetat ile alkalayarak 20 dakika ekstrakte edilir. Karm 4000 rpm de 4 dakika santifj edilir. Organik faz 15 ml lik tpe aktarlarak oda scaklnda azot akmnda uurulur. Kalnt zerine 1 ml trevleme reaktifi ilave edildikten sonra, su banyosunda 60 C da 45 dakika bekletilir. Karm soutulduktan sonra 2 ml distile su ilave edilir ve 1 ml kloroform ile 20 dakika kartrlarak ekstrakte edilir. 3000 rpm de 2 dakika santrifj edildikten sonra kloroform fazndan 2 (ol dorudan gaz kromatografa enjekte edilir. Kalibrasyon : Mesleki olarak maruz kalmayan kiilerde alnan idrarn 1 ml sine, her seri standart zeltiden 200 fil HA ve 200 (0.1 m-MHA ilave edilerek, yukarda aklanan ilemle (200 fol internal Standard ilavesinden sonra) uygulanr. Kalibrasyon grafii, konsantrasyona kar, pik oran 30

iaretlenerek (standart / internal standart) izilir. Numune ile elde edilen pik ykseklii oran (nmune/internal standart) kromatografdan saptanarak, yntemle ilgili artlar konsantrasyon

kalibrasyon erisinden hesaplanr. Yntemle ilgili uyarlar : 1) Standardlar hazrlanrken, normal kiilerde de HA atlm

beslenmeye bal olarak deien oranda bulunabileceinden ayn idrardan alnan rneklere HA standardlar ilave edilir.

130

2)

Yntemin

verimi

(recovery)

hesaplanrken,

normalde

idrarda

bulunan HA konsantrasyonu, standarddan kartlr. Bunun iin, kalibrasyon grafii hazrlanrken idrar rnei ile de alma yaplr. 3) Ksilen o-, p- ve m- izomerlerinin karm olarak bulunduu iin, idrarda m- dndaki MHA metabolitleri olabilir ve alkonma zamanlar GLK de yakndr. Ancak m-ksilen izomeri, karmda % 70-80 gibi yksek oranda ve p-izomeri %5 in altnda olduu iin pratikte bu interferans nemli deildir. Son yllarda, bu izomerlerin ayrlmasna ynelik yntemler gelitirilmektedir. ekil 16'da GLK ile HA ve m-MHA'in kromatogramlar grlmektedir.

cm

l dakik

(a)
ekil 16- ( a ) HA (1); m-MHA (2) ve heptadekonoikasit (i Standard, 3) standardlarnn (0.5 pg) GLK kromatogram lar

(b) ekil 16- (b) Mobilya iilerinin idrarndan elde edilen ekstraktn gaz kromatogram lar. (1) HA, (2) m-MHA, (3) i standart

131

H P L C ile idrarda H A tayini : Toluen ve ksilenin metabolitlerinin tayininde HPLC duyarlk ve

spesifte asndan son yllarda en ok kullanlan tekniklerden biridir. Bu teknik genelde zaman alr ve iyi donanml yksek performansl kromatografa ihtiya vardr. Ancak, rutin analizlerde kullanlabilecek basit ve abuk sonu veren HPLC yntemleri de gelitirilmitir. Burada laboratuvarmzda

modifiye edilen olduka basit ve abuk sonu veren HPLC yntemi ile HA tayini aklanmtr (Duydu ve ark. 1999) HPLC cihaz ve alma koullar : Kromatograf sistemi bir HPLC pompas, UV/VIS detektr ve Li Chrosorb RP-18-5 ieren 200x4.6 mm kolon iermektedir. Mobil faz olarak 5 mM KH 2 P0 4 (pH : 2.5) ve aseto nitril (CH 3 CN) karm (90/10 orannda) kullanlr. Mobil arasnda 2 faz ak ml/dak ve hz : lk 2,6 dakikada 0,8 ml/dak ; 2.9-7.5 dakika 8.0-9.0 dakika arasnda 0.8 ml/dak. olarak

programlanmtr. Efluentin absorbans 225 nm de okunur ve total tayin oda scaklnda yaplr. Teknik : 1 ml idrara 1 ml metil alkol ilave edilir ve 2500 rpm de 5 dakika santifj edilir. Supernatant'tan 3 pl, HPLC cihazna enjekte edilir. Kalibrasyon: Kalibrasyon erisi konsantrasyona kar pik alan

keratinine gre verilecekse (tercih edilir), ayrca kontrol idrarda kreatinin tayin edilir. Bu durumda kalibrasyon erisinde konsantrasyon kreatinin olarak iaretlenir. Stok HA zeltisi metanol iinde hazrlanr (1 g/l). Kalibrasyon iin stok zelti su ve idrarla seyreltilerek, HA konsantrasyonu 0-2 mg/ml HA, g/g

132

arasnda deiecek ekilde 2 ayr Standard (su ve idrar) seri Standard zeltileri hazrlanr. Yntem bu standardlara uygulanr. ekil 17'de HPLC ile Standard HA, normal idrar ve HA ilave edilmi idrar rneinin kromatogramlar grlmektedir.
IOC'03-'

lOC'OM- 01J-

III

HA HA
\ T 53 t i O |i P

oor.ro'ijrrarrK'joinor

OOCO!Un$)T5)ii5tull<j | |

ekil 17- HA'nin HPLC de kromatogram I-Standard HA; II-Normal idrar (endojen HA grlmekte); III-HA ilave edilmi idrar. Ksilen (C 6 H 4 (CH 3 ) 2 ) Renksiz, aromatik kokulu bir sv olup, molekl arl 106.13 tr. Kaynama noktas 130C, alev alma noktas 29C dr. Ticari olarak orto, meta ve para izomerleri eklinde bulunur. Ancak o-ksilen, en yksek oranda (%6080) bulunur. Toluenle birlikte tiner iinde bulunur. Ksilenin, idrarla atlan balca netaboliti, metil hipprik asittir (MHA). En ok meta izomeri (m- MHA) eklinde atlr. Bu nedenle ksilene maruziyette idrarda balca m-MHA tayini yaplr. Son yllarda, dier izomerlerin ayrlmas ile ilgili almalar vardr.

1 3 3

Ksilene maruziyette, idrarda MHA tayini yaplr. MHA tayini : drarda MHA tayininde gaz kromatografik ve HPLC yntemleri

kullanlr. Toluen ksmnda, HA'n gaz kromatografisi ile analizinde m-MHA tayinde aklanmtr. Sonucun yorumu Akut toluen zehirlenmesinde ataksi, bulant, kusma, solunum

depresyonu, koma ve kardiyak aritmi grlr. Hepatorenal hasar genelde yoktur. drarda normal HA konsantrasyonu 0,1-0,2 g/l olarak verilmektedir. 1 g/l stnde deerler toluene n maruziyeti gsterir. Ancak diyet veya dier nedenlerle alnan benzoatn dlanmas gerekir. Akut zehirlenmelerde, lm, hippurik asit atlm ykselmeden oluabilir. Toluene mesleki maruziyetin biyolojik izlenmesinde, HA dzeyi (g/g kreatinin) eklinde verilmesi, deerlendirmede daha geerlidir. Daha nce kreatinine gre dzeltmeden ve idrardaki kreatinin tayini aklanmt. Bu dzeltmeye gre, idrarda HA iin kabul edilen maksimum deer, biyolojik maruz kalma indeksi (BE) 2,5 g/g kreatinindir. (Lauvvrys, L.K., 1986). nMHA ise normalde atlan bir metabolit deildir. Tiner kullanan i yerlerinde (mobilya iileri, otomobil boyaclar gibi) maruziyet derecesine gre HA ve mMHA atlm artar. Yaptmz bir almada mobilya cilalama ileminde alan kiilerde (n:57), idrarla atlan HA miktar 2.99 0.38 g/2 kreatinin bulunmutur (baknz: Doanyiit,R 1999 doktora tezi). 1.9 Fenoller: C 6 H 5 OH Sinonimleri : ( C 6 H 5 OH ) : Karbolik asit, asit fenik ; Trevleri : Krezoller (o,p,m-CH 3 ,C 6 H 4 OH); timol (C 6 H 3 CH 3 C 3 H7,OH)
134

Kullanma yerleri:

Dezenfektan, prezervatif, antiseptik

antipruritik

(kantlara kar) ve endstride kullanlr. MLD : Yaklak 10 m l / 7 0 kg insan (adi fenol iin). Fenollerin identifikasyonlar Fenoller, kan, idrar veya dokulardan asit ortamda su buhar distilasyonu ile izole edilir. Bunun iin su buhar distilasyonu apareyinin (ekil-3) B balonuna 25 ml kylm doku veya idrar, 4 ml (1 + 1) orannda seyreltilmi slfrik asit konur ve 5 ml su ile balon yukardan aaya doru ykanr. Karm su buhar akmnda distile edilir, distilasyona toplanncaya kadar devam edilir. Distilatta fenol a r a n m a s : i) Para pozisyonu substitte edilmemi veya nitro grubu bulunmayan fenollere Liebermann'n indofenol testi, genel grup deneyi olarak 100 ml distilat biyolojik materyalden izolasyonlar ve

uygulanabilir. Deney yle yaplr : 10-20 ml distilat, 2 defa 20 ml eterle ekstrakte edilir. Birletirilen eter ekstresi bir ka gram susuz N a 2 S 0 4 ilvesiyle kurutulur. Cam pamuundan szlr ve 2 ml kalncaya kadar uurulur. Bylece konsantre edilmi eterli ekstreden bir ka damla, kk bir porselen kapslde oda ssnda uurulur. Kalntya, 1 damla taze %1 N a N O , Konsantre slfrik asit iinde hazrlanm zeltisi konur, bir bagetle kartrldktan sonra bir damla su ilve edilir. Genellikle su ilvesi rengin iddetlenmesine sebep olur. Karm soutulduktan sonra 1 damla 4 N NaOH ile kalevilendirilir ve meydana gelen renk deimesi kaydedilir. Fenol ile mavi -> krmz -> yeil; krezollerle koyu

135

kahverengi; timol ile yeil -> krmz -> mavi renkler grlr. Bu deneyle 1 mikrogram (pg) fenol tannabilir. ile arama : 1 ml distilata; 1 damla %10 FeCI 3 ilve

i i) FeClj

edildiinde viyole renk meydana gelir. Salisilik asitten farkl olarak, bu renk, mineral asit, amonyak veya alkol ilvesiyle kaybolur. (Bu deney dorudan doruya 10 ml idrara 1 ml % 10 FeClj ilvesiyle de yaplabilir. Meydana gelen viyole renk sya dayankldr). iii) Millon deneyi : Kk bir kapsle, 1 damla distilat veya eterli

ekstreden konur ve 1 damla Millon reaktifi damlatlr. Karm bir ka dakika bekletilir. Eer bir renk deiimi grlmezse stlr. Fenol, soukta Millon reaktifi ile krmz renk verdii halde, dier fenoller ancak stmadan sonra renk verirler. Bu deneyle I pg fenol tannabilir. (Millon rekatifi: 10 g cva,20 mlkonsantre nitrik asitte zlr ve eit hacimde su ilave ederek hazrlanr). drarda fenoln diazolandrlm p-nitroanilin ile tayini Standard fenol zeltileri (Kalibrasyon iin) a) Stok fenol zeltisi : 0,5g saf fenol 10 ml suda zlr. 4 ml

hidroklorik asit ilavesinden sonra su ile 500 ml'ye tamamlanr (1 g fenol/l). b) Seyreltilmi fenol zeltisi : 1 ml stok fenol zeltisi su ile 100 ml'ye seyreltilir (10 pgfenol/ml) Reaktifler: 1) Diazo Reaktifi : a) p-nitroanilin zeltisi : 0,75 g p-nitroanilin 10 ml suda zlr, 20 ml konsantre hidroklorik asit ilave edilir. Su ile 250 ml ye tamamlanr, b) Sodyum nitrit zeltisi (% 5 lik N a N 0 2 ) : 5 g sodyum nitrat suda zlerek 100 ml ye tamamlanr. Kullanmadan hemen nce 25 ml (a) zeltisi, 1.5 ml (b) zeltisi ile kartrlarak reaktif hazrlanr. 2) Sodyum asetat zeltisi (% 50 lik)

136

Distilatta anilin aranmas zonitril deneyi : 5 ml distilata veya 0.5 ml eterle konsantre edilen

kalnt 0.5 ml kloroform ve 2 ml % 20 NaOH ilve edilir. Karm kaynatlr. Anilin varsa izonitrilin karakteristik kokusu duyulur. ndofenol ( hipoklorit) deneyi : 0.5 distilata 3-5 damla kalsiyum veya sodyum hipoklorit zeltisinden ilve edilir. Anilin varsa karmn rengi viyole-mavi veya mor-viyole olur ve zamanla renk kirli krmzya dnr. 2-3 damla % 2 fenol ve amonyak ilvesiyle tekrar sabit mavi renk meydana gelir. Bu deney ok duyarldr. Diazo deneyi : Kalnt veya 0.5 ml distilat 2 N HCI ile asitlendirilir. 2 damla % 5 N a N 0 2 ve 2 damla % 0.2 l-nafltol (2N NaOH de hazrlanm) ilve edilir. Anilinle krmz renkli diazo-boyar maddesi meydana gelerek ker. Bu deneyle 0.5 mikrogram anilin tannabilir. p-aminofenol aranmas Anilinin %80 kadar aminofenole dnerek idrarla atlr. Bu nedenle anilinle zehirlenmelerde idrarda p-aminofenol aranr. Bunun iin: 1 ml idrar 2-3 damla % 10 HCI ile asitlendirilir ve soutulur. 2-3 damla % 1 N a N 0 2 , 2-3 damla taze %1 -nafitol zeltisi (% 10 NaOH de hazrlanm) ilve edilir. Krmz renk p-aminofenol olduunu gsterir. (Kontrol deneyi yaplmaldr. Fazla miktarda a-naftol yanltc sonu verebilir, p-aminofenol tayini iin parasetamole baknz). Methemoglobin tayini (spektrofotometrik yntem) Anilinle zehirlenmelerde, kanda methemoglobinemi oluur. Bunun iin methemoglobin tayini zehirlenmenin tehisinde yardmc olur. Burada

laboratuvarmzda yaplan bir aratrmada kullanlan methemoglobin tayini aklanmtr (Vural, N.; Kahraman, R. 1988).

139

Yntemin Prensibi : Methemoglobin (MetHb) seyreltik asitli ortamda 630 nm'de karakteristik bir absorbsiyon band verir. Siyanr ilavesi ile MetHb, siyanmethemoglobine (CNMetHB) dnr ve absorbsiyonda dme olur. Bu absorbans fark MetHb miktar ile orantldr. MetHb yzdesinin llmesi iin, kan rneinin dier ksmn potasyum ferri siyanrle muamele edilir ve kandaki tm hemoglobin, methemoglobine dntrlr. Siyanr ilavesinden sonraki absorbans deiimi total Hb miktarn verir. Reaktifler: 0.07 M fosfat tamponu (pH 6,6) : 5,67 g anilin monopotasyum fosfat (K.H 2 P0 4 ) ve 3,55 g disodyum fosfat (Na 2 HP0 4 ) suda zlerek 1 litreye tamamlanr. pH kontrol edilir, gerekirse ayarlamas yaplr. 0.017 M fosfat tamponu (pH 6,6) : Stok 0,07 M fosfat tamponu 1:4 orannda seyreltilerek hazrlanr. Potasyum siyanr (KCN), saf granle. Potasyum ferri siyanr (K 3 (CN) 6 ), kristal. Triton-X 100 veya dier bir noniyonik aktif madde. Teknik : yi kartrlm 0,2 ml 0,17 M fosfat tamponu iine ilave edilir. Kk bir damla Triton-x 100 ilave ederek, tersyz edilir. Karm analiz tamamlanncaya kadar bekletilir. Eer tam berrak deilse, santrifj edilir. Hemoliz olmu kann bir ksm spektrofotometre kvetine aktarlr ve 630 nm'de fosfat tamponuna kar (kr) absorbans oluur (A|). Kvete birka mikrogram KCN ilave edilir ve kartrlr. Tekrar absorbans 630 nm. de okunur (A 2 ). Eer absorbans deimeli ise (A = A 2 ), o zaman MetHb yoktur ve ileme devam edilmez. Kan rneinin dier bir ksm, yukarda akland ekilde fosfat tamponu ile seyreltilir ve hemoliz edilir. 5 mg potasyum ferrisiyanr ilave

140

edilerek kartrlr. Karm, temiz bir spektrofotometre kvete aktarlr. Absorbans 630 nm'de fosfat tamponuna kar okunur (A 3 ) Birka miligram potasyum ferro siyanr ilavesinden sonra kartrlr ve tekrar fosfat tamponuna kar 630 nm ile absorbans okunur (A 4 ). Kalibrasyon : Yukarda llen absorbanslar aadaki formle konarak % MetHb hesaplanr.
A| - A 2

x 100 = % MetHb (saturasyon yzdesi)

A 3 - A4

Sonucun deerlendirilmesi : Normal kiilerde % 0,5 g kadar MetHb bulunabilir. MetHb nemi yapan ilalar ve kimyasal maddeler MetHb dzeyi artabilir. MetHb dzeyi % 10-15 olduunda siyanozis grlr. Ayrca MetHb dzeyi yangn olaylarnda, ekzos gazna bal

zehirlenmelerde ykselebilir. MetHb tayininde heparinize venz veya arteriyal kan kullanlabilir. Hemoliz olmam kan rnekleri buz dolabnda birka saat saklanabilir. Fakat analiz tercihen en ksa zamanda yaplmaktadr. nk alnan kan rneindeki MetHb olduka tuzlu bir ekilde bozunabilir (Bauer, S.D., 1970).

3. UUCU

OLMAYAN

ORGANK

ZEHRLERN

BYOLOJK

MATERYALDE ANALZLER Bu blmde sk zehirlenmelere neden olan ilalar kullnlmaz kontrol altnda olan ilacn maddelerle, tokksikolojide nemli olan baz pestisitlerin analizinden bahsedilecektir. Uucu olmayan organik bileik yapsnda olan bu maddeler biyolojik materyalden ekstraksiyon la izole edilirler.

141

2.1. Barbitratlar o o Barbitratlar, barbitrik asitin 5,5disubstite azot da

trevleridir. Ayrca

1 no'lu

pozisyondaki

metillenebilir (metil fenobarbital gibi). ok kullanlan o barbitratlara rnek olarak amobarbital (5-etil5-

izopen-tilbarbitrik asit), barbital (5,5 dietilbarbitrik asit), pentobarbital (5-etil-5) (1-metilbtil) barbitrik asit), fenobarbital (5etil-5-fenilbarbitrikasit), secobarbital (5-allil-5 (1-tilbtil) barbitrik asit) ve tiyopental (5-etil-5 (lmetilbtil)-2- tiyobarbitrik asit) rnek verilebilir. Barbitratlarn molekl arlklar yaklak 226 ile 242 arasnda deiir. Genel olarak kokusuz, ac lezzette beyaz toz kristal halindedirler. Zayf asit yapda olup, suda znmezler. Barbitratlar, potent hipnotik ve sedatif etkilidirler. Barbitratlardan sadece tiyopental (iv yolla) ve fenobarbital geni bir alanda kullanlrlar. Bamllk yapan maddelerdir. lkemizde suistimallerinin engellenmesi iin kullanmlar "yeil reeteye" balanmtr. Barbitratlarla akut zehirlenmede, uzun, ksa veya orta etkili barbitrat zehirlenmesi olup olmad belirlenmelidir. Bunun nedeni, uzun etkili

barbitratlarn (barbital veya fenobarbital gibi) atlm alkali direzis ile hzlandrlabilir, fakat dierlerinin atlmlarn etkilemez. Barbitratlarn

insanda minimal letal dozlar 1-6 g/kg arasnda deiir. Barbitratlarn genel olarak tanmlanmalar iin ekstrakta uygulanan baz renk reaksiyonlar vardr. Ancak kalitatif analizleri iin en iyi yntem, idrar, mide muhtevas veya olay yerinden elde edilen rneklerden

ekstraksiyon la izole edildikten sonra TK ile identifikasyonlardr. Bu ekilde barbitrat cinsini de saptamak mmkn olabilir.

142

Barbitoratlarn total tayinleri spektrofotometrik yntemle yaplabilir. Bu yntem numunenin ekstraksiyondan sonra, pH 11 den pH 2 ye kadar spektrol kaymalarnn karekteristik olmasna dayanr. Aada bu yntem aklanmtr. Ancak bu analiz iin "ift n demetli" spektrofotometre gereklidir. Barbitratlarm ayrlmas ve ayr ayr tayinleri duyarl ve kesin olarak, GLK veya HPLC ile gerekletirilebilir. Barbitratlarm idrardan izolasyonlar ve tannmalar Barbitratlar idrardan asit ortamda ekstraksiyonla izole edilirler. 100 ml idrar bir ayrma hunisine konularak N HCI veya seyrettik H 2 S 0 4 getirilir.2 defa 50 ml eterle ekstrakte edilir. Eter ekstraklar 2 katl kuru filtre kadndan szlerek eser miktardaki suyun uzaklatrlmas salanm olur. Eter faz lk su banyosunda uurulur. Kalnt sar renkte ise, 15 ml kloroformda zlr. Az bir miktar (kibrit p ba byklnde) hayvansal kmr konularak kartrlr. Karm kk bir behere szlr. 1-2 ml kalncaya kadar uurulur. Kloroform ekstraktnda barbitratlarm aranmas : Parri deneyi : Birka damla kloroform ekstrakt mikro bir tpe konur. 2 damla %1 kobalt nitrat veya kobalt asetat (susuz metil alkolde hazrlanm) ilave edilir. Karma 3 damla %5 izopropilamin (susuz metil alkol iinde) yavaa damlatlr. HgNQ3 ile kme deneyi : Kloroform kalntsndan bir miktaralnarak suda doymu zeltisi hazrlanr. 1 damla (Hg + H N 0 3 ) reaktifinden

damlatlr. Fenobarbital (luminal), noktal (noctal), fanadorn (phanadorn), barbital (veronal) ile beyaz bir kelek olmaz. K M n 0 4 ile indirgeme : 0.2 g kadar kalnt, 2 ml su ile stlr ve souduktan sonra szlr. Szntde, doymam bal radikaller ihtiva eden

143

barbitratlardan (evipan, noktal, fanadorn gibi) varsa, iki damla % .1 K M n 0 4 zeltisi damlatldnda, bir dakika ierisinde permanganatn rengi kaybolur. Luminal, veronal, prominal ise ift bal radikalleri olmadndan

indirgenmezler. Barbitratlarn TK ile identifikasyonlar drardan yukardaki teknikle izole edilen kalntlarn TK ne

uygulanarak hangi barbitrat olduunu tanmlamak mmkndr. TK ile daha az miktarda idrarla (20 ml) sonu alnabilir. Aadaki laboratuvarmzda uyguladmz ekstraksiyon TK teknii verilmitir. Gerekli reaktifler : Barbitrat standartlar (Saf aktif maddeler) : (Metanolde % 0.1 lik); Barbital (Dietil barbitrik asit); Feobarbital (Etilfenil barbitrik asit);

Phnobarbital (Etilpentil barbitrik asit); Phanadorn - ((pnos) (Siknohekzenil etil barbitrik asit); Itobarbital (Allii isobutil Phnobarbital barbitrik asit) Pskrtme reaktifleri: a) % 2 HgNOj (%1 HgNOj'te) ; b) % 0.1 Rhodamin B (Etil alkolde). Kullanlmadan nce (a) ve (b) eit hacimde kartrlr. c) % 0.04 Flourscein (Etil alkolde) Developman zeltileri : (Kloroform : absol etanol: % 25 N H 3 ) : (50:40:10) hacmen (D,) (Kloroform : aseton : % 25 N H 3 ) : (40:72:8) hacmen (D 2 ) (Sitrat tamponu (pH 2 . 2 ) : a) 1.187 g N a 2 H P 0 4 . 2 H 2 0 distile su ile 100 ml ye tamamlanr, b) 0.1 M sitrik asit. 20 ml (a) zeltisi ile 950 ml (b) zeltisi kartrlr. Aktif kmr (hayvansal):

144

Teknik : 20 ml idrara, 10 ml tampon (pH 2.2) ve 15 ml kloroform ilavesinden sonra cam kapakl bir erlenmayerde 15 dakika sk aralarla

alkalanr. Santrfij tpne aktarlarak 1500 r.p.m. de 30 dakika santrifj edilir. Kloroform faz ayrldktan sonra, ayn ilem 15 ml kloroform ile tekrarlanr. Birletirilen kloroform fazlar 500 mg aktif hayvansal kmrle 5 dakika kadar alkalanr ve szldkten sonra da oda ssnda uurulur. Kalnt pek az metanolde zlerek, adsorban tabakaya (Silikagel G) 20 pl kadar nmune uygulanr. Developmandan sonra kromatogramlarnn deerlendirilmesi iin yalnz H g N 0 3 veya H g N 0 3 ve arkadan ( H g N 0 3 +

Rhodamin B) reaktifi pskrtlr. Barbitratlar H g N 0 3 ile beyaz leke verir (duyarllk 5 pg) H g N 0 3 ve Rhodamin B + H g N 0 3 ) reaktiflerinin kombine uygulanmasnda ise pembe - viyole renk elde edilir. Tablo 15'de baz barbitratlarla elde edilen Rf deerleri grlmektedir.
T a b l o 15 - Baz developman zeltileri ile barbitratlarn silikagel -

G t a b a k a d a verdikleri R f deerleri.

Rf, Fenobarbital Barbital Fanadorn Itobarbital Pentobarbital 0.45 0.59 0.66 0.68 0.78

Rf 2 0.25 0.30 0.32 0.38 0.48

Not : Rf:D; Rf 2 :D 2 ile elde edilen deerler (Barbitratlarn TK ile ayrlmalar iin genel blme baknz.)

145

Barbitratlarm

kanda

ultraviyole

alanda

spektral

kayma

yntemi ile kantitatif analizleri Bu amala biyolojik materyal olarak tam kan, plazma veya serum kullanlabilir. 1) 5 ml numune 1 damla %5 lik slfrik asit ile hafif asitlendirilir ve 25 ml kloroform ile ekstrakte edilir. Kloroform faz szlr ve 5 ml 0,5 N sodyum hidroksit ile alkalanr. Sodyum hidroksit faz ayrlr, kalabilen kloroform damlalar santifjle ayrlr. UV alannda (220-300 nm) arasnda spektrumu alnr. Barbitratlar bazik ortamda, 255 nm de maksimum, 235 nm de ise minumum absorbans gsterirler. 255 nm de gsterilen absorbans lmnden, standardla hazrlanan eimden yararlanarak kantitatif tayin yaplabilir. Bu testin duyarl 2 ng/5 ml kandr. 2) Barbitratlarm, farkl pH:2 ve pH:10 da gsterdikleri absorbans kaymasndan aklanmtr. Reaktifler: Borat tamponu (pH 8.4) : 22.4 g disodyum tetraborat 76 ml sulu yararlanarak daha duyarl ve spesfik tayini ise aada

hidoklorik asit (1 mol/1) ile kartrlr ve saf su ile 2 litreye tamamlanr. - Seyreltik hidroklorik asit (2 mol/l) - Konsantre slfrik asit (d: 1.84) - Konsantre amonyum hidroksit (d:0,88) - Sodyum slfat / aktif kmr karm : 100 mg aktif kmr, 100 g susuz sodyum slfat ile kartrlr ve bir 100C de 8 saat stlr. Souduktan sonra az sk kapal bir iede saklanr, stlr. Souduktan sonra az sk kapakl bir iede saklanr.

146

Standard lar : nsan plazmas iinde 5,10,25 ve 50 ja.g/1 konsantrasyonda barbital ierecek ekilde stok sodyum barbital zeltisinden (1.12 g/l : 1.00 g/l dietil barbitrik asite edeer) seri standardlar hazrlanr. Teknik : 250 ml lik bir ayrma hunisine 5 ml nmune (kan, serum ve plazma), 2 ml hidroklorik asit ve 60 ml dietil eter konur. Huninin kapa su ile slanarak kapatlr ve dikkatle 2 dakika alkalanr. Karm5 dakika bekletilir, fazlar ayrldktan sonra alt (sulu) faz, huninin altndan uzaklatrlr. Dietil eter faz, ikinci bir hunide bulunan 10 ml borat tamponu zerine aktarlr ve 1 dakika alkalanr. 5 dakika bekledikten sonra alt faz atlr. Huninin i evresi 5 ml su ile temizlenir, 5 dakika beklenir ve tekrar alt faz atlr. Eter traktna 4 g kadar sodyum slfat / aktif kmr karm ilave edilir, kartrlr. Ekstrakt, faz ayran filtre kadndan 150 ml lik bir balonjojeye szlr. Ayrma hunisine 20 ml daha eter ilave edilerek ekstraksiyon yaplr. Ekstrakt, nceki ekstrakt ieren balonjojeye szlr. Ekstraktlar basnl hava veya azot akmnda 40C de kurulua kadar uurulur. Kalntya 5.0 ml distile su ilave edilerek dikkatle kartrlr, 5 dakika bekletilir. zelti, faz ayrc filtre kadndan 12,5 ml lik bir test tpne szlr. Filtrattan 4 ml alnarak, spektrofotometre kvetine aktarlr. 50 p.1 konsantre amonyum hidroksit ilave ederek, pH nn 10 civarnda olup olmad universal pH kad ile kontrol edilir. Sfr ayar 240 nm de kontrol edilmi "double beam" bir

spektrofotometrede, karmn absorbans 240 nm de suya kar okunur. Eer,

147

mmknse, spektrofotometrede 200 - 450 nm arasnda zeltinin spektrumu alnr spektrofotometrede okunur ve tarama ilemi 5 dakika sonra tekrarlanr. Kvete 0.1 ml konsantre slfirik asit ilave edilerek, kartrlr ve pH nm 2 olup olmad kontrol edilir. 240 nm de karmn absorbans okunur, 200-450 nm de spektrumu alnr. Sonu: UV absorbsiyonu ve spektrumunu birok maddeler interfere edebilir. rnein glutetmid, kalevi ortamda hidroliz olarak, 240 nm de (pH 11 de) absorbansn belirgin ekilde dmesine neden olur. Metakualon, fenazon gibi maddeler 200-450 nm arasnda spektromu etkileyebilirler. pH'si 10 olan ekstrakta 0.1 ml seyreltik sodyum hidroksit (2 mol/l) zeltisi ilave edilerek, (pH 14) tekrar spektrumu alndnda oluan spektral deime, barbitratlarn kalitatif analizler iin yararl olur. Kantitatif analiz : pH 2 ve pH 10 da, 240 nm deki absorbans fark llr. Standard barbitrat zeltileri ile hazrlanan kalibrasyon erisinden yararlanarak miktar tayini yaplabilir. Veya hesaplanabilir. c (mg /1) = ao - a 2 ) x 25 x dilsyon faktr (varsa) ao : pH 10 daki absorbsiyon a 2 : pH 2 deki absorbsiyon yntemin duyarl 2 ml barbitrat /I dir. ekil 18'de, sodyum barbitalin eitli pH de UV alanndaki aadaki formlle barbitrat konsantrasyonu (C)

spektrumlar grlmektedir.

148

Dalgaboyu (nm)

ekil 18- Sodyum barbitalin deiim deiik pH da UV spektrumu Barbitratlarn GLK ile identifikasyon ve tayinleri GLK ile serum veya plazmada barbitratlarn identifikasyonu iin genelde SE-30 ve poly A 103 sv fazlar kullanlr. Burada SE-30 ieren kolon kullanarak, GLK ile barbitrat analizi aklanmtr. (Moffar A.C ve ark. 1986; Vural. N ve Aksu. N., 1992) Standartlar : 10 pg/ml konsantrasyonda barbitrat standardlar (barbital, butobarbital, pentobarbital gibi) kloroform iinde hazrlanr. Teknik: 100 pl seruma 10 pl fosfat tamponu (pH 5.6) ilave edilir ve

100 pl kloroform ile ekstrakte edilir. standard olarak tetrafenil etilen (10 pg/ml) ekstraksiyondan nce kloroform iine ilave edilir. Ekstraksiyon iin karm 30 saniye alkalanr. 5-10 dakika 3000 rpm de santrifj edilir. Kloroform ekstrakt dorudan gaz kromotografa enjekte edilir. Gaz kromotografisi koullar : Sabit faz %3 SE-30 "Chromosorb WHP 80-100 misli stnde", Detektr: FID; kolon 2m x 3 mm i ap ; Enjeksiyon giri scakl : 220-240C ; Detektr scakl : 220C ; frn scakl : 180-

149

220 C; tayc gaz (ozon) ak hz : 40 ml/dakika ; hidrojen ak hz : 30 ml/dakika; hava ak hz ; 300 ml/dakika. Elde edilen kromatogramlarn alkonma zamanlar ve pik ykseklikleri standartlarla karlatrlarak kalitatif ve kantitatif deerlendirme yaplr. Analiz sonucunun yorumu Ar dozda barbitrat alm, periferal vazodilatasyon, hipotansiyon, ok, hipoventilasyon, hipotermi, koma, konvlziyonlar ve renal yetmezlie neden olur. lm solunumu veya kalp solunumu durmas sonucu oluur. Plazma barbitrat dzeyi uzun etkililer in 10 mg/1 stnde olduunda (barbital ve fenobarbital iin 50 mg/1) toksisite iddetlidir. Koma grlebilir. Ksa ve orta etkililer iin 3 mg/1 stnde iddetli toksisite ve lm grlebilir. 2.2. Benzodiazepinler
o

Benzodiazepinlerin

genel

yaps

aada

gsterilmitir. Saylar 60 kadar olan bu grup ilalarn arasnda diazepam, flurazepam, lorazepam,

klordiazepoksit,

klornazepam,

nitrazepam, oksazepam en ok bilinenlerdir. Tablo 16'da nemli benzodiazepinler gsterilmitir.

Benzodiazepinler

genelde

trankilizan;

bazlar

ise

(Klobazam,

klonezepam ve diazem) ayrca antikonvlzan olarak kullanlrlar. Temazepam zellikle dier ilalarla birlikte suistimal edilir. Benzodiazepinlerin ou tamamen metabolize olurlar ve bu gruptaki birok benzodiazepinler

dierlerinin metabolitidir. rnein diazepem, nordazepam, oksazepam (3-

150

hidroksinordazepam) ve temazepama (3-hidroksidiazepam) metabolize olarak glukuronid veya slfat konjugat eklinde atlr.
T a b l o 16. Baz nemli Bileik Kimyasal ismi benzodiazepinler Molekl ktlesi 300 301

Klordiazepoxid Klohazam

7-klora-2-metilamino-5-fenil(3H-l,4-benzodiazepi 4oksit 7-kloro-l-metil-5-fenil-lH-l,5-benzodiazepin2,4(3H,5H)-dion 5-(2-klorofenil)-l,3-dihidro-7-nitro-2H-l,4benzodiazepin-2-on 7-kloro-1,3-dihidro-1 ,metil-5-fenil-2H-1,4benzodiazepin-2-on 7-kloro-l-(2-dietilaminoetil)-5-(2-florofenil)-l,3dihidro-2H-1.4-benzodiazepin-2-on 7-kloro-5-(2-klorofenil)-l.3-dihidro-3-hidroksi-2,H-l,4benzodiazepin-2-on l,3-dihidro-7-nitro-5-fenil-2,H-l,4- benzodiazepin-2-on 7-kloro-l,3-dihidro-3-hidroksi-5-fenil-2,H-1,4benzodiazepin-2-on 7-kloro-1,3-dihidro-3-hidroksi-l -metil-5-fenil-2,H-l ,4benzodiazepin-2-on

Klonazepam Diazepam

316 285

Flurazepam l.orazepam Nitrazepam (Kazepam Temazepam

388

321 281 287

301

Benzodiazepinler iin gvenilir bir renk reaksiyon yoktur. Bununla beraber, birok benzodiazepinler ve konjugatlar, asit hidrolizle

aminobenzofenonlar verirler. Bu hidroliz rnler ekstrakte edilip TK ile identifikasyonlar yaplabilir. Bu amala iki farkl renk reaksiyon kullanlr. Bunlardan reaksiyonu biri nitrik asit/N-( 1 -naftil) etilendiaminle dieri ise verdikleri renk

(Bratton-Marshall

reaksiyonu);

p-dimetilamino-

kinnamaldehitle oluturduklar renk reaksiyonudur.

151

Benzofenonlarn TK ile kalitatif analizleri Reaktifler : - Konsantre (d: 1.18) ve sulu hidroklorik asit (1 mol/l) - p-dimetilamino sinnamaldehit zeltisi (5 g/l suda) - Trikloroasetik asit zeltisi (500 g/l suda) - Slfrik asit (500 ml/1) - Sodyum nitrit zeltisi (10 g/l, taze hazrlanm) - Amonyum slfamat zeltisi (50 g/l) - N- (1-naftil) etilen diamin hidroklorr (10 g/l) seyreltik hidroklorik asit iinde (1 mol/l) Standartlar : Deiik benzodiazepinlerin (klordiazepoksit, oksazepam, diazepam, nitrazepam gibi) , 100 mg/l konsantrasyonda (sulu HC1 iinde) zeltileri hazrlanr. Yntem : drar, mide ierii ve olay yerinden elde edilen kalntlara uygulanabilir. 10 ml rnee, 30 ml lik cam kapakl bir tpte 3 ml konsantre hidroklorik asit ilave ederek kartrlr. Tpn kapa alarak, eker ocakta, kaynar su banyosunda 30 dakika bekletilir. Karm souduktan sonra, 10 ml petrol eteri ilave edilir, tpn az kapatlr ve 10 dakika dikkatle kartrlr. 5 dakika santrifj edildikten sonra, st faz temiz bir tpe aktarlr. Ekstrakt basnl hava veya azot akmnda 60C de kurulua kadar uurulur. Benzodiazepin standardlarna da ayn ilem uygulanr. TK ya uygulama : Kalnt 100 pl petrol eterinde zlr. Silikagel-G ile kaplanm, 10x20 cm boyutundaki cam levhalar drt kolona (2 ift kolon)

152

ayrlr. Her bir ift k o l o n a sras ile 25

damlatlr.

JLX1

nmune

ve Standard e k s t r a k t l a r

Numune ve standart uygulanm silikagel-G tabaka, toluen/buzlu asetik asit (97:3) le nceden doyurulmu kromatograf tanknda, developze edilir. zc ykseklii 10 cm ye kadar ilerledikten sonra, levha tanktan karlr ve kurumaya braklr. Renklendirme : lk 2 kolona p-dimetilaminosinnam aldehit zeltisi ve ardndan trikloroasetik asit zeltisi pskrtlr. Kalan dier iki kolona sras ile slfrik asit, sodyum nitrit zeltisi, amonyum sulfamat zeltisi ve N-(l-nafitil) etilendiamin hidroklorr zeltisi pskrtlr (Bratton -Marshall reaksiyonu). Her reaktif pskrtlmesinden sonra, tabakann kurumas iin bekletilir. Oluan renkler standartlarla

karlatrlr.(Tablo 17)
Tablo 17-: Benzofenonlarn Benzofenon T K d a r e n k r e a k t i f l e r i ile v e r d i k l e r i Olutuu benzodiazepin A* renkler. B**

Meti laminoklorobenzofenon

Diazepam Temazepam

mor

Aminoklorobenzofenon

Oksazepam Klordiazepoksit Nordazepam

mor

mor

A m i nod i klorobenzofenon A m i non itrobenzofenon Diaminobenzofenon Aminonitroklorobenzofenon

Lorazepam Nitrazepam Nitrazepam Klonazepam

mor pembe mor pembe

mor mor Mavi Mavi

A* ; renk reaktifi: p-dimetil amino cinnamaldehit, trikloroasetik asit; B *; Bratton -Marshall reaksiyonu

153

Bu yntemle, bir ok benzodiazepinler idrarda hidrolizle metilaminoklorbenzofenon ve/veya aminokloro benzofenon verdikleri iin, sonucun yorumu zorlaabilir. rnein temazepam veya oksazepam ile diazepam veya nordazepam ayrt etmek mmkn deildir. Bunun dnda, medazepam, triazolam, klobazam, norklobazam ve midazolam hidroliz ile benzofenon vermezler. Bu yntemle 1 mg/1 (aminoklorobenzofenon olarak) madde tannabilir

2.3. Salisilik Asit ve Trevleri

Salisilikasit

Asetil salisilik asit

Salisilamid

Metil salisilat

4-Aminosalisilik asit

Genel olarak nonnarkotik analjezikler grubunda olan salisilik asitin balca trevleri aada aklanmtr. Salisilik asitin (2-hidroksibenzoik asit) (C 7 H 6 0 3 ) kendisi topikal

olarak eitli dermatolojik bozukluklarn tedavisinde kullanlr. Molekl ktlesi 138 dir. Asetik salisilik asitin plazmadaki balca metaboliti salisilik asittir. Ayrca metil salisilat ve salisilamidin de metabolitidir. drarla balca

154

gitsin konjugat (salisilrik asit) eklinde atlr.Salisilik asit trevlerinin kullanma yerleri aada ksaca aklanmtr Asetil salisilik asit (aspirin) : (C 9 H g 0 4 ) salisilik asitin ila olarak en ok kullanlan trevidir. Molekl ktlesi 180 dir. Asetilsalisilik asit analjezik olarak kullanlr. Minimum letal dozu 15 g dr. Plazma esterazlar tarafndan in vivo olarak ok abuk salisilik asite hidroliz olur ve glisin konjugat eklinde idrarla atlr. p-aminosalisilik asit : PAS veya 4-amino-2-hidroksi benzoik asit

(C7H7 NO3), molekl ktlesi 151 dir. Tberkloz tedavisinde kullanlr. Metil salisilat : Metil-2-hidroksibenzoat, salisilik asit metil esteri (C 8 H 8 0 3 ), molekl ktlesi 152 dir. Metil salisilat (keklik zm ya), oda scaklnda sv bir madde olup kuvvetli bir kokusu vardr ve topikal ilalar iinde yaygn olarak kullanlr. Oral yolla asetil salisilik asite gre daha ok toksiktir. nk daha abuk absorbe olur. Oral yolla ocuklarda 4 ml, yetikinlerde 30 ml, genelde lme neden olur. Metil salisilat, ksmen in vivo olarak salisilik asite metabolize olur. Salisilamid : 2 hidroksibenzamid (C 7 H 7 N 0 2 ) , molekl ktlesi 137

dir. Analjezik olarak kullanlr. Hidrolizle salisilik asit verir. Salisilatlar, demir-3- (ferri) iyonlar ile mor renk verir. Bu reaksiyona dayanan kalitatif ve kantitatif yntemlerin uygulanmas aada aklanmtr. Asetilsalisilik asit ve metil salisilat, ferri iyonlar ile bu reaksiyonu vermezler. Bu nedenle alnan rneklerin (mide ierii olay yeri kalntlar) analizden nce hidrolizleri gerekir. Salisilamid de idrarda ancak hidrolizden sonra tannabilir.

155

Salisilatlarn kalitatif analizi Bu deney mide ierii, idrar ve olay yerinden alnan rneklere

(zehirlenen kii evresinde bulunan ambalaj, ie veya dier kalntlara) uygulanr. Salisilatlarn kalitatif ve kantitatif analizinde en ok, demir-3- iyonunu viyole renkli kompleks vermelerine dayanan renk reaksiyon kullanlr. Bu amala, Trinder reaktifi kullanlr. Trinder reaktifi : 40 g merkri (cva -2) klorr, 850 ml saf su ve 120 ml sulu hidroklorik asit (1 mol/1) iinde zlr, 40 g sulu demir -3- nitrat ilave edilir, su ile 1 litreye tamamlanr. Yntem kartrlr. : 2 ml rnee 0,1 ml Trinder reaktifi ilave edilerek 5 saniye mide ierii, olay yerinden elde edilen rneklerde

drar,

asetilsalisilik asit ve metil salisilat, ayrca idrarda salisilamid aranacaksa: nce 1 ml rnek 1 ml sulu hidroklorik asit (0,1 mol/l) 10 dakika kaynatlr, souduktan sonra gerekirse szlr. Sznt 1 ml sodyum hidroksitle (0,1 mol/l) ntralize edilir. Sonra 1 ml Trinder reaktifi ilaveedilerek 5 saniye kartrlr. Viyole rengin olumas, salisilatlarn varln gsterir. Koruyucu madde olarak asit varsa, bu deneyle kuvvetli reaksiyon verir; idrarda yksek konsantrasyonda keton cisimleri varsa, hafif (yanl) pozitif sonular alnr. Bu deneyle tedavi dozunda alnan salisilik asit ve trevlerinin tannmas mmkn olur. Salisilatlarn spektrofotometrik yntemle tayini Serum, plazma, idrar veya serebrospinal svda salisilatlar demir-3 klorrle verdikleri renk reaksiyonuna dayanarak ile tayin edilebilir. Serumda proteinlerin ktrlmesi cva-2- klorrle (HgCl 2 ) yaplr. Bu nedenle, HgCI 2 ve hidroklorik asit ieren kombine Trinder reaktifi kullanlr.

156

Trinder

reaktifi

(kombine)

: Kalitatif testte akland ekilde

hazrlanr. Ortamda fazla hidroklorik asit olmas, viyole rengin iddetini azaltabilir. Bu nedenle reaktifin asiditesi 0,12 N'den fazla olmamaldr. Standart salisilat zeltileri : 0, 200, 400 ve 800 mg/1 konsantrasyonlarda salisilik asit ierecek ekilde su iinde hazrlanr. +4C de saklanr. Kanda (plazma veya serumda) salisilat tayini : 1 ml plazma veya seruma 5 ml Trinder reaktifi ilave edilir. 30 saniye vortekste kartrlr. 5 dakika santrifj edilir. Spernatant (st faz) bir tpe aktarlr. Salisilat varlnda oluan Viyole renkli zeltinin absorbans 540 nm de spektrofotometrede kre kar okunur. Kr (blank) 1 ml ila iermeyen seruma 5 ml Trinder reaktifi ilave ederek, numunede olduu gibi paralel alarak hazrlanr. Duyarlk 50 mg salisilat/l dir. Hazrlanan standartlarla, numunede olduu gibi ayn teknik uygulanr. Konsantrasyona (apsis) kar absorbans (ordinat) iaretlenerek grafik

hazrlanr. Serum salisilat dzeyi, bu hazrlanan kalibrasyon hesaplanr. drarda salisilat tayini

erisinden

: Trinder yntemi esas alnarak, Chiou ve

Onyemelukv/e'nin (1974) gelitirdii spektrofotometrik yntemi ile tayin edilebilir. (Aksoy,H, N., 1997 Y.Lisans tezi) Teknik : 3 ml idrara, 2 ml konsantre hidroklorik asit ilave edilir. Bir gece (17 saat) 100C de hidroliz iin inkbasyona tabi tutulur. Tp

souduktan sonra 0,5 ml 6 N HCI ve 6 ml kloroform ilave edilir. 5 dakika santrifj edilir, sulu faz atlr. 3 ml lik kloroform faz baka bir tpe aktarlr. 6 ml civa-2- klorr iermeyen Trinder reaktifi ilave edilir. (40g 8 mol su ieren demir-3- nitratla 10 ml konsantre hidroklorik asit ilave edilir, iyice zldkten sonra distile su ile 1 litreye tamamlanr.)

157

Tp 10 dakika alkalanr ve santrifj edilir. Kloroform tabakas aspre edilir. Sulu fazn absorbans 540 nm de idrarla hazrlanan kre kar okunur. Kalibrasyon : Standartlarla (0,125; 0,25; 0,5; 1 ve 2 mg/l salisilat

ieren) deney uygulanr. Hazrlanan eriden, idrar salisilat konsantrasyonu hesaplanr. Not : drarda salisilat seruma uygulanan teknikle de tayin edilebilir. Ancak nce idrar 10-40 mg salisilik asit /100 ml idrar ierecek ekilde su ile seyreltilir. Genelde idrar rneine santifj uygulamas yaplmaz. Ancak gerektiinde santrifj edilir. Bu durumda salisilat iermeyen ayn ilem uygulanmaktadr (Trinder, P., 1954). Analiz sonucun yorumu Salisilat zehirlenmesinde metabolik asidozis karakteristiktir. Bu idrara (kr) da

nedenle kan gazlar analizi zehirlenmenin iddeti hakknda bilgi verir. Akut zehirlenme phesi olduunda, plazma salisilat konsantrasyonu tayin

edilmelidir. Tedavide salisilat konsantrasyonunun izlenmesi ve kan pH snn llmesi nemlidir. Yetikinlerde tedavi srasnda plazma salisilat dzeyi 30 m g / l 0 0 ml ye kadar ykselebilir. iddetli zehirlenmelerde, bu deer, 90-120 mg/l00 ml; orta derecede zehirlenmelerde ise 65-90 mg/l00 ml arasndadr. Kandaki salisilat dzeyi 120 mg/l00 ml yi atnda letal dozda salisilat alnmtr, koma ve lm grlr. Genel olarak letal doz 30 gram civarndadr. (325 mg lik aspirin tabletinden 105 adet alndnda). Yaptmz bir aratrmada, salisilat zehirlenmelerinde ocuklarda

ortalama kan salisilat dzeyi 28.53 13.22 mg/100 ml; yetikinlerde ise 52.73 30.87 mg/100 ml saptanmtr (Kp,., Vural.N., 1993).

158

2.4. Parasetamol Nonnarkotik analjeziklerden olan

HO

parasetamol

h3

veya sinonimi olan asetaminofen; N-asetil-paminofenol:CgH 9 N02 yapsnda, bal molekl ktlesi 151 olan bir maddedir.

NH "

-^o

Parasetamol

ok yaygn

kullanlan

bir analjeziktir. Fenasetin

ve

benorilat'n metabolitidir. Kendisi balca idrarla glukuronik asit ve slfat konjugat olarak atlr. Slfat ve glukuronid konjugatlarnn konsantre hidroklorik asitle

hidrolizi p-aminofenol verir. Bu madde de o-krezol ile konjuge olarak renkli bir boya oluturur. Bu reaksiyon, parasetamoln kalitatif analizinde duyarl bir test olarak kullanlr. Ayn test, kantitatif amala da kullanlr. Parasetamolunu identifikasyonu (kalitatif test) Parasetamol, biyolojik svda asitle hidrolizle edilir. Oluan p-

aminofenole aadaki yntem uygulanr: 0,5 ml numuneye (idrar, mide ierii veya olay yerinden elde edilen kalntlar), 0,5 ml konsantre hidroklorik asit ilave edilir. Karm 10 dakika kaynatlr ve soutulur. 0,2 ml hidrolizata 1 ml o-krezol zeltisi (10 g/l suda) ve 2 ml amonyum hidroksit zeltisi (4 mol/l) ilave edilir, karm 5 saniye kartrlr. Kuvvetli, koyu mavi rengin hemen olumas parasetamol varln gsterir. Bu test ok duyarldr ve teraptik dozda alnan parasetamoln 24-48 saat sonra bile deteksiyonu mmkn olur. Duyarlk 1 mg/l p-aminofenol'dr. Sadece aromatik aminler (anilin gibi, idrarda p-aminofenol eklinde atlrlar) reaksiyonu interfere ederler. Etilendiamin (aminofilin'in metaboliti) bu testle yeil renk verir.

159

Serumda parasetamoliin spektrofotometrik yntemle tayini Zehirlenmenin tedavisinde serum parasetamol dzeyinin izlenmesi

byk nem tar. Parasetamoln serumda tayininde a) asit hidrolizle verdii p- aminofenoln o- krezolle verdii renk; b) veya parasetamoln nitrz asitle verdii renk reaksiyonlarndan yararlanarak spektrofotometrik yntemle tayin edilir. o-krezol ile parasetamol tayini Bu yntemin prensibi, parasetamoln asit hidroliz ile oluan p-

aninofenoln o-krezol ile konjugasyonu sonucu verdii karekteristik mavi renkli rnn 615 nm de absorbansnn llmesine dayanr. Teknik : 0.2 ml seruma, 0.8 ml %5 trikloroasetik asit zeltisi ilave edilir. 2 dakika santrifj edildikten sonra spernatant baka bir tpe aktarlr. Tpn az kapatlarak 20 dakika kaynar su banyosunda bekletilir. Oda scaklnda soutulan tplere 1 ml o-krezol zeltisi (10 g/l) ilave edilerek kartrlr. Karma 2 ml amonyum hidroksit zeltisi (4 mol/l) ilave edilerek 2 dakika daha kaynar su banyosunda bekletilir. Tpler oda scaklnda soutularak oluan mavi renkli zeltinin absorbans 615 nm de kre kar okunur. Kr deney, serum yerine su alnarak ayn ilemlerin uygulanmas ile hazrlanr. Kalibrasyon : Standart parasetamoln su iinde 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0.4; 0,8 ve 1.0 mg/1 zeltileri hazrlanr. 0.2 ml standart zeltilerle teknik ksmda aklanan ekilde allr. Absorbanslar 615 nm'de okunarak,

konsantrasyona gre grafik izilir. Numunenin konsantrasyonu kalibrasyon dorusundan bulunur, sonu mg/lOOml serum olarak verilir.

160

Not

: Kr ve standart parasetamol zeltiler hazrlanrken su yerine

ila almam kiilerde elde edilen kan (serum) kullanlmas, daha uygun olmaktadr (WHO, 1997) Parasetamoln nitrz asitle tayini Bu yntemin prensibi, parasetamoln nitrz asitle reaksiyona girmesi sonucu oluan 2-nitro-5-asetaminofenoln alkali ortamda verdii sar rengin absorbansnn 430 nm de llmesine dayanmaktadr. Teknik : Bir tpte 1 ml serum veya plazmaya, 2 ml triklorik asit (100 g/l) ilave edilir, kartrlr ve 5 dakika santrifj edilir. Ayr bir tpe 1 ml hidroklorik asit (6 mol/l) ve 2 ml sodyum nitrit zeltisi (100 g/l, taze hazrlanm) ilave edilir, kartrlr. (Bu ilemde dikkatli olunmaldr. Kahverengi azot dioksit dumanlar kabilir!) Trikloroasetik asitle protein ktrlen ve santrifj edilen karmn siipernatantndan 2.0 ml alnarak, nitrz asit ( H N 0 2 ) oluturulan tpe ilave edilir, kartrlr ve oda scaklnda 2-3 dakika bekletilir. Fazla nitrz asitin giderilmesi iin, karma 2 ml amonyum slfamat zeltisi (150 g/l) damla damla ilave edilir. 2 ml sodyum hidroksit zeltisi (6 mol/l) ilavesinden sonra, vorteksle kartrlr, bylece kalabilen gaz damlacklar uzaklatrlr. Oluan sar rengin absorbans plazma ile hazrlanan kre kar 430 nm de okunur. Kalibrasyon : Standart parasetamol zeltileri blank plazma iinde 0; 50; 100; 200 ve 400 mg/l konsantrasyonda hazrlanr (Bu standart zeltiler +4 "C de dayankszdr. Bu nedenle, ya haftalk hazrlanmal veya -20C de saklanmaldr). Standartlar ve ila ilave edilmemi plazmaya yukarda aklanan ilem uygulanr. Nitrz asitle oluan renklerin absorbans 450 nm de kre kar

161

okunur.

Kalibrasyon

grafii

hazrlanr.

Numunedeki

parasetamol

konsantrasyonu grafikten hesaplanr. Not : Parasetamoln dier metabolitleri, bu yntemi interfere etmezler. Ancak, yntem, ila almndan 4-24 saat iinde sonu verir. Yntemin duyarl 50 mg/l dir. remide serumla hassasiyet daha azdr (100 mg/l). Salisilik asit az miktarda yntemi interfere eder. yle ki, serumda 1 g/l konsantrasyonda bulunan salisilat, 50 mg/l konsantrasyonda grnen

parasetamol dzeyi gsterir. 4-aminosalisilik asit ise reaksiyonu daha ok interfere eder. (100 mg/l 4-aminosalisilik asit, 320 mg/l konsantrasyonda grnen parasetamol dzeyi gsterir.) Levodopa, mukoz heparinle kontamine rnekler ve prezentatif olarak okezol ieren zeltilerde bu yntemi interfere ederler. Klinik deerlendirme Parasetamol zehirlenmesi, nce mide bulants , kusma gibi hafif semptomlarla balar. Ancak zehirlenmenin iddetine gre ileri dnemlerde (24-48 saat iinde) hepatik hasar balar, daha sonra da (3-5 gnler aras) hepatoksik belirtiler ortaya kar. Tedavide metionin veya N-asetil sistein, zehirlenmeden sonraki dnemde hasara kar korunabilir. Zehirlenmenin tedavisinde serum (plazma) parasetamol dzeyinin 12-15 saatler arasnda verilirse hepatik

llmesi ve izlenmesi byk nem tar. zellikle parasetamol almndan sonra ilk 4-10 saat iinde llmelidir. Eer aradan 24 saat veya daha uzun zaman gemise kalitatif test yaplmas yararl olur. Teraptik dozda alnan parasetamoln serumdaki dzeyi 0.5-2.0

mg/100 ml dir. 12 mg/100 ml ve stnde hafif zehirlenme, 30 mg/100 ml ve stnde ise hepatik nekroz oluur. (Gossel, A, T.,Bricker, J, A., 1984)

162

2.5. Fenasetin Fenasetin o C10H13NO2 (p-etoksiasetanilid; molekl ktlesi asetofenetidin); 179 olan bir

analjeziktir. Ancak kullanm, uzun sre almnda nefrotoksisiteye neden olduu iin braklmtr. Fenasetin, balca parasetamole metabolize olur. Bu nedenle, idrarda, okrezol/amonyak testi ile fenasetin atlm detekte edilebilir (parasetamol'e baknz). Klinik deerlendirme Akut toksik dozda fenasetin alm ba dnmesi, fori, siyanozis, hemolitik anemi, solunum depresyonu ve kardiyorespiratuar durmaya neden olur. ounlukla methemoglobinemiye neden olur (koyu ikolata renkli kan!). Kanda methemoglobin ve nmune (MetHb) alnr llebilir. alnmaz Ancak tayin MetHb

dayankszdr

hemen

edilmelidir.

Parasetamole metabolize olmakla beraber, fenasetin akut hepatorenal nekroza neden olmaz. Tedavisi semptomatik ve destekleyici tedavi eklinde yaplr. (Met Hb tayini iin : Anilin'e baknz)

3.

KULLANIMI

KONTROL

ALTINDA

OLAN

MADDELER

(VE

NARKOTKLER)

Adli Bilimler asndan uyuturucu (narkotik) madde deyimi yerine bugn kullanlan uluslararas ve ulusal dzeydeki yasalara gre "kontroll maddeler" (controlle substances) deyimi daha ok tercih Narkotikler bu maddelerin bir blmn iermektedir. Yasal olarak kontrol altnda olan maddelere bamllk yapan maddeler (psikotrop maddeler) ve narkotikler girmektedir. Bu maddeler eitli alardan (bamllk tipi, farmakolojik etkileri, toksikolojik zellikleri, kullanmlarn
163

edilmektedir.

dzenleyen yasalara gre) ve orjinlerine gre snflandrlabilirler. (Fazla bilgi iin: Siegel, j.A (Saferstenin,R.) 1988; Vural.N.,1996; Ellenhor J.M.1997 'ye baknz).

3.1. analizleri

Kontroll

maddelerin

"adli

tp

ve

toksikolojik

adan

Adli Bilimler asndan kontroll maddelerin analizinde dikkat edilecek balca noktalar, bu maddelerin analizlerinin uluslar aras laboratuvar kalitesi ve analizin standartlarna uymas ve sonularnn yasalar asndan

deerlendirilmesidir. Genel olarak hangi grup veya hangi madde olduu bilinmeyen bir nmunenin analizi aadaki analiz emasna gre yaplr. 1) Tarama testleri (genelikle spot testler ve mikroskopik inceleme) 2) Ayrma testleri 3) Destekleyici testler 4) Gerektiinde kantitatif analiz 5) Biyolojik materyalde analizleri

3.2. Spot testler "Spot testler", "damla deneyi" veya "renk deneyi" olarak da

isimlendirilir. Bu testlerin uygulanmas kk bir tp, saat cam veya tpfil iinde yaplr. Uygulamada, analizi yaplacak ok az miktarda numune stne renk reaktifi damlatlr ve kartrlr. Karakteristik rengin olumas belirli gruba giren maddelerin varln gsterir. Ancak hibir "spot test" tek bir madde iin spesifik deildir. Renk olumamas ise o maddenin yokluunu gsteren iyi bir indikatrdr.

164

ok kullanlan renk reaktifleri ve reaksiyonlar Froehde reaktifi : 50 mg molibdik asit veya sodyum molibdat 10 ml scak, konsantre slfirik asit iinde zlr (zelti renksiz olmaldr). Uygulamada bir damla reaktif, ok az miktardaki numune zerine damlatlr. Mandelin reaktifi : 1 g amonyum vanadat 100 ml konsantre slfirik

asit iinde zlr. Uygulamada bir damla reaktif, ok az miktardaki numune zerine damlatlr. Marquis reaktifi : 10 ml konsantre slfirik asit iine %40 lk

formaldehitten 10 damla damlatlr. Uygulamada bir damla reaktif, ok az miktardaki numune zerine damlatlr. Mecke reaktifi : 0,125 g selenz asit 25 ml konsantre slfirik asit

iinde zlr. Uygulamada bir damla reaktif ok az miktardaki numune zerine damlatlr. Vitali deneyi : 1 damla dumanl nitrik asit, ok az miktardaki numune zerine damlatlr. Oluan renk gzlenir. zelti kaynar su banyosu zerinde kurulua kadar bekletilir, varsa renk deiimi not edilir. Kalnt yeni

hazrlanm etanoll potasyum hidroksit zeltisi ile nemlendirilir ve oluan renk gzlenir. Liebermann reaktifi: 1 g potasyum nitrit 10 ml konsantre slfirik asit iinde zlr. Beyaz bir porselen tpfilde ok az miktardaki numuneye bir damla reaktif ilave edilir. (Kokain iin kullanlr) Kobalt tiyosiyanat: 6.8 g kobalt klorr ve 4.3 g amonyum tiyosiyanat 100 ml suda zlr. Kokain iin kullanlan bir renk reaksiyonunun

uygulanmasnda, toz halindeki numunenin ok az miktar zerine 0,5 ml reaktiften ilave edilir. Mavi tabaka eklindeki kelek kokain olma olasln gsterir. Baz kokain ile negatif sonu alnr. Bu nedenle numunenin nce hidroklorik asitle asitlendirilmesi gerekir.

165

Scott (Ruybal) t e s t i : Kokain iin kobalt tiyosiyanata gre daha spesfik bir testdir. R e a k t i f , 6.8 g kobalt klorr ve 4.3 g a m o n y u m tiyosiyanat bir ka d a m l a gliserin ieren 50 ml s u d a z l e r e k hazrlanr. Az miktardaki numune zerine 0.5 ml reaktif ilave edilir. Eer kokainin hidroklorik asit tuzu varsa, mavi renkli bir kelek oluur. Bu mavi kelek zlnceye kadar konsantre hidroklorik asit damlatlr. Mavi kelek pembe renkli zeltiye dnr. 0.5 ml kloroform ilave edilerek alkalanr.

Kloroform faznda turkuaz veya mavi renk oluur. Serbest kokain baz varsa kobalt tiyosiyanat ile kelek vermez. Bu nedenle konsantre hidroklorik asit damla damla ilave edilir. Bu durumda kokain baz ile kelek oluur, ancak sonra kaybolur. Duquenois-Levine reaktifi (D-L) : Marijuana (esrar) tannmasnda

kullanlr. Reaktif, 10 damla asetaldehit ve 1 g vanilinin 50 ml %95 etanol iinde zlmesi ile hazrlanr. Az kapakl cam iede saklanr. Renk, sararrsa kullanlmaz. Uygulamada, 30-100 mg numunenin petrol eteri ile alkalanmasndan elde edilen ekstrakt veya dorudan kuru bitki maddesi kullanlr. Tp iindeki numuneye 2 ml D-L reaktifi ve arkadan alkalayarak hidroklorik asit ilave edilir. Mor renk olumas esrar 1 ml konsantre

mevcudiyetini

(olasln) gsterir. 2 ml kloroform ilave edilir ve alkalanr. Bu test, esrar iin spesfik deildir. Baz bitkisel ekstraktlar, yalar ve baz kahve ekstraktlarlnn yanl pozitif sonu verdii gsterilmitir.

(Siegel,J.A. 1988). Bu nedenle esrar identifikasyonu mikroskop testi ve TK ile

desteklenmelidir.

166

Beam testi : Esrar iin kullanlr. Bir spatl ucu ile alnan numune 0.5 ml petrol eteri ile alkalanr. Petrol eteri szlerek bir kapsle alnr, su banyosunda uurulur. zerine alkolde hazrlanm KOH zeltisinden 2-3 damla ilave edilir. Esrar ya da reinesi varsa mor krmz renk oluur. Zvvikker reaksiyonu : Barbitratlar iin kullanlan en eski testtir.

Numune zerine 0,5 ml %0,5 lik bakr slfat zeltisi ve 0,5 ml kloroform iinde hazrlanm %5 lik pridin zeltisi ilave edilir. alkalandktan sonra fazlarn ayrlmas iin beklenir. Kloroform faznda mor renk olumas

barbitrat (asit veya tzu) olduunu gsterir. Parlak yeil renk olumas ise tiyobarbitratla ilgilidir. Buzlu (glasiyal) asetik asit ilavesi ile mor rengin ak mav iye, yeil rengin ise ak sar yeile dnmesine neden olur. Dillie-Koppany testi : Barbitratlar iin kullanlan Zvvikker

reaksiyonunun modifikasyonudur. 0.1 g kobalt asetat 100 ml suda zlr ve 0.2 g glasiyal (buzlu) asetik asit ilave edilir. Uygulamada, alnan az miktardaki toz numune zerine 1 damla kobalt asetat zeltisi damlatlr ve alkalanr. zerine 1 damla %5 lik izopropil amin (metanolde hazrlanm) ilave edilir. Krmzms mor renk barbitrat olduunu gsterir. Renk reaktifleri (spot test) ile maddelerin aranmalar : Baz maddelerin renk reaktifleri ile verdikleri "spot test" sonular

aada gsterilmitir : Kokain : - Kobalt tiyosiyanat ile - Scott (Ruybal) deneyi : mavi kelek : kloroform faznda maviden turkuaz rengine kadar deiim. - Lieberman reaktifi ile : sar
167

Morfin : - Marquis reaktifi ile - Fruehde reaktifi ile - Nitrik asit ile - Demir-3- klorrle (%10 luk) - Liebermahn reaktifi ile - Mandelin reaktifi ile - Vitali reaktifi ile Eroin : - Marquis reaktif ile - Froehde reaktifi ile - Nitrik asit ile - Mandelin reaktifi ile - Vitali reaktifi ile : mor : mor > yeil : sar > yeil : ak mavi-gri : ak sar - turuncu : mor : mor * grimor mor : turuncu - krmz * sar : mavi-yeil > yeil : siyah : mavi-gri : sar-turuncu

Fensiklidin (l-(l-fenilsiklohekzil):PCP) : - Marquis reaktifi ile - Mandelin reaktifi ile Amfetaminler : - Marquis reaktif ile turuncu-krmz kahverengi, bir damla su ilave edildiinde uzun dalgal UV de : ak pembe turuncu (kaybolur)

floresan verir - Mandelin reaktifi ile Barbitratlar : - Dillie-Koppany reaktifi ile : krmz-viyole - Zvvikker reaktifi ile - Zwikker reaktifi ile : mor, asetik asit ilavesi ile ak mavi : yeil, asetik asit ilavesi ile ak yeil (tiyotarbitratlar) : yeil-koyu yeil ; stlrsa krmz

168

LSD (d-lizerjik asit dietilamid) : - Erhlich reaktif ile : mor

- Marquis reaktifi ile : turuncu - > kahverengi-mor - Froehde reaktifi ile : zeytin yeili - mavi ve yeil - Mandelin reaktifi ile : turuncu - yeil - gri - Mecke reaktifi ile - Vitali reaktifi ile : zeytin yeili mavi-siyah : kahverengi-kahverengimsi mor

Marihuana (Esrar) : - Duquenois-Levine - Beam testi Meskalin : - Marquis reaktifi ile : turuncu -Mecke reaktifi ile : turuncu : kloroform faznda mor : mor-krmz

- Froehde reaktifi ile : yeil - mavi - Vitali reaktifi ile Psilosibin : - Marquis reaktifi ile - Mecke reaktifi ile - Mandelin reaktifi ile - Froehde reaktifi ile : donuk turuncu : yeilimsi * kahverengimsi yeil : yeil : zeytin yeili - sar : donuk krmz - krmz kahverengi

3.3. Mikroskopla inceleme Bu deneyler ya bitkisel orijinli numunenin mikroskop altnda bitki dokusunun ya dorudan veya uygun bir reaktif ilavesinden sonra

incelenmesine dayanr. Esrar rnek verilebilir. Dier bir teknik de, numunenin kimyasal bir yaps ile ok ilgili az

nikrokristalizasyon miktardaki bir

tekniidir.

Mikrokimyasal bir

yntemdir. kristal

maddenin,

uygun

reaktifle verdii

eklinin

mikroskopla incelenmesine dayanr.

169

Normal mikroskop dnda polarizasyon mikroskopu da kullanarak eitli kristallerin birbirinden ayrlmas mmkn olmaktadr. Organik kimyada, mikrokristalizasyon zellikle azotlu bileikler iin kullanlr. Gemite en ok alkaloidlerin ayrlmas iin kullanlyordu.

Zamanmzda ise antihistaminikler, sentetik narkotikler ve benzer bileik ve ilalar iinde kullanlmaktadr. Baz nemli narkotik gruba giren maddelerin mikroskop ve

mikrokristalizasyon teknii ile aranmalar aada aklanmtr. Esrar Esrar olduu kukusu olan bitki nmunesinden bir spatl ucu ile lam zerine konur. stne bir damla %1 Fast Blue reaktifi (%1 kloralhidrat iinde hazrlanm) damlatlp lamelle kapatlr. Numune esrar ise mikroskopla incelendiinde salg tylerinin krmz mor renk ald grlr. 3.4. Kodein ve morfinin mikrokristalizasyon teknii ile ayrlmas R e a k t i f : nce 10 g iyot, 35 g potasyum iyodrle birlikte 100 ml suda zlr. Bu ekilde hazrlanan potasyum iyodr-iyot (KI.l 2 ) reaktifi buz dolabnda saklanr. Hazrlanan bu reaktifden 0,4 ml alnr zerine 20 ml buzlu asetik asit ve 2.0 ml fosforik asit (H3PO4) ilave edilir. Teknik : ok iyi temizlenmi kk bir porselen kapsl iine bir damla reaktif ve bir damla test zeltisi ilave edilir. Bir bagetle iyice kartrlr. 5-10 dakika bekletilir. Karmdan bagetle bir damla alnarak lamele konur. Lamel ters evrilerek ukur lam zerine kapatlr, mikroskopla incelenir. Kodein gen eklinde dikroik (eitli renkler gsteren) kristaller verir. Morfin ise siyah ineler halinde kmelenir veya kahverengi krmz levha veya koyu krmz ekilde kristallenir (Duyarlk 10 mg civarndadr.)

170

Kokain : Reaktif: 2 g KMn04, 5 damla fosforik asit su ile 100 ml ye tamamlanr. Kokain hafif asitli ortamda K M n 0 4 ile ok karekteristik olan bir kenar krk dikdrtgen eklinde kristaller verir. 3.5. Narkotiklerin TK ile ayrlmas Narkotiklerin ve dier bamllk yapan maddelerin ierdikleri dolgu maddesi, seyreltici ve dier benzeri etkili maddelerin indentifikasyonlar ve birbirlerinden ayrlmalarnda en ok kullanlan teknik ince tabaka

kromatogrifisidir. Bu maddelerin TK ile ayrlmasnda : Adsorban tabaka olarak

Silikagel-G ; developman sistemi olarak : toluen/dioksan/etanol/konsantre amonyak/etil asetat/metanol/konsantre amonyak tercih edilmektedir.

Kromotogramlar nce UV'de (254 nm de incelenir). Spot testlerde kullanlan renk reaktifleri ile identifikasyonlar yaplr. (Bu tekniklerle ilgili ayrntl bilgi iin iin kitabn TK ile ilgili blmne blmne baknz).
4. D O P N G MADDELER

Spor yarmalarnda, sportif performans arttrmak iin ila kullanm "doping" olarak tanmlanr. Doping yapma ise bir ila suistimalidir.

"Uluslararas Olimpiyat Komitesi (IOC) Medikal Komisyonu" tarafndan sporda kullanm yasaklanm ilalar (doping maddesi) listesini belirli aralarla gzden geirerek ilan eder. Sporcularn doping yapmalar, ilgili ulusal ve uluslararas ynetmeliklere gre bir sutur. Bu nedenle birok lkede doping analizi yapan, belirli standardlara gre kurulmu ve lisans alm (akredite olmu) "doping analiz labratuarlar" bulunmaktadr. lkemizde de byle bir labratuar kurulmas abas 1988 ylndan beri devam etmektedir. Doping maddelerinin analizinde duyarlk, spesifiklik ve doruluk asndan herhangi bir phe olmamaldr. Bu nedenle gerek laboratuvar 171

donanm ve gerekse analiz yapan kiiler asndan belirli kritere gre standardize edilmi olmaldr. Burada, doping maddeleri listesinde olan ve rutin almalarda da analitik toksikolojide nemli olan "aromatik amin yapsndaki uyarclarla", aabolik steroidlerden testosteronun idrardan izolasyonu, TK ile

identifkasyonu ve GLK ile tayin yntemleri aklanmtr (Vural, N., Sayg, .. 1983 ; Vural, N; Szen S; 1989). 4.1. Organik baz yapsndaki maddelerin TK ile analizleri Bu gruba giren maddelere amfetamin, metamfetamin, fetamin, metoksifenamin, fentermin, tranilsipromin, dimetilam-

p-hidroksiampetamin,

dietilpropion, efedrin, niketamid, foledin rnek verilebilir. Standart maddeler : Yukarda ad geen saf etken maddelerden metil alkolde I mg/l ml konsantrasyonda zeltiler hazrlanr. Kondensasyon maddesi : 7-klor-4-nitrobenzofurazin (NBD) etil asetat iinde (4 mg/ml) konsantrasyonda hazrlanr. Bu madde primer ve sekonder aminlerin tannmasnda kullanlr. Dier renk reaktifleri : Ninhidrin (0,5 mg/ml asetonda); slfirik asit (%0.5 su iinde); Dragendoorff r e a k t i f : (KI.B.I 3 ) ve potasyum permanganat (%1 suda) hazrlanr. TK Takm : Silikagel GF254 ile kaplanm plaklar kullanlr.

Developman (etil asetat/metil alkol/konsantre amonyak : 85/10/15) karm renk reaktifleri iin; (Siklohekzan/etilasetat/eter: 40/40/20) karm,

kondensasyon rn iin kullanlr. drar ekstraktlarnn hazrlanmas : 5 ml idrar rneine 2.5 N

NaOH damlatarak pH 12-12,5 'a ayarlanr. Kat NaCl ile doyurulduktan sonra 3 defa 5 ml eterle vortekste kartrlarak ekstrakte edilir. Birletirilen eter fazlar susuz N a 2 S 0 4 geirilerek sudan kurturulur. Eter faz zerine 1 ml 2 172

standart

olarak

30

p.g/p.1

konsantrasyonda

amfetamin ve

(dimetamfetamin ve tranilspronin

iin), dimetamfetamin (amfetamin

metamfetamin iin), niketamid (metoksifenamin iin), difenilamin (kardiazol iin) kullanlr. Efedrin iin d standart olarak norefedrin kullanlr. 1 ml standart zeltilerin pH si 2.5 N NaOH ile 12-12.5'a ayarlanr ve 300 pl kloroformla (i standart ieren) ekstrakte edilir. Kloroform fazndan 3 1^1 alnarak faz kromatografa enjekte edilir. Pik ykseklikleri oran (standart / i standart), konsantrasyona kar iaretlenerek kalibrasyon grafii izilir. Gaz kromatografsine uygulama Bu teknikte 2 farkl kolon kullanlr. Ayrca trevleme yaplarak da gaz komatografisi ile duyarlk arttrlr. 1) %3 SE-30 (Chromosorb WHP 80-100 misli) sabit faz zerinde; detektr : FID ; tayc gaz (azot) : 40 ml/dk ak hznda; frn scakl : 140-250C; delektr scakl : 200-275C, enteksiyon giri scakl: 200275C arasnda programlanr. 2) %10 Apiezon-2/% 10 KOH (Clromosorb W-AW, 80-100 misli zerinde) sabit faz ieren kolon; detektr: FID; tayc gaz azot 40ml/dak; frn scakl 160-200C ; detektr ve enjeksiyon giri scakl 200-220C arasnda ayarlanr. 3) N-Asetil trevlerinin oluturularak SE-30 sabit faznda uygulama : N-asetil trevi asetanhidrit kullanarak kolon zerinde trevleme ilemi yaplr. Bu amala 1 pl ila (idrar ekstrakt) zeltisi zerine 1 pl asetik anhidrit enjektre ekilerek karm birlikte kolona enjekte edilir. Koullar SE-30 da yukarda akland ekilde yrtlr. Yalnz frn scakl arasnda deitirilir. 160-210C

175

Sonu : Gaz kromatografisi ile iki farkl kolon kullanarak organik baz yapsndaki maddelerin (yukarda aklanan koullarda) ayrlmalar mmkn olmaktadr. Ayrca primer ve sekonder amin yapsnda olanlarn asetil

trevlerinin oluturularak GLK ile ayrlmalar ve tayinleri destekleyici deney zellii tamaktadr. Genel olarak gaz kromatografisi yntemi ile 0.5-0.1 pg duyarlkta kalitatif ve kantitatif analiz gerekleebilmektedir. Kromatogramlar ekil21 "de gsterilmitir. (Vural, N., Sayg, . 1983). cm

10 -

J
10 5 0 Dakika
10

J t

0
Dckka

ekil-21 Baz organik bazlarn gaz kromatogramlar : (a): amfetamin (I;0.3 pg): dimetamfetamin (II. 0.3 pg); (b): efedrin (I; 0.5 pg); nefedrin (2: 0.6 |ig) 4.2. Anabolik steroidler Anabolik steroidler iinde yer alan testosteron ve trevleri klinikte teraptik amalar dnda, sporda doping amac ile kullanlr. lalar arasnda
176

da yer almaktadr. Son yllarda sporcular arasnda daha ok suistimal edilen bu maddenin vucutta doal olarak sentezlendii ve bu nedenle de

suistimalinin anlalamayaca dncesi ile kullanm yaygnlamtr. 1976 ylndan beri IOC tarafndan yasaklanan testosteronun (T) doping amac suistimal edildiini gsterilmesinde metaboliti olan epitestosteroun (E) de tayin edilerek T/E orannn saptanmas gerekmektedir. Bu orann 6/1 den byk olmas halinde testosteronun doping amac ile kullanld kabul edilmektedir (Domike, M., 1986). Testosteron ve epitestosteronun idrarda asit hidrolizden sonra TK ile saflatrlmas ve GLK de trevleme yntemi ile tayin edilmesi ve yntemin doping analizi ama ile kullanlabilecei (laboratuvarmzda uyguladmz yntem) aada aklanmtr. (Vural, N., Szen,S, 1989)

Testosteron,

epitestosteron

ve

dier

sentetik

anabolik

steroidlerin T K ile i d e n t i f i k a s y o n l a r Anabolik steroidlerin (testosteron, nandrolon, nandrolon

fenilpropiyonat, oksimetolon, metiItestosteron gibi) birbirlerinden ayrlmalar TK ile standartlarla karlatrlarak yaplabilir. Standartlar 1 (J.g/ml konsantrasyonunda kloroform iinde hazrlanr. Adsorban olarak silikagel G kullanlr. Cam levhalar 0.25 mm

kalnlnda kaplanarak, oda scaklnda kurutulur, 110C'de etvde 1 saat aktive edilir. Developman iin deiik sistemler kullanlabilir: kloroform-etil asetat (80:20); metilen klorr-aseton (80:20); kloroform-buzlu asetik asit (90:10) rnek verilebilir.

177

Renk reaktifleri : 1. Vanilin-slfrik asit reaktifi : 3g vanillin 100 ml absol etanol ile zlr ve 0.5 ml, konsantre sfrik asit ilave edilerek kartrlr. 2. Asetik asit anhidr - slfrik asit reaktifi : 5 ml anhidr asetik asit, 5 ml konsantre slfrik asit ile dikkatlice kartrlr. Karm soutularak, 50 ml alkole yavaa katlr.

Steroidlerin idrardan izolasyonlar: 5 ml idrar rnei, 5ml eter ile 2 kez ekstrakte edilir. Ekstraktlar birletirilerek, sodyum slfat ile suyundan kurtarlr. Oda scaklnda azot gaz altnda uurulur. Kalnt metanolde zlerek TK'ya uygulanr. Standard zeltilerden ise 10 pl TK'ya uygulanr. Uygulama : Plaklar 12 cm ye kadar develope edildikten sonra, plaklara renk reaktifleri pskrtlr : a) Vanilin-slfirik asit reaktifi pskrtldkten sonra, plaklar

120C'de lekeler grnene kadar bekletilir. Grlen lekelerin yeri iaretlenir, oluan renk kaydedilir. Rf deerleri hesaplanr. b) Asetik anhidrik- slfirik asit reaktifi ise pskrtmeden nce

plaklara 110 C'de 10 dakika bekletilir ve UV altnda renkleri kaydedilir. Testesteron vanilin H 2 S 0 4 ile krmz renk; asetik asit anhidrit-PLSOj ile grnen kta gri-kahverengi, UV de parlak sar renk verir. Tablo 15 eitli anabolik steroidlerin renk reaktifleri) TK'da verdikleri renkler ve Rf deerleri grlmektedir (Fazla bilgi iin Szen, S. Y. Lisans Tezi, 1988'e baknz).

178

T a b l o 15- eitli steroid yapsndaki ilalarn TK verileri R e n k reaktifleri

Vanilin H2SO
4

Rf v e d e v e l o p m a n sistemi

la Ald

Gn

1
Parlak sar

II

111

IV

VI

Testosteron

Krmzkahverengi Koyu krmz Gri - krmz Mavi kahverengi

Grikahverengi Krmzkahverengi Pembe

0.27

0.53

0.61

0.58

0.61

0.37

Meteelon enentat

Parlak

0.61

0.80

0.95

0.87

0.85

0.82

Oksimetolon

Parlak

0.31

0.49

0.82

0.73

0.62

0.67

Nandrolon

Kahverengi

Parlak

0.23

0.51

0.60

0.53

0.59

0.36

Nandrolon l'eilpropiyonat Nandrolon pheksilnksifeilpropivonat 4-hidroksi-19nortestosteron siklopentilpropiyonat

Gri - mavi

Sar kahverengi Sar kahverengi Sar kahverengi

Parlak

0.65

0.79

0.93

0.75

0.85

0.73

Krmz siyah Krmz kahverengi

Parlak

0.70

0.84

0.95

0.83

0.88

0.86

Parlak

0.75

0.85

0.96

0.86

0.85

0.91

I : Kloroform - etil asetet (80:20); II kloroform - aseton (80:20)

IV : Kloroform siklohekzan glasiyal asetik asit (70:20:10) V : Metilen klorr - aseton (80:20) IV : Metilen klorr - glasiyal asetik asit (90:10)

: Kloroform - glasiyal asetik Asit (80:10)

Testosteron ve epitestosteronun GLK ile tayini (Enzimle Hidroliz Yntemi) drarda testosteron ve epitestoronun konjugatlar asit hidroliz yerine (3- glukuronidaz ile " enzim hidroliz" yntemi kullanlabilir. 100 ml idrarn pH s 5'e ayarlandktan sonra (3-glukuronidaz (130000 nite) ilave edilir. 55C de 2.5 saat inkbe edilir.

179

10

Dakika

10

Dakika

a b ekil 20- Standart (a) ve idrardan izole edilen (b) metil testosteron (1), Epitestosteron (2), testosteronun (3) kromatogramlar Souduktan sonra 3 kez eterle ekstrakte edilir. Biletirilen eter

ekstraktlar % 20 NaOH, ardndan su ile ykanarak susuz sodyum slfattan geirilerek suyundan kurtarlr. Eter faz uurulduktan sonra, asit hidrolizde olduu gibi, kalntya 50 (.g/ml netil testosterom (i satandart) ilave edilerek 5 pl gaz kromatografa enjekte edilir. GLK de sabit faz olarak %3 SE-30 (Chromosorb WHP 80-100 misli zerinde) ve FD detektr kullanlr. Frn scakl 260 C; enjeksiyon giri scakl 280 C; detektr scakl 300 C; tayc gaz (azot) ak hz 30 nl/dk. Hidrojen ak hz 50 ml/dak; hava ak hz 300 ml/dak. Olarak ayarlanr.
180

Kromatogramlarm pik ykseklikleri llerek, kalibrasyon grafiinden hesaplanr. ekil 20 (a ve b) de testosteron ve epitestostoronn

kronatogramlar (standart ve idrardan izole edilen) grlmektedir. Kalibrasyon : Stok testosteron asetat ve epitestosteron asetat (1 mg/ml), standart zeltilerinden arasnda 5 seri zelti hazrlanr. standart olarak metiltestortem 50 fag/ml olmak zere standartlar ilave edilir. Hazrlanan seri zeltilerden 5 jul gaz kromotografa enjekte edilerek yukardaki koullarda allr. Standart / i standart pik yksekliine kar konsantrasyon alnarak kalbirasyon grafii izilir. Sonu Testosteron ve epitestosteronun, idrarda asit hidroliz yntemi -TK kombinasyonunu takiben GLK ile tayini, ynteminde enzimatik ynteme gre daha yksek verim elde edilir, ayrca yntem enzim hidroliz yntemine gre daha ekonomiktir. Ancak ekstraksiyonun benzenle yaplmas, yntemin salk asndan saknca oluturmaktadr. Duyarlk 0.2 |!g dir. Metilleme ile duyarlk snr 0.05 |ig kadar inileilir (Szen, S., 1988) Yaptmz bir aratrmada, normal kadnlarda idrarda testosteron (T) 0.51 0.19 |ag/ml; epitestosteron (E) 0.19 0.07 |ag/ml ve T/E oran 2.62 0.32 bulunmutur. Normal erkeklerde ise T, E ve T/E iin sras ile 2.40 0.59 ng/ml; 1.33 + 0.67 fig/'ml ve 1.96 0.62 deerleri elde edilmitir. Testosteron trevi ila (sustanon 250) kullanan hastalarda ise T 5.94 87 (i/mU, E 1.25 48 p-g/ml ve T/E oran ise4.88 78 bulunmutur. la kloroformla seyreltilerek 10-100 (ig/ml

kullanm ile T/E oran artmaktadr. Bu oran 6 ve stnde olduunda ise sporcu dopingli kabul edilmektedir. (Donike, M. 1936; Vural, N., Szen, S., 1989)
181

5.

PESTSTLER

Besin maddelerinin retimi, tketimi ve depolanmalar srasnda, besin deerini bozan, besinleri yok eden ve zarar veren haereleri,

mikroorganizmalar yok etmek iin kullanlan fiziksel, kimyasal ve biyolojik sava maddelerine "pestisitler" denir. Pestisitlerle, mesleki maruziyet dnda, eitli nedenlerle kronik, akut ve lmle sonulanan zehirlenme olaylarna lkemizde sklkla

rastanmaktadr (Vural, N., 1996). Pestisitlerin analitik ve adli toksikoloji asndan analizleri nem tar. Burada evrede kalclklar nedeni ile kronik toksisite asndan da nem tayan klorlu hidrokarbon yapsndaki pestisitlerle, akut toksisite asndan nem tayan organik fosforlu insektisitlerin rutin toksikolojik analizleri aklanmtr. 5.1. Organik klorlu pestisitler Klorlulidrokarbon yapsndaki (organoklorlu) pestisitler yaplarnda klor bulunan aromatik veya alifatik bileiklerdir. lk sentezi yaplan klorlu hidrokarbon yapsnda olan DDT ve klorlu siklodien yapsndaki dieldrin, aldrin gibi insektisitlerin evrede kalc ve kasinojenik etkili olmalar nedeni ile kullanmlar kstlanm ve daha

sonralar da yasaklanmtr. Ancak kalclklar nedeni ile halen canllarn adipoz dokusunda ve insanlarda anne stnde bulunduklar gsterilmitir (Fazla bilgi iin Vural,N., 1996'ya baknz). Aldrin, dieldrin ve endrin (akut letal dozlar yetikinlerde 5 g), DDT (letal doz 30 g) ye gre daha ok toksiktirler. zc ile numuneden ekstrakte edildikten sonra TK ile kalitatif analizleri yaplabilen bu maddeler iin basit ve gvenilir yntemler yoktur.

182

Ancak GLK ve GK-MS kombinasyonlar ile kendilerinin ve metabolitlerinin kesin analizleri yaplabilir. TK ile kalitatif analizleri Bu yntem aldrin, dieldrin, heptaklor ve dokofan iin kullanlr. Numune olarak mide muhtevas ve olay yerinden elde edilen kalntlara uygulanabilir. Teknik : 10 ml numune, 5 ml petrol eteri (kaynama noktas 40-60C fraksiyonu) ile 5 dakika kartrlarak ekstrakte edilir. Fazlarn ayrlmas iin 5 dakika bekletilir ve st faz ayrlr.

Ekstraksiyon 2. kez 5 ml petrol eteri ile tekrarlanr. Ayrlan petrol eteri fazlar birletirilir ve sras ile 5 ml saf su; 5 ml sodyum hidroksit (20 g/l) ve 5 ml saf su ile ykanr. Ykanm ekstrakt, 5 g sodyum slfat zerinde kurutulur ve basnl hava veya azot akmnda kurulua kadar uurulur. TK'ya uygulama : Ekstrakt 100 pl metil alkol iinde zlr. Silikagel G ile kaplanm kromatografi plann (5x20 cm boyutunda ve 20 pm partikl byklnde) ilk kolonuna 20 pl tatbik edilir. Standard madde karmndan (metil alkol iinde hepsini 1 g/l konsantrasyonda ieren karm) 20 pl 2. kolona uygulanr. Kromatogram, siklohekzanla doyurulmu tankta develope (10 cm, ykselinceye kadar) edilir ve kurulua kadar uurulur. Kromatogramlarn belirtilmesi iin potasyum permanganat zeltisi (0.1 mol/l) pskrtlr, arkadan yavaa 2-amino- etanol (etanolamin)

pskrtlr. 100C de etvde 20 dakika bekletilir.

183

Soutma iin bekletildikten sonra, nitrik asit ile seyreltilmi

gm

nitrat zeltisi [0.1 mol/1 gmnitrat zeltisi, konsantre nitrik asit ile (10:1) orannda seyreltilir] pskrtlr ve 15 dakika UV (254 nm) altnda bekletilir. Sonu : Klorlu hidrokarbonlar kahverengi/siyah lekeler verir. dentifikasyon standart kromatogram ile karlatrlarak yaplr. Dieldrin ve endrin bu koullarda detekte edilemezler. Bu teknikle yaklak hRf Rf deerleri : lindan 0.9; dikofan 26;

heptaklor 34 ve aldrin 41 elde edilir. (Flanagan R.J. ve ark. 1995) Yntemin duyarl organik klorlu pestisitin yapsna bal olarak 2.5 mg/l ile 10 mg/l arasnda deiir. Klinik deerlendirme Organioklorlu pestisitler, balca MSS'ni etkilerler. Akut zehirlenmede kusma, ekstremitelerde zayflk ve uyuukluk, uyarlma, diyare, muskler tremor ve konvlziyonlar, solunum depresyonu grlr. Zehirlemenin

tedav isinde, semptomatik ve destekleyici tedavi uygulanr. 5.2. Organik fosforlu pestisitler Organik fosforlu pestisitler, geni bir grubu oluturmaktadrlar. ou insektisit olarak kullanlr. Bazlar herbisit olarak da kullanlr ve insanlarda toksiteleri olduka dktr. Organik fosforlu insektisitler, genelde scak kanllara ve insanlara toksiktirler ve eitli nedenlerle sklkla akut zehirlenmelere ve lme neden olmaktadrlar. dayanr. Balca toksik belirtileri etkileri asetilkolin esteraz ve inhibisyonuna merkezi sinir

Zehirlenme

muskarinik,

nikotinik

sisteminin ar stimlasyonu eklindedir. Organik fosforlu insektisitlerin batc (sarmsak) kokular, diagnozda yararl olabilir. nemli bir ksm (azinfos metil, diazinon ve malation gibi)

184

bazik ortamda hidroliz olurlar, asit ortamda da dayankl deillerdir. Bu nedenle analiz srasnda mide muhtevas ve olay yerinden elde edilen rneklerin pH sim analizden nce 7 ye ayarlamak gerekir. Organik fosforlu idetisitleri ok geni bir grup olup, temel yaplar ve baz rnekler aada verilmitir.

oPs

\ O

Po

Fosforoditioat

Fosforotioat -po I \ R Fosfat

oP-

I
Fosforotiolat

x \

Zehirlenmenin toksikolojik adan tansnda : 1) Vcut svlarnda (kan, idrar ve lm halinde vcut dokularnda) organik fosforlu insektisitler ve metabolitleri aranr. rnein zehirlenmede, netaboliti p-nitrofenol analizi de yaplr. 2) Baz dimetil ve dietil organik fosfor yapsnda olan organik fosforlu insektisitlere maruz kalmann aratrlmasnda alkil fosfat metabolitlerinin tayini yaplabilir. rnein: Fosfamidon, diklorvos, dimetilfosfat ve paration ile dietilfosfat: parationla

disulfotan ve forat ile dietiltiyofosfat metabolitleri oluur. Dialkilfosfat metabolitleri dk maruziyetlerde de iyi bir indikatrdr. Ancak dialkil fosfatlar idrarda dk konsantrasyonda olduklar iin gerek izolasyon ve gerekse identifkasyon ve analizleri dikkat ister (Besbelli, N., 1993).

185

3) Organik fosforlu insektisitler kolinesteraz inhibitrdrler.

Bu

nedenle zehirlenmelerde, destekleyici deney olarak plazma asetilkolinesteraz aktivitesi (AChE) tayin edilir. Aktivitedeki dme oran, zehirlenme iddeti hakknda bilgi verir. Organik analizleri i) Yntem mide muhtevas ve olay yerinden elde edilen kalntlara uygulanabilir. Yntemin prensibi, organik fosfat esterlerinin 4-(p-nitrobenzil) piridin (asetonda 20 g/l) ve aseton: tetra etilenpentamin (9:1) kombine reaktifleri ile mor lekeler vermesine dayanr. Standart olarak eitli organik fosfat esterleri (metadon, methidation, dioksation ve klorprifos gibi) metil alkolde (1 g/1) konsantrasyonda karm halinde hazrlanr. Teknik : 10 ml rnek alnr ve gerekiyorsa pH, kat sodyum fosforlu insektisitlerin TK ile kalitatif (nitel)

bikarbonatla 7 ye ayarlanr. 5 ml metil tersiyer-btileter ile 5 dakika kartrc kullanarak ekstrakte edilir. Fazlarn ayrlmas iin 5 dakika bekletilir. st faz ayrlr ve ikinci kez 5 ml metil tersiyer btileterle ekstraksiyon tekrarlanr. Ekstraktlar birletirilir, faz ayran filtre kadndan temiz bir tpe szlr. Basnl hava veya azot akmnda kurulua kadar uurulur. TK'ya Uygulama : Ekstrakta 100)0.1 metil alkol ilave edilir ve 20jl silikagel G ile (5x20 cm boyutunda, 20 fim ortalama tanecik byklnde) kaplanm uygulanr. Kromatogram (siklohekzan/aseton/kloroform: 70/25/5) karmnda 10 cm. ykseklie kadar develope edilir. Tanktan kartldktan sonra kurutulur. levhaya uygulanr. kinci kolona da 10|il standart karm

186

Tabakaya 4-(p-nitrobenzil) piridin zeltisi (asetonda, 20 g/l orannda) pskrtlr ve 110C da 30 dakika bekletilir. Soutulduktan sonra aseton /tetraetilenpentamin (9/1 orannda) karm pskrtlr. Sonu : Organik fosforlu insektisitler ak kahverengi zemin zerinde mor lekeler verir. Lekeler standartlarla karlatrlr ve Rf deerleri

hesaplanr. (rnein, TK' da bu yntemle dimetoat ile : 0.11 ; malation ile : 0.42 ; bromofos ile : 0.54 ; klorprifos ile : 0.58 Rf deerleri elde edilir. ii) TK ile kalitatif analizde dier bir renk reaktif olarak (gm nitrat bromfenol) karm kullanlabilir: Olanaklar asndan daha pratik olan bu yntem aada aklanmtr. Yntem mide ierii veya olay yerinden elde edilen numunelere

uygulanabildii gibi insektisit formlasyonlarada uygulanabilir. Renk reaktifi : a) %1 A g N 0 3 (3:1 orannda su/aseton karmnda); b) %0.5 bromofenol zeltisi (asetonda) kullanlrken 100 ml (a) zeltisi, 10 ml (b) zeltisi ile kartrlr. Devolopman zeltisi : (Benzen/aseton) : (80/20) orannda Adsorban : A1 2 0 3 (20x20 cm levha zerinde) Standardlar : Daha nce akland ekilde hazrlanr. Uygulama : Mide ierii veya olay yeri kalntsndan izolasyon daha nceki TK tekniinde olduu gibi yaplr. nsektisit formlasyonunda

izolasyon ilemi ise aada aklanmtr. Formlasyonlardan organik fosforlarn izolasyonu : Emlsiyon veya toz halindeki numuneden 200 mg alnr. 10 ml asetonla sk sk alkalanarak oda scaklnda ekstrakte edilir (Cam kapakl bir erlen veya daha iyisi bir mezr iinde). artlar uygunsa bir gece bekletmek yerindedir. cabnda szlerek belirli bir hacme (10 ml ye) tamamlanr.

187

Numunenin TK'ya tatbiki : nceden hazrlanm 0.04 ml numune (kantitatif tayinde miktar nemli) aplar 5 mm yi gemeyecek ekilde damlatlr. Oda ssnda kurutulur. Adsorban tabaka, daha nceden developman sistemini ieren ve zc atmosferi ile doymu tanka yerletirilerek genellikle zc ykseklii

balangtan 10-12 cm ykselinceye kadar bekletilir. Developman zaman ve oda scakl kaydedilir. Tanktan karlan adsorban tabaka, oda scaklnda kurutulur. Kromatogramlarn belirli hale getirilmesi : Reaktif karm adsorban tabakaya pskrtlr ve levha 50-60C de 10 dakika kurutulur. Mavi zemin zerine, tiyoorganik fosforlu insektisitler, viyole renk tonlar verir. Bu rengin belirgin hale gelmesi iin, %1 lik sitrik asit pskrtlerek veya levha brom buharna tutularak mavi olan zemin rengi giderilir. ok hafif renkli olan lekeler ise 5-10 dakika U.V. de bekletildiinde belirgin hale gelirler. Kromatogramlarn Rf deerleri saptanarak standartlarla karlatrlr. Bylece organik fosforlu insektisitlerin indentifkasyonu yaplr. Genel olarak organik fosforlu insektisitler (bromfenol mavisi+gm nitrat ile) mavi (rogor); viyole (gusathion); mavi viyole (paration ve diazinon) renkleri verirler. Asetilkolin esteraz aktivitesinin tayini Organik fosfat ester ve karbamade yapsndaki insektisitler asetilkolin esteraz enzimini inhbe ederek serinin iletimini bozarlar. Kolin esteraz balang olarak karacierde oluur, ancak plazmada da bulunur. Plasma kolinesteraz inhibisyonunun fizyolojik olarak nemli

dnlmez. Kolinesteraz ve asetilkolin esteraz farkl enzimlerdir. Plazma kolinesteraz asetilkolin hemen esterazn hemen halen tamamen %50 inhibe olabilirken, eritrositlerdeki Bu durum

si aktivitesini

koruyabilir.

188

maddelerin baldr.

relatif

inhibisyonuna,

giri yollarna,

maruziyet

derecesine

Pratikte

plazma

kolinesteraz aktivitesinin

tayini

organik fosforlu

insektisitler veya karbamatlara maruziyetinin belirlenmesi iin uygun bir indikatrdr. Aktivitenin normal olmas, bu maddelere maruziyetin

olmadn gsterir. Aktivitenin dk bulunmas halinde, toksik madde ve /veya metabolitinin biyolojik svlarda bulunmas ile zehirlenme olay ve nedeni desteklenmi olur. Hem eritrosit ve hem de plazma ChE dzeyinin dk olmas, organik fosfat veya karbamat grubu pestisitlerle zehirlenme olasln glendirir. Kolinesteraz aktivitesinin tayininde kullanlan 1) yar kantitatif basit bir yntem 2) daha duyarl olan dier bir yntem aada aklanmtr. 1) Asetil kolinesteraz inhibisyonunun yar kantitatif

deerlendirmesi Yntemin prensibi, substrat olarak kullanlan asetiltiyokolinin, AChE tarafndan asetil ve tiyokoline hidroliz olmas; oluan tiyokolinin 5,5'-

ditiyobis (2-nitrobenzoik asit) ile sar renkli kompleks vermesine dayanr. Oluan sar rengin iddeti pralidoksim (organik fosfat esterlerinin

inhibisyonunda reaktivatr ieren numune ile karlatrlarak yorumlanr. Yntem serum veya plazmaya uygulanr. Reaktifler : Dithiobisbenzoat reaktifi : 5,5'-nitrobenzoik asit (DTNB), 0,2 g/l konsantrasyonunda sodyum dihidrojen ortofosfat tamponu (0.1 ml, pH 7.4) iinde hazrlanr. Asetiltiyokolin iyodr zeltisi: Suda 5 g/l konsantrasyonda hazrlanr. Pralidoksim klorr zeltisi: Suda 200 g/l konsantrasyonda hazrlanr.

189

Kr (veya kontrol) olarak kullanlacak plazma veya serum maruz kalmam kiilerden salanr. U y g u l a m a d a : 3 t a n e 10 ml lik tplerin herbirine 2.0 m l D T N B reaktifi ve 1.0 ml asetiltiyokolin iyodr zeltisi konur. Birinci t p e 2 0 [il kontrol p l a z m a , ikinci t p e ise 2 0 jo.1 n u m u n e p l a z m a k o n u r . n c t p e ise 2 0 p.1 p r a l i d o k s i m zeltisi ve 2 0 p l n u m u n e p l a z m a ilave edilir. Her t p te v o r t e k s l e kartrlr ve o d a scaklnda 2 dakika

bekletilir. Sonu : a) Kontrol tpte oluan sar renk, test tpne gre (2. Tp) daha koyu ise, asetilkolin esteraz inhibitr bu maddenin varln gsterir. laveten pralidoksim ieren tpteki karmn (3.tp) rengi, kontrol tp ile ayn ise, o zaman organik fosfat esteri ile ilgili bir AChE inhibitr vardr. Bunun dier deneylerle desteklenmesi gerekir. (Organik fosfat esteri pestisit grubu veya metabolit analizi ile). 2) AChE aktivitesi tayini Yukarda AChE'n nitel analizi iin uygulanan yntem kantitatif amala da kullanlabilir. lk kez Ellman tarafndan uygulanmtr. (Ellman,G., 1959; WHO, 1987) Reaktifler : DTNB tampon zeltisi : 100 mg DTNB; 4.472 g disodyum hidrojen fosfat (Na 2 HP0 4 ) ve 250 g potasyum dihidrojen fosfat (KH 2 P0 4 ), 800 ml distile suda zlr. 4.5 g sodyum klorr ilave edilir ve distile su ile 1 litreye tamamlanr, pH kontrol edilip, 7.6'ya ayarlanr. (Seyreltik HCI veya NaOH ile). Bu zelti buzdolabnda en fazla 1 hafta dayanr.

190

Substrat olarak propiyoniltiyokolin kullanlr: 150 mg madde 80 ml su iinde zlr, distile su ile 100 ml ye tamamlanr. Bu zelti gnlk hazrlanr. AChE inhibitr olarak eserin salisilat (fzostigmin salisilat) kullanlr. 50 mg madde 40 ml suda zlr, distile su ile 100 ml ye tamamlanr. zelti baz dolabnda en fazla 2 hafta dayanr. Teknik : Yntem tam kan, eritrosit veya plazmaya uygulanabilir. Kan rnekleri heparinize tplere alnr. Yntem postmortem kana da uygulanabilir. Heparinli kan rnekleri +4C de saklanr. Uygulamada 20 pl kana 20 ml DTNB tampon zeltisi ilave edilir. Seyreltilmi kan rneinden tpe 4'er ml konur. (1. Tp kr kan deneyi iin: 2. Tp kan numunesi, geriye kalan seyreltilmi kan, 3. Tp 3000 rpm de 5 dakika santifij edilir. Spernatanttan, 4'er ml 2 ayr tpe konur. (3. Tp plazma kr; 4. Tp plazma numunesi). Kr deney olarak ayrlan (1. ve 3. tplere) kan ve plazmaya 50 pl eserin salisilat zeltisi (ChE inhibitr) ilave edilerek, vortekste kartrlr. Btn tpler (kr ve numune ieren tpler), 5 dakika 30C de su banyosunda inkbasyon iin bekletilir. Hepsine substrat olarak 1 ml

propiyonil tiyokolin ilave edilir. Tekrar 30C de 10 dakika inkbasyon iin bekletilir. nkbasyondan sonra, numune plazma ve kan ieren tpler 50 pl eserin salisilat zeltisi ilave edilir. 1 ve 2 nolu tpler (kanlar) 3000 rpm de 5 dakika santiftij edilir. Oluan sar renkli zeltilerin absorbanslar (her 4 tpteki zeltiler), distile suya kar, 405 nm de okunur.

191

Kalibrasyon Sistein hidroklorr standart olarak kullanlr. 63.05 mg sistein

hidroklorr 900 ml distile suda zlr. Distile su ile 1000 ml ye tamamlanr (0.4 m mol 1). zelti kullanlaca zaman hazrlanmaldr. Kalibrasyon erisinin izilmesi iin 0; 0.20; 0.40; 0.60; 0.80 ve 1.0 ml sistein standart zeltilerine, 4 ml DTNB tampon zeltisi ile siyreltilir. Distile su ile 5 ml ye tamamlanr. Oluan renklerin absorbans, (1 ml distile suya 4 ml DTNB zeltisinin ilavesi) ile hazrlanan kre kar 405 nm de okunur. Absorbansa kar, sistein konsantrasyonu iaretlenerek doru izilir. Hesaplama kullanlr. A (T-B) ChE (aktivitesi) = A (S) x t x SV C (S) x T.V IU/ml : Kolinesteraz aktivitesi tayini iin aadaki forml

A (T-B) : Tam kan veya plazmann absorbansndan tam kan (kr) veya plazma (kr)n absorbansnn kartlmas ile elde edilen absorbans (A n - A k ) A ( S ) : En yksek konsantrasyondaki standart zeltinin (genellikle 0.40 p mol/ml sistein) absorbans (A s ) C(S) : Standart zeltinin en kk konsantrasyonu (genellikle 0.08 p mol/ml sistein) T.V. : Toplam hacim (5 ml) S.V. : rnek hacmi (absorbans okunan 20 pl : 5 = 0.004 ml) t : Reaksiyon zaman (10 dakika) IU/ml : Uluslararas nite birimi p mol substrat/dakika Teknik ksmda anlatlan koullarda alldnda deerler yerine konulursa;

192

A (T-B) ChE aktivitesi = A (S) An -A k ChE(lU/ml)= As x

0.08 x 5 = 10x0.004

A (T-B) x 10 IU/ml A (S)

x 10 eklinde formle edilebilir.

Eritrosit kolinesteraz aktivitesi : (Tm kan kolinesteraz aktivitesiplazma kolinesteraz aktivitesi) eitii ile hesaplanr. Sonucun yorumu Organik fosforlu insektiflere maruz kalmam (normal) kiilerin

kolinesteraz deerleri: Tam kan : 4.5-7.0 IU/ml; Plazma : 1.5-3.5 IU/ml;

Eritrosit: 2.6-4.1 IU/ml arasndadr. Organik fosfat esterlerin maruziyette AChE inhibisyon % si daha uygun bir kriterdir. Bu amala kiilerde maruziyet ncesi ve sonras AChE aktivitesi llr. AChE dzeyindeki dme % si (inhibisyon %) : Maruziyet ncesi AChE - maruziyet sonras AChE x 100 Maruziyet ncesi AChE Kolinesteraz dzeyinin % 50-60 inhibisyonu forml ile hesaplanabilir. hafif ; % 60-90

inhibisyonu orta, % 90-100 inhibisyonu ise iddetli zehirlenme olarak kabul edilmektedir (Maroni, M., 1986). lm olaylarnda, postmortem kanda kolinesteraz aktivitesi tayini, lm nedeni hakknda bir bilgi verebilir. Yaptmz bir aratrmada, eitli nedenlerle len kiilerin

(postmortem) kanlarnda AChE aktivitesi tayin edilmitir. Bu bulgulara gre solunum yetmezliinden kalp hastalndan, CO zehirlenmelerinden len kiilerde AChE aktivitesi dk bulunmutur. Ancak en fazla dme organik fosforlu insektisitlerle zehirlenmede gvrlmtr (Kaifolu, N., 1995).
193

6. M E T A L K

ZEHRLER

Metallerle zehirlenmelere ok eski yllardan beri rastlanmaktadr. Bu nedenle biyolojik materyalde metalik zehirlerin analizi ile ilgili yntemlerde paralel olarak gelimitir. Arsenik zehirlenmesinin Orfila tarafndan biyolojik materyalde (sata) Marsch deneyi ile aranmas adli ve analitik toksikolojinin balangc olmutur. Zamanmzda metal zehirlenmeleri, akut ve kazaen zehirlenmelerden ok mesleki ve evresel maruziyet nedeni ile nem kazanmtr (Kurun, kadmiyum, civa, krom, nikel gibi). Gelitirilen yeni tekniklerle (atomik emisyon ve absorbsiyon spektrofotometresi : AES ve AAS ; anodik strippig voltametresi : ASV, polarograf, ntron aktivasyon: NAA) eser miktarda metallerin evrede ve biyolojik materyalde duyarl ve spesifik analizleri mmkn olmaktadr. Akut zehirlenme, mesleki maruziyet, iatrogenik zehirlenmelerin

aratrmalarnda atomik absorbsiyon spektrofotometresi (AAS) ve ndktif Coupled Plasma Spektrofotometresi (ECP) en ok tercih edilen yntemlerdir. nk her iki teknikle de hemen btn elementlerin analizi yksek duyarlkla olarak yaplabilmektedir. Ayrca ayn rnekle multielementlerin kantitatif analizi hzl olarak yaplabilmektedir. ICP pahal bir tekniktir. Bu nedenle toksikolojik analizlerde yeterli duyarlkta, iyi sonu veren bir teknik olan AAS rutin olarak kullanlan bir yntemdir (Fazla bilgi iin: Borriella, R., ve Gagliono Candela, R.,1987). Bu blmde Reinsch deneyi, endstri ve evre asndan nemli olan kurunun toksikolojik analizi aklanacaktr.

194

6.1. Reinsch deneyi Bakrdan daha soy elementlerin biyolojik materyalde aranmalar iin kullanlan bu test ve destekleyici deneyler kitabn genel blmnde

aklanmtr. Baz metallerin (As, sb, Hg, B, Se ve Te) biyolojik materyalde dorudan aranmalarnda uygulanan Reinsch testi klasik bir yntem olup, rutin toksikoloji labratuvarlarda halen kullanlmas gereken bir deneydir. 6.2. Kurun Kurun ar bir metal olup, anorganik ve organik bileikleri vardr. Kurun ve anorganik kurun bileikleri (kurun nitrat, kurun karbonat, gibi) boya akmlatr, seramik, porselen, insektisit, vulkanize kauuk, lehim, alam yapm ve endstirisinde kullanlr. Organik kurun bileiklerinden tetra etil kurun (TEK) ve tetrametil kurun (TMK) benzine geri tepmeyi nlemek iin ilave edilir. Alkil kurun bileiklerini (TEK, TMK gibi) toksisitesi ve evre kirlilii nedeni ile kullanmlar yasaklanm veya snrlanm olmasna karn halen bir ok lkelerde nemini korumaktadr (Fazla bilgi iin Vural, N : 1996 ve Duydu, Y: Vural, N. 1997'ye bakn). Kurunun mesleksel ve evresel izlenmesinde kandakurun, idrarda kurun, idrarla porfirin atlm ve delta aminolevlinik asit (d-ALA) tayinleri yaplr. Labratuvarmzda bu amala kullanlm yntemler aada

aklanmtr. Kanda ve idrarda AAS ile kurun tayini Biyolojik materyalde AAS ile kurun tayininde deiik yntemler uygulanabilir. Dorudan alevli AAS, alevli yntemde duyarl arttrmak iin yarkl kuvars tp uygulamas veya grafit frn (alevsiz yntem) yntemi kullanlabilir (Vural. N., Gvendik, G., 1983; Duydu, Y; Vural, N., 1998; Tiimtrk, N., 1998).
195

1) Alevli AAS yntemi ile kanda kurun tayini Kanda kurun tayini iin, kan rnekleri kurun iermeyen heparinize tplere alnr. Yntemin prensibi, kurun sodyum pirolidin ditiyokarbamatla

komplekse alnr ve oluan kompleks su ile doyurulmu metilisobtilketonla (MIBK), pH: 2-4 aralnda ekstrakte edilir. Organik fazn 217 nm de absorbans MIBK (kr) e kar okunur. Kalibrasyon grafiginden

konsantrasyon hesaplanr. Reaktifler : 1. Triton X -100 (Alkil fenoksi politoksi etanol) : 5 ml Triton X-100, noniyonize su ile 100 ml ye tamamlanr. 2. Amonyum (veya sodyum) pirolidin ditiyokarbamat (SDDC): 2 g madde diyonize su ile 100 ml ye tamamlanr. 3. Metiliobtilketon (MIBK) : su ile doyurularak kullanlr. 4. Asetik asit ( l . N ) Teknik : 5 ml heparinize kan rneine 1 ml Triton-X-100 ilave ederek hemoliz edilir. Hemolizi hzlandrmak iin vorteksle kartrlr ve 10 dakika bekletilir. 1 ml amonyum pirolidin ditiyokarbamat zeltisi, 0.25 ml 1 N asetik asit ilave edilir. Her zelti ilavesinden sonra vorteksle kartrlr. 5 ml suda doyurulmu MIBK ilave edilerek, kartrlr, 5 dakika 2000 devir/dak satirifj edilir. stte ayrlan organik fazn absorbans 217 nm de atomik absorbsiyon spektrofotometresinde okunur. Kalibrasyon erisinden

hesaplanr. (Daha ilerde aklanmtr). 2) Atomik tp uygulamas Alevli atomik abrosbsiyon spektrofotometresinde (FAAS) yarkl absorbsiyon Spektrofotometresinde yarkl kuvars

kuvars tp - atom yakalama teknii uygulanarak aletin duyarl arttrlr. Bu

196

amala kullanlan yarki kuarz tp (Slotted Tube Atom Trap; STAT) uygun bir dzenekle alevin zerine yerletirilir ve alevin yarki kuars tpn yarklar arasnda gemesi salanr. Kuars tpn k yolunu ve dikey ayarlar yaplr. Yarki kuars tpn kaplanmas : Bu amala % l'lik lantanyum yarki kuars tp zerine FAAS alr durumdayken kapatmamas iin yatay

klorr zeltisi

pskrtlr. Bu ekilde 20 dakika tpn alt ksm, 10 dakikada tpn st ksm kaplanr. Bu kaplama sayesinde tp sya daha dayankl hale getirilmi olur. Cihazn sfr ayar suda doyurulmu MBK ile yaplr. Okunan

absorbans, gnlk hazrlanan kalibrasyon erisinden deerlendirilir. Kullanlan atomik absorbsiyon spektrofotometresinin koullar : Lamba akm : 5 mA; dalga boyu 217 nm; yark (slit) genilii : 1 nm; yakut asetilenhava karm. Kalibrasyon : Stok kurun zeltisinin seyreltilmesi ile standart

karm seri zeltileri hazrlanr. Stok kurun zeltisi 0.159 g Pb (N0 3 ) 2 , deiyonize su ile %1 orannda (hacim/hacim) seyreltilmi slfirik asitde zlerek 100 ml ye tamamlanr. Bu zelti 1 mg/ml kurun ierir. Standart kurun zeltisi (10 pg/ml), 1 ml stok zeltisinin deiyonize su ile seyreltilmi %1 lik nitrik asitle 100 ml ye seyreltilerek hazrlanr. zeltiden 0; 0.1 ml; 0.2 ml; 0.3 ml; 0.4 ml ve 0.5 ml alnarak deiyonize su ile 5 ml ye tamamlanr. Bylece 5 ml kan ile alldnda 0; 20; 40; 60; 80 ve 100 pg/100 ml konsantrasyonda karma karlk gelecek standart zeltiler hazrlanm olur.

197

Bu standart zeltilere, kan rneine uygulanan ileme tabi tutulur. Organik fazn absorbans okunur. Aletin sfr ayar MIBK'e kar yaplr. Absorbansa hazrlanr. 3) AAS - yarkl kuvars tp kullanarak kanda kurun tayini Alevli atomik absorbsiyon spektrofotometresinin (FAAS) duyarl; yarkl kuarz tp-atom yakalama teknii kullanarak arttrlabilir. Daha nce aklanan MIBK ile selasyon oluturduktan sonra ekstraksiyonla kurun tayinine gre duyarlk 2.5 kez arttrlabilir (Duydu, Y., ve ark. 1998). Bu yntemin prensibi, analizi yaplan ve atomize edilen metal kar konsantrasyonlar iaretlenerek kalibrasyon grafii

atomlarnn k yolu zerinde yarkl kuarz tp kullanm ile daha youn ve daha uzun sre kalmasna dayanmaktadr. Teknik : Yarkl kuarz tp (hazr olarak salanr), akland ekilde %1 lik lantanyum klorrle kaplanr. Kanda kurun tayini yaplrken, daha nce aklanan MIBK'la olan elasyon-ekstraksiyon ilemi uygulanr. Organik faz, yarkl kuarz tp ieren FAAS cihazna alrken pskrtlr ve 217 nm de absorbans okunur. 4) drarda tayini Bu yntemin prensibi, idrardaki kurunun sodyum dietilditiyokarbam (SDDC) ile elasyon oluturmas ve MIBK fazna alnarak, dorudan FAAS ve FAAS-STAT kambinasyonu ile kurun

FAAS'de absorbansnn llmesidir. drarda kurun total, anorganik ve organik kurun olarak tayin

edilebilir. Organik kurun (tetra etil kurun gibi) bileiklerine maruziyette, kurunun bir ksm organik kurun metabolitleri (trietil kurun, dietil kurun gibi) eklinde, bir ksm da anorganik kurun iyonu eklinde atlr. Bu nedenle idrarda organik kurun (PbO) ve anorganik (inorganik) kurun (Pbl) atlrmn 198

ayr ayr tayini ve oranlan (PbO/Pbl), organik kurun bileikleri maruziyetin bir ls olarak deerlendirilebilir (Duydu, Y. Ve ark. 1998). Total kurun atlm ise genel kurun maruziyetinin bir ls olarak kullanlr. idrarda total kurun (PbT) tayini : 10 ml idrar numunesi, asit

dijestiyon frnnn zel tplerine konur ve 5 ml konsantre nitrik asit ilave edilir. 130C da 90 dakika bekletilir. Sre sonunda, zelti bir erlene

aktarlarak 1 ml 1 M dibazik amonyum sitrat ilave edilir. Seyreltik amonyak zeltisi ile pH 7 ye aralanr. 2 ml %3 SDDC ilavesinden sonra 2 ml MIBK ile ekstrakte edilir. Organik fazn absorbans su ile doyurulmu MIBK 'a kar 21 7 nm de okunur. Kalibrasyon erisinden konsantrasyon hesaplanr. Kalibrasyon erisi iin, stok kurun zeltisi 100 mg/l 00 ml, nce 1 ml alnarak deiyonize su ile 100 ml ye tamamlanr (1 mg/l00 ml). Bu zelti uygun ekilde seyreltilerek 0.5 pg/ml ve 7 pg/ml lik standart zeltileri hazrlanr. Standart zeltilerden yntemi uygulanr. Elde 10 ml alnarak, idrarda total kurun tayini edilen absorbanslara kar konsantrasyonlar kurun

iaretlenerek kalibrasyon erisi hazrlanr. Not : Ayn yntem, yarkl kuarz sistemini ieren FAAS ile de duyarln arttrlmas iin kullanlabilir. Pb maruziyetinde idrarda 5-ALA tayini drarda 8-aminolevlinrik asit (ALA) artnn kurun maruziyetinin tansnda kullanlabilecei (biyomarker) 1960'l yllardan beri bilinmektedir. Kandaki ALA ile idrardaki ALA konsantrasyonu arasnda dorusal bir iliki olduu gsterilmitir. Uygulamada idrar ALA konsantrasyonunun tayini daha ok kullanlmaktadr.

199

drarda kondensasyonu

ALA

tayininde

prensip,

ALA'nn

etil

asetoasetat

ile asit)

sonucu oluan

2-metil-3-karbetoksi-4-(3-piropiyonik

piolun (ksaca ALA-priol), etil asetat ile ekstrakte edilmesi ve Erhlich reaktifi ile verdii viyole rengin absorbansnn 553 nm de llmesine dayanr. Kullanlan reaktifler : Stok ALA zeltisi : 50 mg/100 ml (suda) konsantrasyonda hazrlanr. Bu zelti +4C de en az 2 ay dayankldr. Standart ALA zeltileri; 0.6; 1.2; 3.0; 5 ve 6 ml stok zeltiden alnarak su ile 100 ml ye seyreltilir. Bylece 0.3; 0.6; 1.5; 2.5 ve 3 mg/100 ml konsantrasyonlarda standart zeltiler hazrlanm olur. Asetat tamponu (pH: 4 . 6 ) : 70 ml su stne, 5.7 ml glasial (konsantre) asetik asit ve 13.6 g sodyum asetat trihidrat ilave edilerek zlr. Distile su ile 100 ml ye tamamlanr. Ehrlich reaktifi : 30 ml glasial asetik asit zerine 1 g p-

dimetilaminobenzaldehit ve 5 ml %60 perklorik asit ilave edilir. Glasiyal asetik asit ile 100 ml ye tamamlanr. Teknik : Kapakl 2 ayr tpe l'er ml idrar ve l'er ml asetat tamponu (pH: 4.6) ilave edilir. Tplerden birine 0.2 ml etil asetoasetat ilave edildikten sonra her iki tp vorteksle kartrlr (etil asetoasetat ilave edilen tp blank olarak kullanlr). Tplerin her ikisi de kaynayan su banyosunda 10 dk. bekletilir. Tpler soutulduktan sonra her ikisine de 3'er ml etil asetat ilave edilir ve elde alkalanarak ALA-pirol ekstrakte edilir. 3 dk. 3000 rpm'de santrifj edildikten sonra st fazda kalan etil asetat dan 2'er ml alnp ayr tplere aktarlr. Her iki tpe de 2 ml Ehrlich reaktifi ilave edildikten sonra 10 dk. beklenir ve 553 nm de absorbanslar okunur. drardaki ALA konsantrasyonunu tayin etmek iin etil asetoasetat ilave edilen (A) ve ilave edilmeyen (B) tplerinin absorbanslar ayr ayr llr. B

200

tpnden elde edilen absorbans A tpnden elde edilen absorbans dan karlr ve elde edilen absorbans deerine karlk gelen ALA konsantrasyonu standart eriden hesaplanr. Kalibrasyon dorusu : Daha nce hazrlanm olan standart ALA

zeltilerine, numunelerde ALA tayininde aklanan ilemler aynen uygulanr ve 553 nm de okunan absorbanslara kar konsantrasyonlar belirlenerek kalibrasyon erisi hazrlanr. Kurun maruziyetinde porfrinlerin tayini Kurun maruziyetinde, hem metabolizmasnda oluan porfrinlerin

atlmnn hzland yllardan beri bilinmektedir. Porfrinler arasnda en ok roporfinin ve koproporfinin atlm aratrlr. Ayrca kurun maruziyetinde eritrositlerde porfirinlerin de dzeyi artar. Bu porfrinlerin ou protoporfirin eklindedir. Eritrositlerdeki protoporfrinin art kurun zehirlenmesinin

tansnda biyolojik indeks olarak kullanlr. 1) drarda uroprofinin tayini : Yntemin prensibi, idrar rneine disodyumhidrojen fosfat (Na 2 HP0 4 ) ve kalsiyum klorr (CaCl 2 ) ilavesiyle ken porfirinlerden, uroporfriler kalsiyum fosfat zerinde absorbe olur. kelek hidroklorik asitte zlr ve 380. 405 ve 430 nm de absorbanslar okunarak, konsantrasyon hesaplanr. Teknik : 5 ml idrar rnei deney tpne konarak, 1 ml 1 M asetik asit, 4 ml 1 M sodyum asetat ilave edilir. zeltinin pH s 5-5.5'e ayarlanm olmaldr. 15 ml lik santifj tpne pH s ayarlanm idrar rneinden 2 ml konur. zerine 2 damla %5 lik N a 2 H P 0 4 ve 2 ml 1 N NaOH ilave edilir. Vorteksle kartrldktan sonra 30 dakika bekletilir 10 dakika santrifj, 2000 dak/devirle santrifj ediiir.kartrldktan sonra 30 dakika bekletilir 10 dakika santifj (2000 dak/devirle) edilir.

201

st faz atldktan sonra tpe 2 ml 0.1 N NaOH ilave edilir. Tekrar vorteksle 10 dakika kartrlarak santifj edilir. st faz atlr. Kalntya 2 ml su ilave ederek, vorteksle kartrma ve santrifj ilemi tekrarlanr. st faz atlr, alt faz szlr. kelek 10 ml 0.5 N-HC1 iinde zlr. zelti spektrofotometre kvetine aktarlarak, 380; 405 ve 430 nm de 0.5 N-HCl'e kar absorbanslar spektrofotometrede okunur. Uroporfirin miktar aadaki formlle hesaplanr: fig uroporfirin/ml = 0.831 x [ 2 A405 (A38o + A 430 ) ] Burada dzeltilir. 2) drarda koproporfinin tayini Yntemin prensibi: Asitlendirilmi idrardan koproporfrinler eter ile : A absorbans gstermektedir. Sonular kreatinin'e gre

ekstrakte edilir. Eter faz 0.1 N HCI ile ekstrakte edilerek, 380, 401 ve 430 nm de absorbanslar spektrofotometrede okunur. Teknik : Bir ayrma hunisine 15 ml idrar rnei alnr. 1 ml glasial asetik asit ilave ederek, numunenin pH si 2.5 - 3.0'e ayarlanr. 30 ml eter ilave ederek, huninin az kapal olarak 2 dakika alkalanr. Sulu faz atlr, eter fazna 10 ml su ilave ederek tekrar alkalanr. Fazlar ayrldktan sonra, sulu faz atlr. Eter faz temizleninceye kadar su ile ykama (ekstraksiyon) ilemi bir ka kez daha tekrarlanr. Eter fazna / ml 0.1 N HCI ilave edilerek alkalanr. Eter faznn 1 ml 0.1 NHCI ile ekstraksiyonu 5 kez tekrarlanr. Birletirilen asit ekstraktlar 5 dakika 2000 devir/dakikada santrifj edilir. st faz, 1 cm lik spektrofotometre kvetine konarak, 380; 401 ve 430 nm de 0.1 NHCl'e kar absorbanslar okunur. drarda koproporfrin konsantrasyonu aadaki formlle hesaplanr. |ig koproporfirin/ml ekstrakt = 0.817 [2xA 40 - (A3go + A 430 )]

202

Toplam koproporfirin (pg)= (koproporfirin (pg)/ml ekstrakt x 15 24 saatlik idrar ml Alnan idrar rnei "spor" idrar rnei olduu iin,

)x

toplam

koproprofinin miktarndan nce, koproprofinin konsantrasyonu gre dzeltilmelidir. Analiz sonularnn yorumu

kreatinine

Kuruna maruziyet derecesinin belirlenmesinde biyolojik materyalde (kan. idrar, sa, kemik gibi) kurun tayini, kurun absorbsiyonunun derecesini gsterir. Rutin almalarda, kan kurun dzeyinin llmesi yakn zamanda kurun maruziyeti iin bir indekstir. drarda kurun atlm daha uzun sreli maruziyetlerin gsterilmesi iin daha uygun bir kriterdir. zellikle organik kurun bileiklerine maruziyette total kurun tayini yannda anorganik kurun ve organik kurun tayini de nem tar. Kurun maruziyetinde "hem" metabolizmas da etkilenir. Bu nedenle maruziyet derecesi ve kurun entoksikasyonlarda biyolojik indeks olarak hem metabolizmas ara. rnleri olan d-ALA ve porfirinlerin de analizi yaplr. Kurun abrosbsiyonu ve kurundan etkilenmenin tansnda en iyi kriter kan kurunun tayinidir. Vucutta toplam kurun birikiminin yaklak %2 si kanda bulunur. Kan kurununun %90' eritrositlerde toplanmtr. Yaplan aratrmalara gre normalde kuruna mesleki olarak maruz kalmayan

kiilerde, evre kirliliine bal olarak, yetikin ve ocuklarda kurun dzeyi 100 ml kanda 0-40 pg arasnda deiir.(0-40 pg/100 ml kan). Kandaki kurunun 80-120 pg/100 ml arasnda olmas absorbsiyonun arttn gsterir.

203

iddetli zehirlenmelerde ve tehlikeli durumlarda kan kurun dzeyi pg/100 ml kan stne kar.

120

drarda devaml kurun atlm yksek miktarda kurun alnmasn gsterir. drarda litrede 80 pg kadar kurun normal; 80-150 pg/1 kabul edilebilir; 150-200 pg/1 arasnda ise artm kabul edilir. Zehirlenme

olaylarnda bu miktar 250 pg/1 stne kar. Porfirinler ve ALA iin normal ve yksek deerler ise : a) drarda ALA (mg/l) : 0-6 normal; 6-20 mg artm; 20-40 mg/I kabul edilebilir; 40 mg/l ise tehlikeli; b) drarda koproporfirin III (KP III ise) pg/1 olarak normal kiilerde 0150 pg/1 arasndadr. 150-500 pg/l kabul edilebilir, 500-1500 pg/1 artm; 1500 pg/1 st ise tehlikeli; c) Eritrosit protoporfirin dzeyi ise normal kiilerde 0-0.75 pmol/1; mesleki maruz kalanlarda ise 1.5 pmol/1 stne kar. [Anabilim aratrlmas Dalmzda evresel ve mesleki kurun maruziyetinin

ile ilgili almalar ve bulgular ieren literatrler kitabn

sonunda verilmitir].

204

EK - 1 LABORATUVARDA LK YARDIM Kimya laboratuvarlarnda eitli nedenlerle kazalara rastlanmaktadr. Bu kazalar, kullanlan apereylerin krlmas, patlamas ile ilgili olabildii! gibi, ou kez allan toksik kimyasal maddelerin inhalasyonu, gz, deri veya aza temasla veya az yolu ile sindirim yoluna gemesi ile meydana gelen zehirlenmeler eklinde olmaktadr. Bu gibi durumlarda ilk yardm olarak laboratuvarda hemen laboatuvarnda aklanmtr: 1) Laboratuvarda alrken, korunmas gereken en nemli organ uygulanmas gereken nlemler vardr. Her kimya bilmesi gereken bu nlemler aada

alanlarn

gzlerdir. Vakum veya yksek basn altnda alan apereyleri (vakum desikatr, otoklav) kullanrken, patlama tehlikesi olaslna kar, kaln caml salam bir korunma gzl takmaldr. Patlayc maddelerle alrken de korunma gzl takmak zorunludur. Bilinmeyen bir maddenin patlayc olup olmadn, bu maddenin az bir ksm metal spatlle alevde stlarak anlalabilir. Metalik sodyum ve potasyum bu tr kazalara yol aan iki metaldir. Bu nedenle bu metallerin krntlar ak havada braklmamal, lavabo veya p sepetlerine atlmamaldr. Ayrca bunlarla yaplan reaksiyonlar, su banyosu yerine ya veya kum banyosunda yaplmaldr. Bu metaller miktarlarnn 1520 misli alkolle yok edilmeli veya orijinal ieleri iinde saklanmaldr. Bu nedenle yukardaki koullarda alrken, hi olmazsa normal bir gzlk takmak yerinde olur. 2) Eter ve dier uucu yanabilen organik zclerle alrken

bunlarn yannda alev bulundurmamaldr. Yangn kt taktirde yanabilen

205

her ey uzaklatrlr. Alev zerine slak paavra veya karbon tetraklorr dkerek yangn sndrlr. En iyisi, yangn bombas kullanmaktr. 3) Gaz veya zc buharlar ile alrken inhalasyon yolu ile bir zehirlenme olduysa, kii derhal laboratuvardan uzaklatrlr ve yatrlarak scak tutulur. Solunumu zorlayan elbise, saat kay gibi eyalar gevetilir. Hafif ok grldnde ay veya kahve verilebilir. Tbbi bir bakm gerekip gerekmedii, hastann bu ilk yardmdan sonraki durumuna baldr. Amonyak, hidroklorik asit buhar ile hafif bir inhalasyon halinde bile hasta hemen hastaneye yollanr veya doktor arlr. 4) Az, deri veya gzn kimyasal madde buhar veya kendisi ile temasnda, ilk yaplacak i bol su ile temas yerini ykamaktr. Arkadan, eer asit zellikte bir madde ise, sodyum bikarbonat zeltisi ile; kalevi bir madde ise seyrettik asetik asitle temas yerini ykamak gerekir. ounlukla bu maddeler cilt zerinde tahri edici etkiye sahip olduklarndan ykama

ileminden sonra, bir yank pomad (vazelin v.s ) srmelidir. zellikle, gzde b durum olduysa tbbi bakm da yaplmaldr. Ykama iin her laboratuvarda bulundurulmas, mmkn olan aperey (ekil 23) grlmektedir.

ekil 21 - Gz ykama iesi

206

5. zel antidotlar: Korozif ve zehirli kimyasal maddelerle alan laboratuvarlarda, bu maddelerin zel antidotlarnn bulunmas gerekir. rnein: a) Brom, formik asit, hidroflorik asit ve benzeri, dier yakc asitlerle oluan deri yanklarnn tedavisinde (magnezyum+gliserin) pomad

kullanlabilir. 200 g magnezyum oksit, 240 ml gliserinle pasta haline getirilir ve bundan yank ksma dorudan doruya srlr. Ayrca 1 hacim amonyan (d: 0.88) su ile 15 kere sulandrlmas ile elde edilen seyreltik amonyak, brom, formik asit ve hidroflorik asitle oluan yank iddetini azaltmakta yararldr. b) Hidrosiyanik asit, siyanr tuzlar ve nitrillerle (hidrolizle HCN verirler) oluan zehirlenmelerde, aadaki ekilde hazrlanan antidot karm, hemen ilk yardm olarak hastaya verilebilir. A) 158 g demir-2- slfat (FeSO, 7 H 2 0 ) ve 3 n sitrik asit BP souk suda eritilerek bir litreye tamamlanr (Bu zelti bozulduunda kullanlmamaldr). B) 60 g susuz Na 2 CO3 bir litre suda zlr. (A) zeltisinden 50 ml geni azl ve polietilen kapakl bir ieye konur. stne aka okunacak ekilde "SYANR ANTDOTU A " yazl bir etiket yaptrlr. Ayn ekilde (B) zeltisinden de 50 ml alnarak ikinci bir ieye konulur ve "SYANR ANTDOTU B" yazlr. Ani bir zehirlenmede, bu iki ie iindeki zelti birbiriyle kartrlr ve hastaya iirilir. Bu ekilde, demir-2-hidroksit hem enetik olarak etkir, hem de siyanrle toksik olmayan demir bileii oluturur. Burada nemle belirtilecek nokta u d u r : Siyanr zehirlenmesinde ancak yukardaki ekilde bir ilkyardm laboratuvarda uygulanabilir. Bunun dnda hemen doktora bavurmaldr. ntravenz olarak antidot uygulamasn ancak doktor yapabilir.

207

6) yot iilmesi halinde, derhal % l'lik sodyum tiyoslfat iilmelidir. Deri stndeki iyot lekeleri de, ayn ekilde sodyum tiyoslfat zeltisi kullanarak uzaklatrlabilir. 7) Fosforla ykanmaldr. 8) Ayrca byk laboratuvarlarda, solunum zehirlenmelerinde yapay solunum yaptran apereyler bulundurulmas da yararldr. 9) Amonyak tamponu (pH : % ): g amonyum 40 ml 5 M amonyak cilt yanmalarnda, yank yer %3 bakr slfat ile

iinde zlr, su ile 1000 ml ye tamamlanr.

208

EK -2 NEML Ansties REAKTFLERN HAZIRLANMASI dikromat 150 ml distile suda

reaktif : 3.70 g saf potasyum

ziilr.280 ml saf konsantre slfrik asit yava yava kartrlarak ilave edilir.Distile su ile 500 ml ye tamamlanr. Alkol S t a n d a r t z e l t i s i : 100 ml lik b a l o n j o j e y e 50 ml distile su konur. 2.53 ml absol mutlak etil alkol hassas bir pipet veya bretten ilave edilir. Bu srada bret veya pipetin ucu su yzeyine ok yakn olmaldr. Su ile 100 ml ye tamamlanr. Bu ekilde hazrlanan alkol standard % 2 liktir. Alkoll potasyum hidroksit zeltisi : 35 g K O H , 2 0 ml distile suda

zlr. Saf etil alkol ile 1 litreye tamamlanr. Bakr slfat zeltisi (Reinsch deneyi H g iin) : 5 g C u S O . 5 H O, 100 ml I N HCI de zlr. Borat tamponu (pH 9.4) : 24.8 g H BO (borikasit), 0.2 N N a O H ile I

litreye tamamlanr. Bu zeltiden 80 ml alnarak tekrar 2 0 ml 0.2 N N a O H ilave edilir. Brillant green (yeili) reaktifi : 1 g Brillant yeili, 100 ml % 2 5 etil alkolde zlr. Bromfenol mavisi reaktifi (TLC de org. fosforlular iin) : 0.05 g

b r o m f e n o l mavisi 10 ml asetonda zlr ve 100 ml %1 A g N 0 3 (Aseton + su : 1 + 3 da hazrlanm) ile kartrlr. Bromlu edilir. Civa-2-klorr (veya bromr) zeltisi (Gutzeit deneyi) : 0.05 g su : 5 g sv brom cam kapakl bir ieye konarak 100 ml su ilave

b r o m f e n o l mavisi 10 ml asetonda zlr ve 100 ml ye tamamlanr. Asetat tamponu (pH 5) : 13.6 g S o d y u m asetat ve 6 ml asetik asit yeterli

miktarda suda zlr ve su ile 1000 m l ' y e tamamlanr. Cva nitrat zeltisi ( B a r b i t r a t l a r iin) : ( H g O - H N 0 3 ) zeltisi : 0.1 g

H g O 10 damla % 2 5 H N 0 3 iinde zlr. Berrak ksm kullanlr.

209

Demir-3-kIorr ml suda zlr. Diazo zeltisi

(ferri klorr) zeltisi : % 5 lik : 5 g FeCI 3 . 6 H O, 100

(fenol

tayini

iin) : a)

p-nitroanilin zeltisi : 0.75 g p-

nitroanilin 10 ml suda zlr ve 2 0 ml konsantre HCI ilavesinden sonra 2 5 0 ml ye tamamlanr, b) % 5 l i k N a N O ^ (suda). Kullanmadan hemen nce 1,5 ml (b) zeltisi, 2 5 ml (a) zeltisi ile kartrlr. Dragendorff reaktifi : a) 2 g bizmut subnitrat, 25 ml asetik asit ve 100 ml

suda zlr, b) 4 0 g potasyum iyodr 100 ml suda zlr. Kullanrken 10 ml (a), 10 ml (b), 2 0 ml asetik asit ve l o o ml su kartrlr. R a k t i f 2 g n d e bir yenilenmelidir. Fehling r e a k t i f i : a) 35 g C u S O . 5 H O 50 ml suda zlr. (Fehling 1). b) 5 g S o d y u m hidroksit, 17.5 g senyet tuzu (sodyum potasyum bitartarat) 50 ml suda zlr. (Fehling II) Kullanlmadan nce, iki zelti eit h a c i m d e kartrlr. Fenol zeltisi : a) Stok (Standart z e l t i ) : 0.5 g saf fenol 10 ml suda z l r ve 4 ml konsantre HCI ilavesinden sonra su ile 5 0 0 ml ye tamamlanr, b) Seyreltilmi fenol standard : 1 ml stok fenol zeltisi su ile 100 ml ye seyreltilir. Bu zelti 1 ml de 10 m i k r o g r a m (|ag) fenol ihtiva eder. Flourscein reaktifi ( T K i i n ) : 0.04 g flourscein 100 ml etil alkolde zlr. Forrest r e a k t i f i : 25 ml % 0.2 potasyum dikromat (suda); 2 5 ml % 3 0 slfrik asit (hacim/hacim); 2 5 ml % 2 0 perklorik asit (arlk/arlk) ve 2 5 ml % nitrik asit (hacim/hacim) kartrlarak hazrlanr. FPN reaktifi : % 5 ferriklorr, 4 5 ml % 2 0 perklorik asit (arlk/arlk) ve 50

50 ml % 50 nitrik asit (arlk/arlk) birbiriyle kartrlr. F r h d e r e a k t i f i : 0.1 g sodyum molibdat 100 ml konsantre slfrik asit iinde zlr! Gibbs reaktifi : 0.1 g 2,6-dibromokinon-klorimid 2 5 ml % 9 5 etanolde

zlr. C a m kapakl renkli iede ve b u z d o l a b n d a saklanmaldr. zeltinin rengi kahverengiye d n t n d e kullanlmaz.

210

yot zeltisi : a) Genel ( % 2 ) : 2 g iyot ve 4 g potasyum iyodr 100 ml suda zlr. N-iyot z e l t i s i : 12-13 g I ve 2 0 - 2 5 g K 100 ml suda zlr. yodoplatinat zeltisi : 1 g platin klorr 10 ml suda zlr ve 2 0 0 ml % 3 0 luk K iine ilave edilir. Su ile 2 0 0 ml ye tamamlanr. Karm karanlkta

saklanmaldr. zopropilamin zeltisi (Barbitratlar iin) : 5 g izopropilamin 100 ml

susuz metil alkol iinde zlr. Kinin-KI reaktifi ( B i z m u t i i n ) : 1 g kinin slfat 100 ml % 0.5 lik H N O te

zlr. 2 g K ilave edilir. Kahverengi iede saklanr. Kobalt nitrat zeltisi (Barbitratlar iin) : 1 g kobalt nitrat veya kobalt

asetat 100 ml susuz metil alkol iinde zlr. Kromotropik asit zeltisi : 0.5 g kromotropik asit (1,8-dihidroksi

naftalin-3,6-dislfonik asit) su ile 100 ml ye tamamlanr. Kurun tamamlanr. Mandelin iinde zlr. Marme suda zlr. Marquis reaktifi : 3 ml konsantre asite 3 d a m l a % 4 0 lk formaldehit reaktifi : 30 g kadmiyum iyodr ve 6 0 m g potasyum iyodr 180 nl reaktifi : 1 g a m o n y u m vanadat 100 ml konsantre slfrik asit asetat zeltisi : 10 g kurun asetat suda zlr ve 100 ml ye

(formalin) damlatlr. Kullanlmadan hemen nce hazrlanmaldr. M a y e r reaktifi : 1.4 g civa-2-klorr (merkri klorr, H g C I ) ve 5 g potasyum i>odr 100 ml suda zlr. Mecke reaktifi (alkaloidler iin) : 0.5 g selenyz asit 100 ml konsantre

slfrik asitte zlr. Millon reaktifi : 10 g civa, 2 0 ml konsantre nitrik asitle zlr ve eit

hacimde su ilave edilerek kartrlr. N-]-naftiletilendiamin reaktifi : 100 m g N - l - n a f t i l e t i l e n d i a m i n etil alkolde

zlerek, 100 m l ' y e tamamlanr.

211

Nessler reaktifi : a) 2 g HgCl 2 6 g KI ile birlikte az miktar suda zlr. 17 g KH az miktar suda zlerek eklenir. Kartrldktan sonra 100 ml'ye

tamamlanr. b) 3.5 da doymu g potasyum iyodr ve bu 1.25 g cva-2-klorr karma hafif (HgCI 2 ) bir 80 ml su

HgCI 2

zeltisinden

krmz

kelelek iinde

m e y d a n a gelinceye kadar kartrlarak ileve edilir. 12 g K O H bu zelti

zlr, az miktar d o y m u HgCU ilave edildikten sonra su ile 100 ml ye tamamlanr. Bir gece bekletilir, dekante edilerek berrak ksm kullanlr. Palladyum klorr zeltisi (CO iin) : a) 0.22 g PdCI , 2 5 0 ml 0.01 N

H C I ' d e zlr. Gerektiinde hafife stlr, b) 1 g PdCI .H O 100 ml seyreltik HCI de (35 ml konsantre HCI su ile 100 ml ye tamamlanr) zlr. znmenin

t a m a m l a n m a s iin h a f i f e stlmaldr. p-dimetilamin benzeldehit reaktifi (alkaloidler i i n ) : a) (Alkoll zelti)

: I g m a d d e , 100 ml etil alkolde zlr ve 2 damla konstantre slfrik asit damlatlr, b) (Asitli zelti) : 1 g m a d d e 4 0 ml konstantre H S O ihtiva eden 100 ml seyreltik

asitli suda zlr, c) (Asitli zelti) :1 g m a d d e 100 ml konsantre H S O iinde. Pikrik asit zeltisi (alkaloidler i i n ) : Suda d o y m u zeltisi hazrlanr. P o t a s y u m triiyodr ( K I - I ) zeltisi (asitli)

Mikrokristalizasyon iin : 10 g iyot 3 5 g KI 100 ml suda z n r . B u zeltinin 0.4 m l ' s i n e 2 0 ml glasial asetik asit ve 2.0 ml fosforik asit (H P O ) ilave edrek kartrlr. Potasyum iyodr-Na2 S03 (Reinsch deneyi iin ) : 5 g KI ve 2 0 g N a 2

SO., ,7H O, 100 ml suda zlr. Potasyum permanganat zeltisi : a) ( K r o m o t r o p i k asit deneyi iin ): 1.5 g

K m n 0 4 , 7,5 ml % 85 fosforik asit iinde zlr ve su ile 50 ml ye tamamlanr. b) Mikrokristalizasyon iin: 2 g K M n 0 4 su ile 100 m l ' y e t a m a m l a n r ve 5 damla H PO ilave edilir. Pirotannik asit zeltisi ( C O iin ) : 1 g pirogallik asit ve 1 g tannik asit

100 ml suda zlr.

212

Rhodamin zlr, zlr.

B : a) ( T K ' d e pskrtme reaktifi): 0.1 g R h o d a m i n B 100 mI de iin: 0.05 g Rhodamin B 100 ml konsantre HCL iinde

b) T a l y u m

Schiff reaktifi : 0.2 g bazik fksin veya p-rozanilin hidroklorr 120 ml scak suda zlr.Souduktan sonra, 2 0 ml distile suda z l m 2 g anhidr s o d y u m slfit ve 2 ml konsantre HCI ilavesinden sonra az sk kapal iede saklanr. Scott-Wilson reaktifi : a) 5 g cva-2-siyanr 3 0 0 ml suda zlr, b) 9 0 g

sodyum hidroksit 3 0 0 ml suda zlr, c) 1.45 g g m nitrat 2 0 0 ml suda zlr. (c) sonra (a) zeltisine zeltisi tamamen ilave veya souk (b) zeltisi ilave edilir reaktif ve 6 kartrlr ay daya iin

edilirken kelek

devaml

kartrlr.Bu halinde

nabilir.Bulanklk

olumas

atlr.Zehirli

olduu

pipet kullanlmamaldr. Sitrat t a m p o n zeltisi ( p H : 2 . 2 ) : a) 1.187 g N a H P 0 . 2 H 2 0 distile su ile 100 m l ' y e tamamlanr, b) 0.1 M sitrik asit. 2 0 ml (a) ile 9 8 0 ml (b) zeltisi kartrlr. Trinder reaktifi : 4 0 m g merkrik (Hg) klorr 850 ml suda zlr, 120 ml

M hidroklorik asit ve 4 0 g hidrate ferriklorr eklenir, su ile 1000 ml ye tamamlanr.

213

KAYNAKLAR Baselt, R.C., (1980). Biological Monitoring of Industrial Chemicals. California Biomedical Publications. Davis. C.A. Bauer, J.D., (1980). "Carboxyhemoglobin, Methemoglobin and Sulfhemoglobin" in Ciraduohls Clinical Labaratory and Diagnosis. Volume 1, Saint Louise the C.V. Mosby Company. London. 397-405. Borriello, R., Gagliono Candela, R., (1988) "Trace Element Analyse n Forensics" in Development in Analytical Methods in Pharmaceuticals. Biomedical and Forensics Sciences. Piemento G.. Tagliora F., Marigo M., Frigeno A. (Eds) Plenum Press. New York, 67-74. Clarke, E.G.C., (1975). Isolation and Identification of Drugs Vol. 2. the Pharmaceutical Press. I odon. 964-978. C orvalho, O., Lanchote, V.L., Bonato, P.S., Queiraz, R.H.C., Santos, A.C., Dreoss, S.A.C., (1991). "A nevv derivatization, procedure for the analysis of hippuric acid and m-methyl hippuic acid by gas chromatography" Int. Arch. Occup-environ. Health. 63: 33-37. Cox, R.A., Crifasi, J., (1990). "A comparison of a commercial microdifussion method and gas chromotography for ethanol analysis" J. Anal. Toxicol. 14: 211-212. Curry, A.S., (1972). Advances in Forensic and Clinical Toxicology, C.R.C. press. Ohio. Donike, M., (1986). "List of doping classes and methods", Beauftragter ftir Dopinganalytik Des Bundesinstitts fir Sportvvissenschaft. Duydu. Y., Szen, S., Aydn, A., Sayal, A., Imer, A., Vural, N., (1998) "Urinary excretion of total and inorganic lead in tetraethyl exposed vvorkers" Bull: Environ. Contam. Toxicol. 60: 395-401. Duydu, Y., Szen, S., Erdem, N., Lysal, H., Vural, N (1999) "A modifed method for determination of hippuric acid in urine by HPLC" Ankara Ecz. Fak .Derg.28(l),37-46. Duydu, Y., Vural, N., (1996). "Hai iindeki majr kannabinoidler olan THC, CBD'nin TK ve kapiler gaz kromatografisi yntemleri ile tayinleri" GATA Blteni, 38, 292-296. Duydu, Y.,Vural, N.. (1998). "Urinary excretion of lead and 6-aminolevulinic acid in vvorkers occupationally exposed to tetraethyl lead" Biological trace element research 63: 185-194. Ellenhorn, M., Schvvald, S., Ordog, G., Wasserberger, J.. (1997). Ellenhorn's Medical 1 o\icology. Williams & Wilkins a Waverly Company, 2. bask, 50-64. Emerson, V.J.. (1998). "Alcohol Analysis" in Essentials of Forensic Science, White P.. (Edt). The Royal Society of Chemistry. London. 263-287. Feldstein, M.. (1967). "Methods for the Determination of Carbon Monoxide" n Progress n C hemical Toxicology Stolman. A. (Edt), Academic Press, London:99-l 19. Flanagan, R., Braitwaite, R Brown, S.S.,Widdop, B., de. Wolff, F.A.. (1995). Basic Analytical Toxicology. WHO Genova.

214

C r a f , E., Preuss Fr., R., (1969). Gadamers Lehrbuch der Chemischen Toxikologie und Anleitung zur Ausmittelung der Gifte, Vandenhoeck & Ruprecht in Gttingen, Band I. II 3.
bask.

Gley, M., Vural, N (1975). Toksikolji Laboratuvar Kitab, Ulucanlar Matbaaclk Sanayii. ( Ankara. A..Ecz. Fak.Yaynlar, No: 37). Gndz, T.. (1988). Instrmental Analiz. A.. Fen Fak. Yaynlar, (no, genel: 147, analitik: 6) A.. Basmevi. Ankara. k a y e , S.. (1961). Handbook of Emergency Toxicology, Charles & Thomas publisher. Spinglleld Illinois. 2. bask. Kp, ., Vural, N., (1993) "Sk zehirlenme nedeni olan ilalarn teraptik ve toksik kan dO/cylerinin aratrlmas", Trk Hij. Der. Biyol. Derg. 50, 103-114. Lovvry, L. K.. (1986). "Biological exposure index as a complement to the TLV", (hrp. Mde. 28, 578-582. ./

Moffat, A.C., Jackson, J.V., Moss, M.S., Widdop, B.. (1986). Clarke's Isolation And Identification Of Drugs. The Pharmaceutical Press, London 2. bask. Pannel, L.K., Thomson, B VVilkinson, L.F.. (1983). "A modified method for the analysis of carbon monoxide in postmortem blood", J Anal. Toxicol. 1-6. Poklis, A.. (1996). "'Analytical / Forensic Toxico!ogy" in Cassarett & Doull's Toxicology Klaasser C.D (Edt) 5. bask Mc Graw Hail New York , 951-969. Ssrrano, L., Capshaw, B., Quattrocchi, F., (1988) "A Comparison of a microdiflusion method for ethanol and the Abbot TDx ethanol assay", J. Anal. Toxicol. (12):348-349.

Siegel, J.A.. (1988). "Forensic Identification Of Controlled Substances" in Forensic Science Handbook. V:II Saferstein, R.(Edt), Prentic Hail, 70-131. Stolman, A., (1963). Progress in Chemical Toxicology V:I, Academic Press, London 1. bask. Trevisan, A.. (1990). "Concentration adjustment of spot samples in analysis of urinary \enobiotic metabolites", An. J. !nd. Med. 17: 637-642. Vural, N.. (1996). Toksikoloji. A.. Basmevi, Ankara (A.. Ecz. Fak. Yaynlar, No: 73). Vural, N., Burgaz, S..( 1984). "Trkiye'de kullanlan klorlu fenoksiasetik asit grubu

herbisitlerin idrarda tayini iin bir yntem". Doa Seri C, 8, 406-412. Vural, N Gvendik, G., (1983). "Ankara'da hava ve insanlarda kan kurm seviyesinin aratrlmas". Doa Bilim Dergisi: Tp (7) 192-200.

Vural, N., Kahraman, R..(1994). "Karbonmonoksit zehirlenmesi ile lenlerde ve sigara ienlerde karboksihemoglobin ve methemoglobin dzeyleri", Ankara Ecz. Fak. Der. 23 (1-2): 11-20.

215

Vural,

N.,

Motacedded,

Z:

(1978).

"Standard ization

of

carboxyhemoglobin

by

microspectrophotometric method and application of the method to vvorkers occupationally e\posed to carbonmonoxide", A.. Ecz. Fak. Mec. 8(1): 55-68. Vural, N., Sayg, .. (1981). "Kan alkolnn (mikroyntemle; GLK ile tayini ve yntemin trafikte uygulunmasf. A.. Ecz. Fak. Mec. (II) 2: 190-199. Vural, N., Sayg, .. (1983). "Organik baz yapsndaki stimlanlarn (doping maddelerinin) idrarda TK ve GLK ile nitel ve nicel analizleri",. A.. Ecz. Fak Mec. 13(1-2): 65-77. \ ural, N Sayn, H (1995). "Effect of time interval between the tralTic case and alcohol on the legal blood alcohol limit in traffc accidents", A.. Ecz. Fak. Derg. 24(2): 83-94. Vural, N., Sayn, H.. (1996). "Kan alkol dzeyini etkileyen faktrlerin adli tp asndan deerlendirilmesi". Adli Tp Blteni 1(2): 74-81. Vural, N., Szen, S.. (1989). "drarda testosteron ve epitestosteronun ince tabaka

kromotografsi ve gaz sv kromotografisi ile tayini", A.. Ecz. F.miron. Contam. Toxicol. 57:315-320.

Fak.Derg.l9(l-2):59-70.

Vural, N., nl, H (1996). Methylmercury in hair of fishermen from Turksh coasts. Bull.

VVRARLANILAN TEZLER Aksu an, N'., (1993). Baz la ve Pestisitlerin Enzimatik Yklanma ile Postmortem Analizleri (A.. Adli Tp Ens. Doktora Tezi, Danman: Prof. Dr. N. Vural) (A..: Aratrma fonu. Proje No: 90-20-00-01). Alikaifolu, N., (1995). Postmortem Kanda Kolinesteraz Aktivite Tayininin Adli Toksikoloji Asndan Deerlendirilmesi. (A..Salk Bilimleri Ens. Yksek Lisans Tezi, Danman: Prof. Dr. N. Vural). Bahardoan, N., (1996). Metil Alkol Zehirlenmesinde Biyolojik Materyalde Biyokimyasal Deiikliklerin ncelenmesi (A.. Salk Bilimleri Ens. Yksek Lisans Tezi, Danman: Prof. Dr. N. Vural). Besbelli, N. (1993). Organik Fosforlu nsektisitlere Mesleki Ve ndirekt Maruz Kalmann Toksikolojik Ynden zlenmesi (A..Salk Bilimleri Ens., Farmastik Toksikoloji Anabilim Dal. Doktora Tezi. Danman: Prof. Dr. N. Vural). Burgaz, S. (1983).Trkiye'de Kullanlan Dipiridil Grubu Ve Klorlu Fenoksiasetik Asit Grubu I Icrbisitlerin Analitik Toksikoloji Asndan ncelenmesi (A.. Eczaclk Fakltesi, Farmastik Toksikoloji Anabilim Dal Doktora Tezi. Danman: Prof. Dr. N. Vural). Doanyiit, R. (1999). Aromatik Hidrokarbonlara Mesleki Maruziyetin Biyolojik ve evresel Olarak zlenmesi (A..Salk Bilimleri Ens.. Disiplinleraras Anabilim Dal, Doktora Tezi. Danman: Prof. Dr. N. Vural).
216

Duydu, Y. (1995). Alkil Kurun Bileiklerine Maruziyetin Biyolojik zlenmesi (A.. Salk Bilimleri Ens. Doktora Tezi. Danman: Prof. Dr. N. Vural) (A.. Aratrma Fonu, Proje No: 91300007). Ergun, B. (1986). Modifiye Bogen ve Gaz Sv Kromotografisi Yntemleri ile Kanda Etil Alkol Tayininin Analitik Toksikoloji Asndan Aratrlmas. (Yksek Lisans Tezi. Farmastik Toksikoloji Anabilim Dal, Danman: Prof. Dr. N. Vural). Gvendik, G., (1982). Ankara'da Hava ve nsanlarda Kurun Seviyesinin

Aratrlmas (A..Ecz.Fak. ve TBTAK Tp Aratrma Grubu; Proje No : TAG 433; Doktora Tezi. Danman: Prof. Dr. N. Vural). karakaya, A.. (1982). Trkivede Sk Olarak Zehirlenmelere Neden Olan la ve Pestisitlerin Xad-2 ile drardan zolasyon Koullarnn Aratrlmas ve Bir Toksikolojik Analiz Tarama Ynteminin Gelitirilmesi (A.. Ecz.Fak.Toksikoloji Bilim Dal Doktora Tezi. Danman: Prof. Dr. N.Vural). Motaceded, Z. (1977) Mikrosspektrofotometrik Yntemle Karboksihemoglobin Tayininin Siadardizasyonunu ve Bu Yntemle Mesleksel Olarak Karbonmonoksite Maruz Kalanlarda Kabonmonoksit nhalasyonunun Saptanmas (A.. Ecz. Fak. Toksikoloji Krss Doktora Tezi. Danman: Prof. Dr. N. Vural). Sayg, . (1982). Organik Baz Yapsndaki Stimlanlarn (doping maddelerinin) drarda TK ile Nilel ve Nicel Analizleri. (A.. Ecz.Fak. Toksikoloji Bilim Dal Doktora Tezi, Danman: Prof.Dr. N. Vural). Sayn, H., (2000). Alkol Hassasiyeti ve Alkol Metabolizmas Enzimlerinin Postmortem

Aratrlmas ve Adli Toksikoloji Asndan Deerlendirilmesi (A..Salk Bil. Ens. Doktora le/i. Danman: Prof. Dr. N. Vural). Szen, S. (1988) Anabolik Siteroitlerin drardan zolasyonlar ve Tanmlanmalar. Testosteron Ve l .pitestosteronun GSK ile Tayini (A.. Salk Bil. Ens. Y. Lisans tezi. Danman: Prof. Dr. N. Vural. A.. Aratrma Fonu No: 87-30-0012). Tmtrk, N., (1998). Dk Dzeyde Kurun Maruziyetinde Baz Biyokimyasal

Parametrelerin Aratrlmas (A.. Sa. Bil. Ens. Doktora Tezi. Danman: Prof. Dr. G. Gvendik). Usanmaz, S.. (1994). Yeri Ortamnda Formaldehitin evresel zlenmesi (A..Adli Tp Ens. Y.Lisans Tezi.Danman: Prof. Dr. N.Vural).

217

NDEKS
-AAAS. 50. 64. 65. 66. 194. 195. 196. 198 Aldehitler, 20. 36. 104 Aldrin. 182. 183. 184 Alkaloidler, 1 3 . 3 1 . 4 0 . 4 4 , 2 1 1 , 2 1 2 Alkil fosfat. 185 Alkil kurun. 195 Alkolmetre. 112. 114 Amberlit XAD-2. 46. 47. 48 Amfetamin. 34. 44. 172, 174. 175. 176 Amloter maddeler. 43 Amioklorobenzofenon. 154 Aminolevlinik asit. 195 Amoharbital. 52. 142 Amonyum pirolidin ditiyokarbamat, 196 Aili'. 17. 18. 36. 138, 139, 140, 159 Antijen. 66. 67 Antikor. 66. 67. 69. 70. 71, 73 Antimon. 3. 26. 27. 28, 65 Antipirin, 18. 44. 109 Apoorfin. 21 Aromatik primer aminler, 36 Arsenik. 26. 28. 194 Asetamid. 118 Asetaminofen. 49. 159 Asetil tiyokolin. 25 Aseton. 7. 17. 19. 32. 36. 56. 105. 124, 144. 177. 179. 186. 187 Asidik ila. 52 Asidik iyodoplatinat. 57 Aspirin. 22. 155. 158 Atomik absorbsiyon spektrofotometresi, 65. 194 - BBakr. 26. 27. 28. 29. 91. 104. 167. 208 Barbital. 142. 143. 147. 149, 150 Barbitratlar. 13. 31. 49. 60. 69. 74, 144 Bea testi. 169 Benzen. 17. 31. 32. 34. 46. 64. 125, 126, 127. 137 Benzodiazepinler. 150. 151. Benzofenon. 154
218

Berlin mavisi, 24. 92 Bizmut, 3. 26. 27. 28,210 Bratton-Marshell, 151, 153 Buchwald, 81 -CCva, 3, 26, 27, 28, 29, 31, 36, 52, 136, 156. 212,213 Cva-1, 52 Civa-2, 157,211 Conway mikrodifzyon, 37, 38. 88. 95. 96. 101. 102. 107. 108 inkofen, 42 -D5.5'- ditiyobis (2-nitrobenzoik asit), 189 DDT, 182 Demir-2-hidroksit, 207 Demir-3-klorr, 20, 93 Desipramin, 22 Dializ, 11,31 Diazepam, 150, 152, 154 Diazinon. 184. 188 Diazo reaksiyonu, 36 Dieldrin, 182. 183 Dietileter, 128 Dietilfosfat, 185 Dietilpropion, 172 Difenilamin, 23, 24, 175 Digoksin, 4, 15, 69, 73 Diklorvos, 185 Dikromat testi. 20 Dikuat, 23, 25 Dillie-Koppany testi, 167 Distilasyon. 3 1 , 3 4 , 4 0 , 126, 138 Ditiyonit. 80. 83. 84 Dokofan, 183 Doping, 171. 172, 176, 177.214.216. Dowex 50, 47 Dragendorff, 173, 210 DTNB. 189. 190. 191, 192 Dubovvski yntemi, 81. 90 Duquenois-Levine reaktifi, 166

-EEledrin. 18. 172. 176 Ekstraksiyon. 39 F.metin. 44 En/im dijestiyon yntemi, 39 En/im yklama yntemi, 44, Epitestosteron. 176. 180 Eroin. 15 Eserin salisilat. 191 Esrar. 166, 170 Eter. 17. 41. 44, 47. 147, 172, 180. 202 Etil alkol, 20, 32. 40, 99, 103, 104, 112 Etil benzen. 125 Etilen klorr. 32
- F - "

Gaz kromatografisi, 50, 61, 62, 103, 125 174. 176 Gettler-goldbaum yntemi, 94 Glukoz, 7, 19, 2 0 , 2 5 Glutetimid, 9, 42 Guayak reinesi, 91 Guayakol. 33 Guignard deneyi, 36 Gutzeit. 28. 29. 30. 209 . - HHead space, 103 Heptadekanoik asit, 129 Heptaklor, 183. 184 Hidrofob ntral maddeler, 44 Hipprik asit, 127 HPLC, 11, 50, 63. 74, 118, 132. 134, 143

1 AAS. 196. 197. 198. 199 Fehling deneyi. 19. 20 Feldstein ve klendshoj. 35 Feasetin. 18. 23. 36. 163 Fen il butazon. 42 Fenil hidrazin. 117 Fen il salisilat. 44 Fenilpropiyonat. 177. 179 Fenitoin, 4. 18. 69 Fenobarbital. 57. 143. 145 Fenoller. 33. 36. 38. 134. 135, Fcnotiyazinler. 25 Fentermin. 174 Ferri klorr. 20 Ferrosiyanr, 24. 36. 92 Fi/ostigmin salisilat. 191 Floresans polarizasyon immunoassay, 72 Floroglusin. 21 Formaldehit. 17. 99. 101, 102. 117. 118. 119.211 l'omalin. 117. 211 Formalin. 116. 117 Formik asit. 99. 118. 119, 120, 207 Formol. 116 Fpn reaktifi. 22 Fraksiyonlu ekstraksiyon, 39. 41. 44 Froehde reaktifi. 165 Fujivvara deneyi. 22

ila + antikor. 67 mmunoassay, 12, 44, 66, 67, 68, 69, 70. 71, 74 nce tabaka kromatografisi, 11. 14, 51 ndofenol reakisyonu, 36 yodoform deneyi, 35 zonitril deneyi, 35 zopurpurik asit. 92
- K -

-C(iallik asit. 21
219

Kadaverin, 13 Kadmiyum, 31, 194, 211 Kafein, 44 Kafur, 21 Karboksihemoglobin, 25, 77, 80, 83, 215 Karbolikasit, 134 Karbon monoksit, 49, 77, Karbon tetraklorr, 17, 22, 121, 126, 206 Ketonlar, 19, 20, 36 Kinin, 28, 44,211 Kloral, 22, 34 Kloralhidrat, 17,20, 36. 123, 170 Klordiazepoksit, 150, 152 Klorfeniramin maleat, 57 Klorlu hidrokarbonlar, 122 Klorlu siklodien. 182 Kloroform, 17, 20, 32, 41, 52, 61, 121, 139. 157, 177, 186

Klorpromazin. 57 Kobalt tiyosiyanat. 166 Kodein. 170 Kokain. 15. 165. 166. 167, 171 Kolinesteraz. 25. 186. 188. 189, 193 - Aktivitesi. 186 Konii. 33 Kontroll maddeler. 163 Kreatinin. 75. 76. 77. 132, 134, 202 Kreatinin tayini. 75. 134 Krezol. 5. 18. 21. 23. 127. 159, 160. 162. 163 Kromatografik yntemler. 50 Kromotropik asit. 34. 99, 100, 101. 117,
118.211

Mikrodifzyon, i 1, 35, 37, 58, 95. 96, 106. Mikroskopik inceleme, 164 Millon reaktifi, 136 M-MHA, 129, 130, 131, 133. 134 Morfin. 9, 168. 170 -N N- (1-naftil) etilen diamin, 152 Nandrolon, 177 Narkotikler. 163, N-asetil-p-aminofenol, 159 NBD, 172. 173, 174 Nessler reaktifi, 36 Niketamid, 57 Nikotin. 17, 34. 5 2 . 6 9 Ninhidrin, 57, 172 Nitrobenzen, 17, 18, 126 Nitrzasit. 161 Nordazepam, 150 Norefedrin, 174 Ntral maddeler, 42, 43, 44 Ntron aktivasyon analizi, 50, 65
- O - -

Ksentogenat deneyi. 104 Ksilen. 64. 125. 127. 129. 131. 133 Kprz iyodr. 27 Kurun. 194. 195.201.203,211, -LL.abstix. 19 Lantanyum klorr. 197 Legal deneyi. 36 l.iebermann'n indofenol. 135 l.indan. 184 l.orazepam. 150 I s n . 169
- M -

O-krezol. 127 Okzalik asit. 18. 42 Organik asitler, 17 Organik bazlar. 42 Organik fosfat esterleri, 47, 186 n denemeler, 17 -PPalladyum klorr, 88 P-aminofenol, 23, 138, 139, 159 P-aminosalisilik, 155 Papain, 45 Parakuat, 23, 25. 47 Parasetamol, 23, 60, 159, 162 Paration, 185. 188 Parri deneyi, 143 P-dimetilaminobenzaldehit, 128. 200 Pentobarbital, 145 Perfenazin, 52 Pestisitler. 31.39. 182. 184 Pikrik asit, 18 Piridin, 17, 22, 36. 38, 95, 96, 97, 98. 123. 124, 127, 186, 187
2 2 0

Malation. 184. 187 Mandelin reaktifi. 52. 56. 168. 169 Marquis reaktifi. 168. 169 Marsh testi. 3 Mecke reaktifi, 169 Mefenamik. 52 Metalik zehirler. 26 Metamfetamin. 172. 175 Metanol. 56. 99. 100. 101, 102, 128. 129 Methb. 79. 80. 86. 89. 140, 141. 163 Methemoglobin. 19. 80, 83, 139. 163.215 Metil alkol. 20. 99. 101, 104. 108, 183 Metil hipprik asit. 129 Metil kloroform. 121 Metil salisilat. 17. 154. 155. 156 Metil testosteron. 180 Meloksifenami. 172. 175

Piidin-barbitrik asit. 96, 97 Pirogallik asit. 212 Pirotannik asit. 78 P-itroanilin. 136. 210 P-nilrofenol. 138. 185 Porfirinler. 18 Pralidoksim klorr. 189 Prier aminler. 36 P otoporfirin. 201. 204 Putresin. 13 - RReinsch deneyi. 194. Renk reaksiyonlar. 56. 91, 92, 127 -SSakkarin. 42 Salisilamid. 22. 156 Salisilatlar. 24. 155 Salisilik asit, 18. 42. 57. 155, 156, 157, 158 Sanonin. 19. 21 SehitY reaksiyonu. 117 Sohiff rei'iktifi. 36 Scol (R.ybal) testi. 166 Sekonal, 18 Sekoder aminler. 172 Sekonder aminlerin. 173 Selenyum. 26 Sislein. 162. 192 Siyanr. 33. 36. 38. 90. 91, 92, 93, 95, 97.

TDX, 215 Tellryum, 26 Temazepam. 150. 151. 153 Teofilin, 4, 52 Testosteron, 177, 179, 181, 216 Tetra etil kurun, 195, 198 Tetrahidrokannabinol, 7 Tetrametil kurun, 195 Tiyopental, 142 Tiyoridazin, 52 Toksik anyonlar. 31 Toluen, 33, 127. 132, 134 Tranilsipromin, 172 Trikloro bileikleri, 22 Trikloroetanol. 22 Trikloroetilen, 20. 32, 121, 123. 124 Trimipramin, 22 Trinder reaktifi, 22, 24, 156, 157 Trinder testi, 22, 24 Tripsin, 45, 48 Triton x-100, 196 Tbokrarin, 69
- U -

Uucu olmayan organik zehirler, 31 Uucu zehirler, 9, 34 Uroporfrin. 202 UV spektrumlar. 14, 60 UV-spektrofotometre. 50 - VVaiLn-slfrik asi , 178 Vitali deneyi. 165
!

98. 14 . 207
Siy anrler. 36 Sodyum llorr. 10. 105 Sorel band. 79 Speklroskopi. 64. 65 Spekoskopik yntemler. 50 Spol testler. 164 Stas-otto. 4. 39. 40. 41, 44 Striknin. 13 Su buhar distilasyonu, 32 Sujbert yntemi. 100 Stil 1 lir. 17. 33. 80. 104 -TI. I. I .-irikloroeta, 121 T/K oran, 181
221

Walkley et al, 137 Widmark faktrleri, 115 - YYarkl kuvars tp, 196 -ZZayf asitler, 42, 43 Zvvikker reaksiyonu, 167 Zvvikker reaktifi, 168

-t

i l

ISBN: 975-482-512-2
A n k a r a niversitesi Basmevi 2 0 0 0