COLEGIO DE BACHILLERES DE TABASCO COLEGIO DE BACHILLERES DE TABASCO PLANTEL 5

NOMBRE DE LA PRCTICA: Preparacin de colorantes 5 D T/M EQUIPO: 1

INTEGRANTES:
GARCIA CRUZ SANDRA GARCIA VALENCIA LUISA MANUELA HERNANADEZ RAMIREZ SUSY KATE HERNANDEZ LOPEZ JOSE DOMINGO HERNANDEZ SANCHEZ RUDULFO ANTONIO JIMENEZ VELAZQUEZ MARIA EDITH RAMOS SANTOS JAVIER ALFREDO

I.Q. L. Mara de Lourdes Rivera Hernndez

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OBJETIVO DE LA PRCTICA

El alumno empleara tcnicas bacteriolgicas simples, como tambin distinguir las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.

INTRODUCCIN

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Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve Gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente: El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gramnegativas, los lpidos de la pared (ms abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular. Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn (1923) bas la suya en una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las bacterias, Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran parte a su contenido protenico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y con los bsicos en medio alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el punto isoelctrico. Como los microorganismos contienen ms de una protena, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye ms bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los microorganismos Gram positivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:

Los microorganismos Gram positivos pueden hacerse Gram negativos al aumentar la acidez. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse Gram positivos al aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples, sino ms bien una dbil combinacin de sustancias protenicas con otras lipoideas o grasas.

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La materia grasa extrada de los microorganismos Gram positivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carcter ms cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes bsicos. El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos dbilmente Gram positivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se vuelve cida en el curso del desarrollo.

Gianni (1952) comprob que los microorganismos Gram positivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reaccin. Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un ncleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reaccin Gram positiva depende de que se forme una combinacin compleja entre los componentes de la coloracin de Gram y las protenas de la pared celular, sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios fsicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podra cambiar el carcter qumico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los grmenes Gram positivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram. La pared celular de los microorganismos Gram positivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la clula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusin celular exenta de protenas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinin de que la reaccin Gram positiva consiste esencialmente en la formacin, dentro de la clula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difcil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos Gram positivos, a diferencia de la de los gramnegativos, sera prcticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecern teidos despus de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminar sin dificultad el complejo formado despus del tratamiento con yodo. Ni los grupos sulfhidrilo ni las protenas bsicas han influido especficamente en el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloracin.

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La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaos, morfologas celulares y reaccin Gram (color). A nivel del laboratorio es til como test para un rpido diagnstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clnica. Las bacterias se tien Gram positivas (+), Gram negativas () o no se tien debido a sus diferencias en la composicin de su pared y arquitectura celular. Las bacterias Gram (+) tienen una gruesa capa de pptidoglucano y gran cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la decoloracin con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular est intacta o daada (por tratamientos antibiticos, edad celular). Las bacterias Gram () tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de lipopolisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol y/o acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tincin azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tincin de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas tpicas son los estafilococos que producen fornculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis.

Preparacin de colorantes

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1. Acido-Alcohol: (decolorante para tincin Ziehl-Neelsen) o cido clorhdrico concentrado ..........................................................3 ml o Etanol 95% ....................................................................................97 ml 2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos. o Azul de metileno................................................................................1 g o Agua destilada...............................................................................100 ml 3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. o Solucin de hidrxido potsico al 1%.................................................1 ml o Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml o Agua destilada...............................................................................100 ml 4. Colorante para esporas: o Solucin acuosa saturada de verde malaquita 5. Colorante para flagelos de Leifson: o Solucin A Fucsina bsica .........................................................................1,2 g Etanol 95%.............................................................................100 ml o Solucin B cido tnico................................................................................3 g Agua destilada.........................................................................100 ml o Solucin C Cloruro sdico..........................................................................1,5 g Agua destilada.........................................................................100 ml Para preparar la solucin de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado hermticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. 6. Cristal violeta: Para tincin Gram y tincin simple. o Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g o Agua destilada.................................................................................100 ml 7. Eosina: Para observacin de clulas sanguneas. o Eosina...............................................................................................0,3 g o cido actico glacial......................................................................0,025 ml o Agua destilada...................................................................................100 ml 8. Fucsina diluida: Para tincin Gram y tincin simple. o Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen......................................................10 ml o Agua destilada.................................................................................100 ml 9. Fucsina fenicada de Ziehl- Neelsen: Para tincin cido-alcohol resistente. o Fucsina bsica......................................................................................1 g o Etanol 95%........................................................................................10 ml o Fenol 5% en solucin acuosa............................................................100 ml 10.Hematoxilina: Para observacin de clulas sanguneas. o Hematoxilina.........................................................................................2 g o Agua destilada......................................................................................1 l 11.Lacto fenol: Para preparaciones microscpicas en fresco de mohos. o cido lctico.....................................................................................100 ml

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Fenol................................................................................................100 g Glicerol.............................................................................................200 ml Agua.................................................................................................100 ml 12.Lacto fenol al Azul Algodn: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. o Solucin de azul algodn Sol. saturada de azul algodn (azul anilina soluble)......................10 ml Glicerol.....................................................................................10 ml Agua.........................................................................................80 ml Mezclar esta solucin con lacto fenol a partes iguales 13.Lugol: Solucin de yodo para tincin Gram. o Yodo...................................................................................................1 g o Yoduro potsico..................................................................................2 g o Agua destilada.................................................................................300 ml 14.Orcena A: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................45,8 ml o cido clorhdrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml o Agua..................................................................................................45,8 ml 15.Orcena B: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................55 ml o Agua..................................................................................................55 ml 16.Safranina: Colorante de contraste para tincin Gram (preferible a la fucsina) y esporas. o Safranina.........................................................................................0,25 g o Agua destilada..................................................................................100 m 17.Sudn III: Tincin especfica de grasas. o Alcohol etlico...................................................................................100 ml o Sudn III...................................................................................hasta saturacin
o o o

18.Verde de metilo actico: Igual composicin que la eosina (num. 7)

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MATERIALES

Porta objetos de cristal limpio.

Asa estril Soporte de coloracin Agua del grifo Aceite de inmersin Papel secante o sustituto equivalente Microscopio

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PROCEDIMIENTO

1. Prepare una extensin fina, uniforme de muestra y seque al aire

2. Fije al calor y deje enfriar 3. Inunde el portaobjetos con violeta de cristal o violeta metilo y deje reposar durante 1 min. aclrelo con agua
4. Inunde el porta objetos con yodo de Gram o de lugol y deje reposar

durante 11 minuto. Aclrelo con agua 5. Decolore suavemente seg.aclarelo con agua. segundos. 7. Aclare bien con agua, seque suavemente la mancha ( extensin) 8. Vase usando el microscopio. con el diferenciador durante aprox.10

6. Inunde el porta objetos con el colorante de contraste, durante 30 60

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DIBUJOS

Prepare una extensin fina, uniforme de muestra y seque al aire, Fijar al calor y deje enfriar

Inunde el portaobjetos con violeta de cristal o violeta metilo y deje reposar durante 1 min. Aclrelo con agua

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Inunde el porta objetos con yodo de Gram o de lugol y deje reposar durante 11 minuto. Aclrelo con agua

Aclare bien con agua, seque suavemente la mancha (extensin)

Vase usando el microscopio.

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DIAGRAMA

COLEGIO DE BACHILLERES DE TABASCO CUESTIONARIO

1. Qu es coloracin Gram? Es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias 2. Por qu es importante fijar el frotis?

El frotis debe ser fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados.
3. Qu otros mtodos de fijacin se pueden emplear?

Adems del mtodo de fijacin por calor el cual consiste en pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos y dejar enfriar el portaobjetos entre los pases, existen otros que son: Mtodo de fijacin qumica.
4. Con que tipo de cultivos se hacen prueba de patrn? (Gram+ y Gram-)

5. Por quin fue descubierto la coloracin de Gram?

Christian Gram
6. Qu presentan las bacterias Gram positivas?

Una gruesa capa de peptidoglicano

7. Qu presentan las bacterias Gram negativas?

Una delgada capa de peptidoglicano

8. Cules son Las bacterias Gram positivas?

Son aquellas que absorben el colorante primario llamado cristal violeta y se ven de color prpura azulado en el microscopio. 9. cules son Las bacterias Gram negativas? Son aquellas cuya pared absorbe el colorante de contraste que segn el que se use puede ser fucsina o safranina y que en el microscopio se observan de color rojo o rosado.

COLEGIO DE BACHILLERES DE TABASCO OBSERVACIONES

Como observacin nosotros los alumnos aprendimos a Identificar la coloracin Gram positiva de la Gram negativa. Al igual que la gran importancia que tiene la elaboracin de colorantes Gram, dentro del laboratorio, como tambin la importancia y el manejo adecuado que tienen las bacterias Gram positivas, como lactobacilos acidophilus, retienen el tinte y se colorean de azul a travs de esto comprendimos como se debe hacer paso a paso para la preparacin.
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COLEGIO DE BACHILLERES DE TABASCO CONCLUSION

Durante la realizacin de la prctica, nos dimos cuenta de la importancia que tiene la preparacin de colorantes Gram, pues de ese modo este pueden hacerse correctamente y con limpieza para que los resultados que se obtengan posteriormente sean los ms exactos posibles, pues as se determinar ms fcilmente. Como tambin pudimos clasificar la bacterias sobre la base de sus formas, tamaos, morfologas celulares y reaccin Gram (color).

BIBLIOGRAFIAS

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http://www.google.com Maestra: M. Lourdes rivera Hernndez

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Manual of clnica microbiologa lennette.

Aulton Michael E., Ciencia y diseo de formas farmacuticas, 2 edicin, Ed. Elsevier Espaa, 2004. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th Ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-7. Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th Ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-13-066271-2. Sgaard M, Nrgaard M, Schnheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin Microbiol 45: 1113