GENERALIDADES DE B.thuringiensis Bacillus thuringiensis es un bacilo gram positivo anaerobio facultativo y mvil.

Pertenece al gnero Bacillus, y tiene caractersticas muy similares a Bacillus cereus, aunque, a diferencia de ste, Bacillus thuringiensis forma inclusiones cristalinas visibles al microscopio ptico durante la esporulacin. Estas inclusiones cristalinas estn compuestas por protoxinas, que contienen D-endotoxinas, de actividad insecticida especfica contra insectos. Algunas variedades de Bacillus thuringiensis, al igual que Bacillus cereus, pueden adems producir otra toxina, la b-exotoxina. Es una toxina que se produce durante el crecimiento vegetativo, y es un derivado nucleotdico de la adenina que funciona como inhibidor de la RNA-polimerasa. Pero la utilizacin de esta toxina est prohibida en algunos pases, pues es txica tambin para mamferos. VARIEDADES DE B.thuringiensis
B.thuringiensis

var. Israelensis. Es efectiva frente a mosquitos chupadores de sangre transmisores de un amplio espectro de enfermedades animales causadas por virus, bacterias, helmintos o protozoos.

B.thuringiensis var. Tenebrosis. Descubierta en 1983, posee un patotipo

efectivo contra larvas de colepteros. Puede infectar a la larva del escarabajo colorado de la patata, causante de la mayor peste de las patatas en Europa y Norte Amrica, que ha desarrollado resistencia a muchos insecticidas qumicos.
B.thuringiensis var. kurstaki cepa HD-1. Es la cepa bsica usada en

muchas preparaciones para el control de orugas. Su gen de la protena insecticida fue el primero en clonarse. Casi todas las variedades de B. thuringiensis son capaces de formar ms de un tipo de cuerpos de inclusin. Cada variedad de Bt puede tener un nmero variable de plsmidos responsables de la sntesis de diferentes d-endotoxinas. Estos plsmidos portan varios genes de toxina (genes cry), a veces idnticos. Adems, Bt puede tener diferentes transposones que contribuyen a aumentar la diversidad gentica de estas toxinas. Las diferentes variedades de Bt pueden intercambiar fcilmente sus plsmidos mediante un proceso semejante a la conjugacin, fenmeno que ha sido demostrado en el intestino de larvas de mosquito. De este modo, las variedades de Bt pueden tambin intercambiar plasmidos que contienen genes de dendotoxina (los genes cry), y as aumentar su espectro de accin contra ms especies de insectos.

 APLICACIONES DE B.thuringiensis

Existen desde hace tiempo numerosos productos a base de B.thuringiensis con actividad insecticida. Dependiendo de la variedad o variedades de Bt que contenga, el producto actuar contra un rango determinado de insectos. Estos productos son utilizados en agricultura mayoritariamente, aunque tambin se han utilizado como insecticida contra plagas que provocan enfermedades a humanos o a animales de inters para nosotros (como por ejemplo, contra larvas de mosquito). Estos productos se componen de los cristales de d-endotoxina y de las esporas de la variedad de Bt seleccionada. Se consiguen a partir de la esporulacin masiva de Bt en un tanque fermentador, donde posteriormente se recupera el producto por sedimentacin- centrifugacin y se deja secar por el mtodo spraydrying hasta que se forma un polvo muy fino, el cual constituye el producto acabado. Existen muchos tipos diferentes de formulaciones (polvos, lquido, spray...) que se aplican segn las necesidades de la zona de aplicacin. El problema que tienen estas preparaciones en agricultura es que no se pueden aplicar en la zona de la raiz, ni en todas las zonas de la planta. Es por esto que se estn comercializando plantas transgnicas con el gen de la d-endotoxina insertado en su genoma, para que sea la misma planta la que lo exprese, y as conseguir actividad insecticida en todas las zonas de la planta, incluso en la raz. Adems, slo los insectos que atacan a la planta estn expuestos a las toxinas de Bt, y por tanto no hay riesgo para otro tipo de insectos. El problema que tienen estas plantas es que los insectos diana estn expuestos constantemente a las toxinas, y esto crea una presin de seleccin muy fuerte para el desarrollo de resistencias estas toxinas.
MODO DE ACCIN DE LAS d-ENDOTOXINAS DE B.thuringiensis

El primer paso del ciclo de infeccin a partir de la ingestin del cristal parasporal de B.thuringiensis (Bt) es la solubilizacin de las protenas de los cristales en el ambiente alcalino (pH de 7,5-8) del intestino del insecto en protenas de 130-140 KDa. La eficiencia de la solubilizacin del cristal proteico depende del ambiente del intestino del insecto y de la composicin del cristal. En un segundo paso, se da una protelisis de la protena por las proteasas del intestino, dando lugar a la toxina propiamente dicha, de 60-65 KDa. Esta protena activada difunde a travs de la membrana peritrfica, que es impermeable a las protoxinas de 130-140 KDa, as que acta como un filtro molecular. En el tercer paso, la toxina se une a receptores especficos localizados en el intestino medio del insecto. Esto provoca la formacin de poros conductores de cationes de 10-20A de dimetro y la destruccin consecuente de los gradientes de iones. Como consecuencia, un flujo de agua acompaa a la entrada de iones a la clula, sta se infla y lisa. La ausencia de regulacin inica causa tambin una parlisis en los msculos del intestino y de partes de la boca, con lo que la larva para de comer y finalmente muere.

Los poros creados, adems, permiten que las clulas vegetativas de B.thuringiensis germinadas a partir de las esporas migren a la hemolinfa y promuevan el proceso de intoxicacin por bacteremia. D-ENDOTOXINAS Las d-endotoxinas, que son las responsables de la actividad insecticida de los productos de B.thuringiensis, estn codificadas por diferentes tipos de genes, denominados cry, que por lo general estn dentro de plsmidos. Estos genes se dividen en varias clases en base a su similitud en la secuencia nucleotdica y en el espectro insecticida de la protena que codifican, ya que el patotipo de una determinada cepa de Bt es el reflejo de gen o genes que expresa. FORMA CRISTAL cryI Lepidpteros Bipiramidal cry II Lepidpteros y dpteros Cuboidal cry III Colepteros Irregular cry IV Dpteros Bipiramidal cry V-IX Variada Variada GEN ESPECIFICIDAD DEL MEDIDA DE PROTEINA 130 - 138 kDa 69 - 71 kDa 73 - 74 kDa 73 - 134 kDa 35 - 129 kDa LA

Estas protenas se subdividen en subclases (A, B, C,...) y en subgrupos (a, b, c,...) en relacin a la secuencia de DNA del gen txico. Los genes cry son exclusivos de B. thuringiensis. Para ilustrar este hecho, a partir de una secuencia de un gen cry IB he efectuado una bsqueda por similitud en el EBI en formato BLAST, y efectivamente, todas las secuencias semejantes proceden de B. thuringiensis y todas las secuencias corresponden a genes de dendotoxinas, y tienen una alta similitud entre ellas, por lo que se deduce que la especificidad de una d-endotoxina determinada depende solamente de unos pocos nucletidos. Puede haber ms de un gen txico en un mismo plsmido, y tambin puede haber hasta 5 o 6 plsmidos en una misma variedad de Bt. Los plsmidos pueden ser intercambiados entre diferentes variedades de Bt mediante un proceso semejante a la conjugacin, por lo que hay una amplia variedad potencial de socas con diferentes combinaciones de d-endotoxina. Adems, Bt contiene transposones que hacen aumentar la variedad de toxinas producidas de forma natural por las diferentes socas de Bt. todas estas caractersticas de Bt son la base que utilizan las compaas comerciales para crear socas por ingeniera gentica, y as roducir nuevas combinaciones de toxinas para minimizar el riesgo de resistencia de los insectos y/o aumentar el espectro de accin. Adems de los genes cry, B.thuringiensis var. Israelensis tiene un gen, llamado cyt, que tambin codifica para una protena txica citoltica, pero afecta a

una gran variedad de clulas de vertebrados e invertebrados y no est relacionada con el producto de los genescry. DOMINIOS DE LA PROTEINA DE d-ENDOTOXINA Esta protena tiene 3 dominios: Dominio I (N-ter, 220 residuos): Es el dominio formador del canal. Es un complejo de 7 hlices, donde una de ellas (la hlice 5) est rodeada por las otras 6. Las 6 hlices son anfipticas y suficientemente largas para atravesar la bicapa lipdica de la membrana de la clula del intestino medio del insecto. Dominio II (central, 200 residuos): Es el dominio que determina la especificidad, mediante la unin con el receptor de membrana de las clulas del intestino medio. Dominio III (C-ter, 150 residuos): Est menos definida funcionalmente, pero se piensa que transduce informacin desde el dominio II (de unin al receptor) hasta el dominio I (dominio de formacin del canal). Adems, parece que regula la actividad del canal, estabiliza la toxina y funciona junto al dominio iI en la formacin del canal.