qPENGENDAPAN PROTEIN PLASMA LAPORAN PRAKTIKUM BIOFARMASETIKA DAN FARMAKOKINETIKA - FAUZIAH UTAMI - MUCHAMMAD IRSYAD - MAULIDA PUTRI AHDAINI

- NOVAYANTI - WARDA NABIELLA FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1/1/2011

I.

TUJUAN PERCOBAAN

- Mahasiswa dapat mengetahui berbagai metode denaturasi protein II. LANDASAN TEORI Darah bukan merupakan cairan sederhana, dan terdiri dari milyaran selsel hidup yang mengambang dalam cairan yang disebut plasma. Jika sampel darah dituang ke dalam tabung reaksi, lalu disentrifuga (dipusingkan) dengan kecepatan tinggi, maka komponen-komponen penyusun darah itu akan terpisah ke dalam lapisan-lapisan. Komponen lebih berat (bagian padat seperti sel-sel darah) didorong ke dasar tabung. Sementara yang lebih ringan seperti plasma terapung di lapisan atas.

Plasma darah merupakan campuran protein-protein kompleks. Cairan darah ini mengandung berbagai spesies molekul dalam bentuk gikoprotein, isoenzim, dan polimer. Selain itu, plasma juga mengandung protein laten (zimogen atau bentuk enzim tidak aktif), protein aktif, dan protein yang telah didegradasi atau dimodifikasi yang siap disingkirkan dari aliran darah. Beberapa contoh protein plasma adalah serum albumin , transferrin, immunoglobulin G, immunoglobulin M, makroglobulin, lipoprotein, protein pengikat retinol, dan lisozim. Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat protein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu

dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga potein dapat mengendap. Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifa lain yang berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen. Salah satu pelarut oranik yang digunakan untuk mengendapkan protein yaitu TCA (Tri Cloro Asetat). Mekanisme TCA 10 % sebagai agen presipitasi atau agen pengendapan yakni ion negatif dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk memisahkan protein dari larutan. Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa (membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein). TCA umumnya digunakan untuk protein-protein yang telah berada dalam keadaan bebas pada filtrat darah dan pada pemeriksaan awal materi biologis. Bila protein belum berada dalam kondisi yang bebas maka perlu penambahan asam tanin, dimana tanin akan bereaksi dengan protein kulit membentuk protein tanat yang tidak larut.

Metanol dan Asetonitril juga merupakan pelarut organik yang dapat mengendapkan protein. Pengendapan ini berkaitan dengan pI protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan organik seperti metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya

pengendapan. Pada hasil percobaan diperoleh bahwa keefektifan pelarut organik asetonitril lebih besar dibandingkan dengan metanol. Ekstraksi cair-cair merupakan salah satu metode untuk melakukan pengendapan protein, Proses ini digunakan secara teknis dalam skala besar misalnya untuk memperoleh vitamin, antibiotika, bahan-bahan penyedap, produk-produk minyak bumi dan garam-garam. logam. Proses inipun digunakan untuk membersihkan air limbah dan larutan ekstrak hasil ekstraksi padat cair. Ekstraksi cair-cair terutama digunakan, bila pemisahan campuran dengan cara destilasi tidak mungkin dilakukan (misalnya karena pembentukan aseotrop atau karena kepekaannya terhadap panas) atau tidak ekonomis. Seperti ekstraksi padat-cair, ekstraksi cair-cair selalu terdiri atas sedikitnya dua tahap, yaltu pencampuran secara intensif bahan

ekstraksi dengan pelarut, dan pemisahan kedua fasa cair itu sesempurna mungkin. Pada saat pencampuran terjadi perpindahan massa, yaitu ekstrak meninggalkan pelarut yang pertama (media pembawa) dan masuk ke dalam pelarut kedua (media ekstraksi). Sebagai syarat ekstraksi ini, bahan ekstraksi dan pelarut tidak saling melarut (atau hanya dalam daerah yang sempit). Agar terjadi perpindahan masa yang baik yang berarti performansi ekstraksi yang besar haruslah diusahakan agar terjadi bidang kontak yang seluas mungkin di antara kedua cairan tersebut. Untuk itu salah satu cairan distribusikan menjadi tetes-tetes kecil (misalnya dengan bantuan perkakas pengaduk). Tentu saja pendistribusian ini tidak boleh terlalu jauh, karena akan menyebabkan terbentuknya emulsi yang tidak dapat lagi atau sukar sekali dipisah. Turbulensi pada saat mencampur tidak perlu terlalu besar. Yang penting perbedaan konsentrasi sebagai gaya penggerak pada bidang batas tetap ada. Hal ini berarti bahwa bahan yang telah terlarutkan sedapat mungkin segera disingkirkan dari bidang batas. Pada saat pemisahan, cairan yang telah terdistribusi menjadi tetes-tetes hanis menyatu kembali menjadi sebuah fasa homogen dan berdasarkan perbedaan kerapatan yang cukup besar dapat dipisahkan dari cairan yang lain. Kecepatan Pembentukan fasa homogen ikut menentukan output sebuah Ekstraktor cair-cair. Kuantitas pemisahan persatuan waktu dalam hal ini semakin besar jika permukaan lapisan antar fasa di dalam alat semakin luas. Sama haInya seperti pada ekstraksi padat-cair, alat ekstraksi tak kontinu

dan kontinu yang akan dibahas berikut ini seringkali merupakan bagian dari suatu instalasi lengkap. Instalasi tersebut biasanya terdiri atas ekstraktor yang sebenarnya (dengan zone-zone pencampuran dan pemisahan) dan sebuah peralatan yang dihubungkan di belakangnya (misalnya alat penguap, kolom rektifikasi) untuk mengisolasi ekstrak atau memekatkan larutan ekstrak dan mengambil kembali pelarut. III. ALAT DAN BAHAN
ALAT

BAHAN

vortex

zat pengendap protein

sentrifus

asetonitril

rotari evaporator vakum

triclorasetat

spektometer UV-vis

IV.
-

CARA KERJA
Presipitasi Protein

Dipipet 100L plasma blanko kedalam tabung ependorf Ditambahkan zat pengendap protein yang tersedia dengan perbandingan yang sesuai : Metanol, TCA, Asetonitril Divortex selama 15 detik Disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 - 15.000 rpm Supernatan dan endpan yang diperoleh diamati serta dibangdingkan dengan berbagai zat pengendap protein yang digunakan Dipisahkan supernatn yang diperoleh Supernatan yang didapat di uji dengan menggunakan Spekrtometer UV-vis

Shargel L, Yu Andrew.B.C.1988. Biofarmasetia dan Farmakokinetika Terapan. Edisi Kedua. Surabaya : AirLangga University press. Smith RV and steward JT. Textbook of Biopharmaceutict Analysis. Philadelpia : Lea&Febriger, 1981