Rev Bras Clin Med.

So Paulo, 2010 nov-dez;8(6):531-7

ARTIGO DE REVISO

Esclerose lateral amiotrfica e o tratamento com clulas-tronco*

Amyotrophic lateral sclerosis and stem cells treatment
Sabrina Rodrigues Lima1, Karina Braga Gomes2
*Recebido da Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG.

RESUMO JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS: A esclerose lateral amiotrfica (ELA) uma doena neurodegenerativa que afeta os neurnios motores inferiores e superiores e que, frequentemente, encontra-se associada s alteraes bulbares e no trato piramidal. Apesar de existirem algumas variaes nas manifestaes clnicas, no padro de progresso da doena e na expectativa de vida aps o incio dos sintomas, o diagnstico realizado atravs de exame clnico e, muitas vezes, dado por excluso. Para o tratamento da ELA existe, at o momento, apenas um medicamento aprovado pelo FDA, o riluzol, sendo que outros frmacos so frequentemente associados terapia no intuito de amenizar os sintomas e melhorar a qualidade de vida do paciente. O objetivo deste estudo foi atualizar os conhecimentos referentes doena, bem como discutir os protocolos de tratamento com clulas-tronco mais recentes para ELA. CONTEDO: No sentido de se procurar um tratamento efetivo para a ELA, vrios pesquisadores vm utilizando clulas-tronco devido ao potencial destas de se diferenciarem em diferentes tipos de clulas nervosas in vivo e in vitro e que quando transplantadas no crebro, so capazes de sobreviver, migrar e integrar, apresentando uma funcionalidade ativa. Assim, foi realizado um levantamento dos principais estudos que avaliaram o uso das clulas-tronco como tratamento da ELA. CONCLUSO: Enquanto todas as indagaes sobre o uso das clulas-tronco no forem elucidadas; e no forem propostas terapias que garantam a sua eficcia e segurana para os pacientes,

novas pesquisas ainda so necessrias a fim de utilizar a terapia celular como alternativa de tratamento da ELA. Descritores: Clulas-tronco, Esclerose lateral amiotrfica, Tratamento. SUMMARY BACKGROUND AND OBJECTIVES: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease which affects upper and lower motor neurons and is frequently associated to alterations in bulbar and pyramidal tract. Although there are variations on clinical manifestations, on disease progression and life expectation after the first symptoms, diagnosis is usually made by clinical evaluation and exclusion. At the moment there is only one medicament approved by FDA, riluzole, which is frequently associated with others to decrease symptoms and improve patients life quality. The present revision has the objective to bring up to date the knowledge about the ALS, as well discuss the more recent stem cells protocols for ALS treatment. CONTENTS: As a tentative to find an effective treatment for ALS many researches are using stem cells due their capacities to differentiate in many neuronal cell types in vivo and in vitro and when transplanted into the brain, these cells are capable of survive, migrate and integrate showing a functional activity. The present work shows the main studies that had evaluated the use of the stem cells as treatment of ALS. CONCLUSION: While all the investigations about the stem cells use arent elucidated and there arent proposals therapies that guarantee the effectiveness and patients security, new research are still necessary in order to use the cellular therapy as alternative of treatment of ELA. Keywords: Amyotrophic lateral sclerosis, Stem cells, Treatment. INTRODUO A esclerose lateral amiotrfica (ELA), tambm conhecida como doena de Charcot ou doena de Lou Gehring, e pertencente ao grupo das doenas do neurnio motor, caracterizada pela progressiva degenerao dos neurnios motor superior (NMS) e inferior (NMI), geralmente associada ao envolvimento bulbar e do trato piramidal. Os neurnios motores so responsveis pelo controle e comunicao entre o sistema nervoso e os msculos voluntrios, ao transmitirem mensagens dos neurnios localizados no crebro (NMS) para os neurnios na medula espinhal (NMI), e destes aos msculos do controle voluntrio. Assim, os sinais clnicos da ELA so evidenciados nos membros inferiores, superiores e, posteriormente, nas demais regies do trax e pescoo1,2.
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1. Farmacutica Industrial do Centro Universitrio Newton Paiva; Especialista em Biotecnologia da Faculdade de Sade Ibituruna; Ps-Graduanda da Faculdade de Sade Ibituruna. Montes Claros, MG, Brasil 2. Farmacutica-Bioqumica da Universidade Federal de Minas Gerais; Doutorado em Cincias Farmacuticas da Universidade Federal de Minas Gerais; Professora da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG, Brasil Apresentado em 04 de maro de 2010 Aceito para publicao em 08 de setembro de 2010 Endereo para correspondncia: Dra. Karina Braga Gomes Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais Av. Antnio Carlos, 6627 Pampulha 31270-901 Belo Horizonte, MG. Fone/Fax: 55 (31) 3409-6895 E-mail: karina@coltec.ufmg.br Sociedade Brasileira de Clnica Mdica

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Os sinais clnicos percebidos na ELA vo desde o envolvimento dos NMI (atrofia com posterior fraqueza muscular, hiporreflexia, cimbras musculares e fasciculaes), ao envolvimento dos NMS (espasticidade, hiperreflexia, clnus e sinais de Hoffmann ou Babinski), e dos sinais bulbares (fraqueza na musculatura facial e do pescoo, disartria, disfagia e sialorria). Estes sintomas culminam com o comprometimento do diafragma, acarretando dificuldade respiratria com consequente dependncia crnica da ventilao, ou morte por parada respiratria. Os reflexos abdominais, o controle de esfncter, o intelecto e os sentidos, na grande maioria dos casos, esto preservados1,3. Segundo Andrews4, apesar das manifestaes clnicas, do padro de progresso da doena e da expectativa de vida aps o diagnstico variar de pessoa para pessoa, aproximadamente 50% dos pacientes sobrevivem por pouco mais de dois anos aps o incio dos sintomas e menos de 10% sobrevivem mais de 10 anos. O diagnstico da ELA realizado atravs de exame clnico suportado por testes neurofisiolgicos, no existindo testes laboratoriais de definio, o que acarreta muitas vezes em um diagnstico por excluso. O critrio El Escorial, desenvolvido no final da dcada de 1980 e atualizado na dcada seguinte, amplamente utilizado, apesar de ter suas limitaes e de permitir que alguns pacientes venham a falecer da doena sem se qualificar nos critrios5. A classificao de certeza do diagnstico pelo El Escorial dividida em: ELA tpica (sinais de acometimento de NMI e NMS em trs ou mais regies: bulbar, cervical, torcica ou lombossacral); ELA provvel (sinais de acometimento de NMI e NMS em duas regies); ELA provvel com evidncias neurofisiolgicas (NMI e NMS em uma regio; ou NMS em uma regio ou mais regies com evidncia eletromiogrfica de desenervao em dois ou mais membros); ELA possvel (sinais de acometimento de NMI e NMS em uma regio); ELA suspeita (sinais de acometimento de somente NMI em uma ou mais regies; ou somente NMS em uma ou mais regies)4,5. Com relao epidemiologia da doena, a ELA apresenta variaes na sia, na Europa e nas Amricas do Norte e do Sul. Segundo Palermo, Lima e Alvarenga6, a taxa de incidncia varia de 0,3:100.000 habitantes/ano na China at 3,9:100.000/ano na Ilha de Guam e na pennsula de Kii no Japo. J a prevalncia de aproximadamente 2,5:100.000 habitantes para os pases analisados, exceto no sul do Japo (pennsulas de Kii e Honshu) que apresenta uma mdia de 150:100.000 habitantes. A maior prevalncia encontra-se entre os homens. Os sintomas geralmente iniciam-se com fraqueza muscular assimtrica e a idade mdia do incio dos sintomas varia de 52 anos no Brasil, 59 a 65 anos

nos pases da Europa e acima de 65 anos na Amrica do Norte6. A ELA pode ser classificada de vrias maneiras: quanto aos primeiros sinais clnicos apresentados; quanto idade de incio dos sintomas; quanto variabilidade gentica; quanto ao tempo de progresso; e a mais usual, pelo modo de herana (familiar, espordica e Guam)7. Vrios genes j foram descritos at ento associados a ELA. A ELA familiar representa entre 5% e 10% dos casos e pode ser classificada segundo o modo de herana: autossmica dominante, autossmica recessiva e ligada ao X dominante. O enquadramento neste tipo de ELA deve-se ao fato do paciente apresentar, pelo menos, uma pessoa afetada na famlia. A grande maioria dos casos est relacionada s formas dominantes e ocorrncia em adultos, conforme pode ser observado na tabela 1. Segundo Dellefave e Siddique3, a forma familiar ligada ao X foi descrita em apenas uma famlia na qual somente as mulheres eram afetadas e no havia evidncias de transmisso aos homens. A ELA espordica representa entre 90% e 95% dos casos, ocorrendo em indivduos que no apresentam histria familiar de ELA. Os fatores envolvidos nas ELA espordicas no foram, at o momento, elucidados embora, segundo Schymick, Talbot e Traynor8, dados familiares e epidemiolgicos indicam que fatores genticos contribuem para a patogenicidade. Alm disso, mutaes ou polimorfismos nos genes envolvidos nas formas familiais, aliados ao componente ambiental, podem atuar como fatores de predisposio, o que caracteriza a doena como complexa e multifatorial8,9. Mutaes no gene SOD1 (ALS1) so responsveis por 20% da ELA familiar e 2% ou mais da ELA espordica, sugerindo, neste ltimo caso uma penetrncia incompleta ou a ocorrncia mutao de novo ou ambas. Entretanto, um estudo apresentado por Vivekananda e col.10 demonstrou que a idade dos genitores no apresenta relao com o aparecimento da ELA espordica e que mutaes espontneas no so os provveis mecanismos, mas que existe um significativo componente ambiental, delees em vrios genes ou combinaes de polimorfismos relativamente comuns 2,10. A ELA de Guam recebe este nome devido sua localizao (ilha de Guam) e as demais particularidades que a tangem, e apresenta-se associada doena de Parkinson e demncia, ocorrendo a sobreposio de sintomas destas doenas na mesma famlia e, muitas vezes, no mesmo indivduo. Embora suas causas ainda no tenham sido elucidadas, observa-se uma diminuio dos casos na populao desde a sua descrio na dcada de 1940, quando a incidncia chegava a ser 50 vezes maior que em outros lugares no mundo 11.

Tabela 1 - Gentica molecular para as formas autossmicas dominante e recessiva de esclerose lateral amiotrfica (ELA) 3. Tipo (locus) ALS1 ALS2 ALS3 ALS4 ALS5 ALS6 ALS7 ALS8 Cromossomo 21q22.1 2q33 18q21 9q34 15q15.1-q21.1 16q12 20ptel 20q13.3 Modo de Herana Dominante (Adulto) Recessiva (Juvenil) Dominante (Adulto) Dominante (Juvenil) Recessiva (Adulto) Dominante (Adulto) Dominante (Adulto) Dominante (Adulto) % Pacientes com ELA Familiar 20% Rara Rara Rara Rara Rara Rara Rara

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Os fatores desencadeantes da fisiopatologia da ELA so desconhecidos, mas algumas hipteses tentam explicar a ocorrncia da doena, como: excitotoxicidade pelo glutamato, estresse oxidativo, acmulo de protenas e estrangulamento axonal9,12,13. Atualmente, h apenas um medicamento aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da ELA, o riluzol, um benzodiazol com efeito bloqueador na neurotransmisso glutamatrgica que diminui a leso aos neurnios motores. Estudos clnicos controlados demonstraram a eficcia em reduzir a progresso da doena e aumentar a sobrevida dos pacientes de 3 a 6 meses, especialmente nos estgios iniciais e nos pacientes com ELA com sinais iniciais bulbares14. Estudo conduzido por Zoccolella e col.15 demonstrou que o riluzol aumenta a sobrevida dos pacientes em, no mnimo, 4 meses e que aps 18 meses este frmaco no possui ao, o que possivelmente pode estar relacionado ao fato de que nos estgios finais da doena o aumento de glutamato torna-se maior e incapacita o seu bloqueio. So comumente includas no tratamento outras substncias, como neuroprotetores e antioxidantes, com o intuito de amenizar os sintomas, e que, associados ao tratamento multidisciplinar, visam melhorar a qualidade de vida do paciente, como a fisioterapia, que pode ser til para manter o tnus muscular e prevenir contraturas. Geralmente, os indivduos apresentam dificuldade de deglutio e devem ser alimentados com extremo cuidado para evitar engasgos, sendo que um tubo de gastrostomia muitas vezes indicado, principalmente nos estgios mais avanados da doena, assim como a utilizao de ventilao assistida1,3. As similaridades clnicas e patolgicas entre a ELA familiar e a espordica sugerem uma patognese em comum. Entretanto, a ausncia de um marcador biolgico comum a todos os tipos de ELA e a ausncia de caractersticas neuroradiolgicas ou neurofisiolgicas especficas algumas vezes torna difcil o diagnstico e, neste sentido, alguns estudos tm sido conduzidos com o intuito de entender os mecanismos que desencadeiam a degenerao seletiva dos neurnios motores na ELA e desenvolver terapias que retardem a sua progresso16,17. Na busca de um tratamento para ELA, alguns pesquisadores tm estudado a utilizao de clulas-tronco que podero atuar, hipoteticamente, na induo da diferenciao em NMI, visando substituir aqueles neurnios danificados pela doena; no resgate dos neurnios motores afetados, reconectando-os parte desenervada do msculo; na induo da diferenciao em NMS no crtex cerebral; na induo diferenciao de clulas-tronco em clulas da glia (astrcitos ou oligodendrcitos), as quais produzem fatores de suporte para os neurnios motores18. O objetivo deste estudo foi atualizar os conhecimentos referentes doena, bem como discutir os protocolos de tratamento testados, utilizando clulas-tronco. CLULAS-TRONCO As clulas-tronco so consideradas primordiais de uma cadeia de processos altamente regulados que inclui: proliferao celular, migrao, diferenciao e maturao, importantes fatores na manuteno da maioria das linhagens celulares de um organismo adulto, alm de originarem diferentes clulas progenitoras19,20. Em relao ao potencial de diferenciao, as clulas-tronco poRev Bras Clin Med. So Paulo, 2010 nov-dez;8(6):531-7

dem ser: totipotentes, pluripotentes, multipotentes ou unipotentes. As totipotentes podem originar todos os tecidos embrionrios e extra-embrionrios; as pluripotentes podem originar todos os tipos celulares do embrio propriamente dito; as multipotentes podem originar vrias linhagens celulares e as unipotentes somente originam um nico tipo celular adulto21. As clulas-tronco embrionrias so clulas pluripotentes derivadas da massa celular interna do blastocisto do embrio de mamferos e podem se diferenciar nas trs camadas germinativas: ectoderme, mesoderme e endoderme21. As clulas-tronco somticas so isoladas de clulas fetais, aps gastrulao, ou de tecidos adultos, sendo encontradas em rgos onde necessria uma auto-renovao controlada. Esse tipo de clula-tronco geralmente limitado a se diferenciar em somente alguns tipos de clulas. A medula ssea uma das fontes mais comumente utilizadas para a obteno de clulas-tronco adulta, pois contm no somente clulas-tronco hematopoiticas, mas tambm clulas-tronco que podem ser o esboo das clulas mesenquemais. A multipotencialidade das clulas-tronco mesenquemais, seu fcil isolamento e cultura, assim como seu alto potencial de expanso ex vivo, fazem destas clulas uma ferramenta teraputica atrativa capaz de desempenhar diversas aplicaes clnicas em um contexto, tanto de terapia celular quanto gentica19. A diferenciao das clulas-tronco em clulas adultas no organismo humano rigorosamente controlada, devendo ser ativada ou desativada atravs de expresso gnica, a fim de obter as propriedades dos tecidos em diferentes estgios evolutivos. Na diferenciao das clulas progenitoras neuronais esse controle ainda maior, uma vez que a efetiva funo neural depende de vnculos precisos e interaes entre diferentes neurnios individuais e classes de clulas nervosas22. REGENERAO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Uma das maiores razes de leso no sistema nervoso central (SNC) so as doenas neurodegenerativas, que interrompem funes fisiolgicas importantes e, por isso, a leso e a reparao do SNC tm sido a chave da pesquisa neurobiolgica. A maioria das doenas neurodegenerativas desenvolve-se em idades mais avanadas, de progresso lenta e de difcil diagnstico, e no possui terapia efetiva20. Recentemente, as clulas-tronco tm se mostrado eficazes no tratamento de modelos animais com doenas neurodegenerativas. Esse tipo de clula um modelo ideal para o estudo da gerao embrionria, diferenciao celular, expresso gnica e regulao. Com o desenvolvimento da engenharia de clulas-tronco, a terapia de reparao tecidual ser um novo caminho para o tratamento de defeitos genticos ou de doenas degenerativas1,6. Estudos do potencial neurognico das clulas-tronco tm sido direcionados para as clulas progenitoras neuronais, derivadas do tecido nervoso embrionrio ou adulto, para as clulas progenitoras no neuronais, derivadas de outros tecidos e rgos, e para as clulas-tronco embrionrias, que possuem a capacidade de gerar neurnios e outras clulas da glia21. As clulas neuronais progenitoras, encontradas nos embries, esto tambm presentes em adultos nos ventrculos cerebrais, nos
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quais elas estabelecem ligao com o aprendizado e a memria recente atravs de suas divises, diferenciaes, migraes e inseres nos novos circuitos20. Muitos protocolos tm permitido o isolamento e a expanso das clulas-tronco neuronais humanas. Entretanto, uma efetiva terapia com clulas-tronco para ELA exige estratgias complexas, com muitas tcnicas moleculares e celulares, principalmente se levar em considerao o comprimento dos axnios dos neurnios motores e da crescente evidncia de que a neurodegenerao na ELA pode ser mediada pela influncia de outras clulas neuronais e da glia4,23,24. O primeiro passo para o desenvolvimento destas tcnicas seria a avaliao da fonte doadora da clula (autloga versus alognica) e a escolha da clula-tronco (neuronal versus no neuronal), seguido da manuteno e amplificao in vitro sem alterar suas propriedades. Antes do transplante, as clulas-tronco devem ser transdiferenciadas (se no neuronais) em fentipos neuronais, e eventualmente modificadas geneticamente para liberar fatores trpicos. As condies adequadas seriam uma combinao de frmacos, protenas extramatriz artificiais, antioxidantes, estimulantes de clulas-tronco endgenas e infuso de fatores trficos que iro aumentar a sobrevivncia do tecido transplantado e a integrao ao tecido danificado do hospedeiro. Os locais ou a rota da(s) injeo(es) tambm influenciaro a recuperao e o sucesso ps-transplante23. TERAPUTICA PARA ESCLEROSE LATERAL AMIOTRFICA O conhecimento sobre a patognese da ELA tem sido obtido, na maioria das vezes, a partir de modelos animais com a forma familiar, e este conhecimento tem permitido desenvolver modelos celulares in vitro para a forma espordica e estudar as propriedades de sobrevivncia destas clulas, sua interao com outros tipos celulares e a suscetibilidade em condies ambientais, que so alguns dos fatores envolvidos na patognese da doena1,4. As clulas-tronco podem resultar no desenvolvimento de novos tratamentos para retardar a progresso da ELA, visto que estudos da sua utilizao em doenas neurodegenerativas (como Parkinson, Alzheimer e Huntington) tm obtido bons resultados, apesar de ainda se encontrarem nas fases iniciais e necessitarem de muitos ajustes25. A utilizao de clulas-tronco embrionrias, as quais embora possuam um potencial ilimitado para se diferenciarem em fentipos neuroectodermais, tem se mostrado aleatria in vitro, originando teratomas e rejeio imunolgica depois de transplantadas20. Em contrapartida, as clulas-tronco neuronais tm se mostrado capazes de se diferenciar em diferentes tipos de clulas nervosas in vivo e in vitro e, quando transplantadas, foram capazes de sobreviver, migrar e integrar, tendo uma funcionalidade ativa. Entretanto, as clulas-tronco isoladas de crebro adulto geram menos neurnios quando comparadas quelas isoladas do crebro embrionrio ou fetal, tanto em casos de transplante como na diferenciao in vitro1. O transplante de clulas hematopoiticas da medula ssea de camundongos ou de clulas-tronco do cordo umbilical tem sido utilizado em camundongos SOD1-G93A, aumentando a expectativa de vida destes animais, provavelmente devido mais a um
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fator neuroprotetor do que a uma neurognese18. O camundongo SOD1-G93 exibe uma progressiva degenerao dos NMI, diminuio do andar e perda de fora muscular, sendo que a morte ocorre aps 4 a 5 meses de idade. um modelo conveniente, no somente para o entendimento da ELA, mas tambm para o desenvolvimento de novas estratgias teraputicas. Entretanto, a expresso gnica alterada neste modelo animal tem como fundamento o descrito para a ALS1 (Tabela 1) e no reproduz todas as peculiaridades da ELA, particularmente o envolvimento bulbar25. Di Giorgio e col.26 propem o uso de clulas-tronco embrionrias para o estudo de doenas e a identificao de potenciais terapias, devido ao grande nmero de clulas que podem ser obtidas e diferenciadas a partir deste tipo de clula. Eles demonstraram, atravs da utilizao de clulas-tronco embrionrias em placas, que os NMI so sensveis aos efeitos txicos produzidos pela mutao no gene SOD1 de clulas da glia. J Zhou e Melton27 sugeriram que a obteno de clulas-tronco pluripotentes a partir de clulas de mamferos reprogramadas que iriam se diferenciar e originar outros tipos celulares, como qualquer outra clula-tronco pluripotente, como por exemplo, clulas da glia, poderiam ser convertidas em neurnios motores. O processo de reprogramao atravs de alteraes genticas para que a clula retorne ao seu estado pluripotente pode ter consequncias imprevisveis e necessita de maiores estudos tericos e laboratoriais antes de serem testados clinicamente, seja em animais ou em seres humanos. Todavia, o sucesso deste tipo de procedimento possibilitaria muitos ganhos no s para a teraputica da ELA, como para vrias outras doenas e distrbios27. Estudo recente demonstrou que fibroblastos da pele de humanos foram reprogramados para um estado pluripotente similar s clulas-tronco embrionrias, e que estas clulas induzidas, retiradas de um paciente com ELA familiar, foram diferenciadas em neurnios motores4. A induo diferenciao de clulas-tronco embrionrias de camundongos em clulas colinrgicas do neurnio motor foi realizada por Briscoe e col.28, atravs da expresso da protena Hb9, uma protena homeodomnio expressa seletivamente e presente em clulas somticas que identifica neurnios motores ps-mitticos. Estas clulas-tronco embrionrias, derivadas de neurnios motores, so capazes de preencher a medula espinhal do embrio, alargar axnios, e realizar sinapses com msculos alvo28. Em outro estudo, Yan e col.29 enxertaram clulas-tronco neuronais oriundas da medula espinhal de embries humanos na poro lombar da coluna vertebral de camundongos SOD1-G93A imunossuprimidos com diferentes frmacos isolados ou em combinaes. Os resultados indicaram que a imunossupresso combinada possibilita a sobrevivncia das clulas-tronco enxertadas na medula espinhal, permitindo assim a diferenciao das clulas-tronco neuronais em neurnios motores, acarretando em melhora clnica. Com relao utilizao de clulas-tronco adultas, segundo Bossolasco e col.24, a migrao e a diferenciao de clulas-tronco da medula ssea em neurnios e em astrcitos fenotipicamente compatveis foi comprovada quando Lee e col.30 administraram uma infuso de clulas-tronco mesenquimais humanas no crebro de ratos e essas proliferaram, migraram e sobreviveram
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similarmente aos astrcitos do camundongo, indicando que as clulas-tronco mesenquimais possuem um alto potencial de proliferao no microambiente do hospedeiro. Mazzini e col.31 utilizaram clulas-tronco mesenquimais da medula ssea, isoladas e expandidas in vivo, re-suspendidas em lquido crebroespinhal e transplantaram diretamente na coluna vertebral entre T7 e T9 em sete pacientes com ELA. Nenhum paciente apresentou falha respiratria e morte. Contudo, alguns apresentaram reversivelmente, dor intercostal e disestesia sensorial na perna. No houve alterao do volume da medula espinhal e nem proliferao celular anormal. A diminuio da capacidade linear da fora vital foi significativamente desacelerada em quatro pacientes, 36 meses aps transplante. Dimos e col.32 relataram procedimento no qual os pacientes com ELA receberam uma injeo com clulas-tronco autlogas mesenquimais da medula-ssea diretamente no lquido espinhal. Este procedimento mostrou ser seguro, mas difcil de monitorar o caminho seguido pelas clulas e a sobrevida destas, alm de no ter sido evidenciada melhora significativa no quadro da doena. Para avaliar o potencial de clulas-tronco derivadas da medula ssea em modificar o fentipo da ELA, Corti e col.33, utilizaram um camundongo quimrico, obtido a partir do camundongo SOD1-G93A, transplantado com clulas da medula ssea de camundongos expressando protena fluorescente verde (GFP) e neurnios provenientes de uma variante de camundongo (Thy1-YFP) que expressa protena fluorescente amarela. No crtex cerebral foram observados neurnios GFP+ e YFP+, os quais foram provavelmente gerados pela fuso celular. Clulas da microglia GFP+ foram observadas no crebro e na medula espinhal dos animais SOD1-G93A. Os animais quimricos apresentaram uma significante reduo no aparecimento dos sintomas e aumento na expectativa de vida. Os benefcios obtidos foram caracterizados como sendo devido mudana ambiental provocada pelo transplante das clulas da medula ssea no SNC, com a gerao da microglia e a formao de neurnios, o que proporcionou uma melhora fenotpica nestes animais. A organizao, distribuio e funo das clulas neuronais progenitoras na coluna vertebral durante a degenerao dos neurnios motores na ELA permanece desconhecida. Na tentativa de elucidar este fato, Chi e col.34 utilizaram duas linhagens de camundongos transgnicos, a linhagem usualmente utilizada para a ELA (SOD1-G93A) e outra que possua o promotor do gene nestin controlado pelo reprter LacZ, criando desta forma um duplo transgnico. A expresso de nestin no SNC geralmente considerada como um marcador confivel de clulas neuronais progenitoras e tem sido bastante utilizada para a caracterizao desse tipo de clula in vivo e in vitro. O estudo demonstrou haver, no duplo transgnico, aumento na proliferao das clulas- tronco neurognicas, migrao e neurognese (mas no astrognese, oligognese ou microgliagnese) na regio lombar da coluna vertebral em resposta degenerao. Esta proliferao, detectada atravs de um marcador do LacZ, foi restrita zona ependimal ao redor do canal central. No entanto, externamente a este canal, houve perda da capacidade proliferativa, mas a capacidade migratria das clulas-tronco neurognicas foi mantida. Durante a progresso da ELA, estas clulas migraram inicialmente do canal central em direo ao corno dorsal e,
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em seguida, ao corno ventral, onde os neurnios motores esto se degenerando. Foram detectadas, tambm, clulas neuronais progenitoras ao redor dos neurnios motores que estavam se degenerando, sugerindo que alguns fatores da degenerao podem induzir migrao e diferenciao de clulas neuronais progenitoras. Alm disso, estes fatores podem contribuir para retardar ou prevenir o aparecimento dos sintomas e reduzir a progresso da doena34. Em outro estudo, Corti e col.18 testaram um tratamento para alterar a progresso da ELA a partir da estimulao in vitro de uma subpopulao de clulas-tronco neuronais que foram transplantadas para a coluna vertebral de camundongos transgnicos SOD1-G93A. Os animais transplantados apresentaram uma diminuio na progresso da doena e sobreviveram aproximadamente 23 dias a mais que o grupo controle. Exames da coluna vertebral revelaram integrao das clulas transplantadas (marcadas radioativamente) com as clulas do hospedeiro, e a diferenciao de grande parte destas clulas em neurnios. Alguns estudos tm revelado que os astrcitos so deficientes na ELA e por isso o transplante de astrcitos derivados de clulas-tronco talvez possa trazer alguns benefcios. Para testar esta hiptese, Klein e col.35 transplantaram clulas-tronco neuronais para a coluna vertebral de camundongos selvagens e puderam observar que estas podiam sobreviver e produzir astrcitos, alm de liberarem fatores de crescimento, como o fator neurotrfico de clulas da glia (GNDF). Os astrcitos derivados de clulas-tronco neuronais humanas expressam alguns marcadores gliais imaturos como transportadores de glutamato e podem, por isso, permitir a entrada do excesso de glutamato, diminuindo a quantidade desse neurotransmissor na fenda sinptica e, conseqentemente, diminuindo a degenerao neuronal. Como o GNDF tem demonstrado eficincia em manter a sobrevivncia de neurnios motores em diversas condies, sua presena na coluna vertebral talvez proporcione efeitos protetores extensveis aos neurnios motores superiores e juno neuromuscular. Embora a administrao local de GNDF sozinha na coluna vertebral possa no ser suficiente para proteger os neurnios motores, a combinao com o transplante de astrcitos pode ser mais eficiente35. Avaliando ainda a importncia dos astrcitos na ELA, Marchetto e col.36 promoveram uma co-cultura envolvendo astrcitos que superexpressavam SOD1 e clulas-tronco embrionrias humanas. Estas ltimas foram induzidas diferenciao em rosetas neuronais e, posteriormente, maturadas em clulas eletrofisiologicamente funcionais, expressando marcadores tpicos de neurnios motores (como Hb9, ChAT, Islet). O meio de cultura foi suplementado com diversos compostos, dentre eles antioxidantes e flavonides. O objetivo do estudo foi testar os nveis de oxidao e a taxa de sobrevivncia dos neurnios motores em co-cultura com astrcitos mutados. O resultado obtido foi que a co-cultura proporcionou a sobrevivncia dos neurnios motores e manteve as taxas de oxidao em nveis normais e que, embora os astrcitos superexpressados possam induzir a produo de radicais livres do tipo oxignio e perxido de hidrognio, a adio de antioxidantes pode reverter esse processo, concluindo que a presena da enzima SOD1 importante para a manuteno do neurnio motor.
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Hou e Hong1 demonstraram que clulas-tronco neuronais humanas, derivadas de neurnios motores, transplantadas para a medula espinhal lesionada de macacos, poderiam sobreviver e se diferenciar em neurnios, astrcitos e oligodendrcitos e promover a recuperao funcional do animal. Uma das hipteses sustentadas de que estas clulas-tronco neuronais substituiriam os NMI danificados na ELA. Embora alguns trabalhos apontem para uma resposta clnica favorvel com o uso de clulas- tronco; Silani e col.23 desenvolveram um estudo no qual a administrao de uma injeo subaracnoidea de sangue perifrico purificado com clulas CD34+ em trs pacientes com ELA no mostrou eficcia clnica. No entanto, durante o acompanhamento, no perodo de 6 a 12 meses aps a administrao, nenhum efeito adverso foi observado, o que sugere segurana neste tipo de estudo clnico 25. Segundo Khaldoyanidi37, a regenerao promovida por clulas-tronco depende, em grande parte, do transporte destas clulas rea danificadae cita que a alterao na superfcie de clulas CD44 (que funcionam como molculas transportadoras para a medula ssea) promoveu eficiente interao adesiva das clulas-tronco mesenquimais manipuladas com vasos endoteliais e subseqentemente com a superfcie endotelial at a chegada medula ssea. Esse tipo de estratgia seria de grande importncia para a ELA na qual o local de administrao limitante para a terapia. Entretanto, este sistema baseado em uma entrega vascular sistmica do local administrado at o local afetado; necessita de um grande numero de clulas a serem administradas e depende de uma clula ou uma molcula que funcione como a CD44 descrita. Recentemente, Mitreci e col.38, com o intuito de fornecer informaes sobre o potencial da administrao intravenosa de clulas-tronco neuronais, observaram uma grande disponibilidade destas clulas no SNC de modelo animal com ELA sintomtica, moderada em ELA pr-sintomtica e menor em animais selvagens. As clulas-tronco injetadas preferencialmente colonizaram o crtex motor, o hipocampo e a medula espinhal, e sua diferenciao foi caracterizada por diminuio da expresso nestin e o aparecimento de clulas CD68 positivas. Gu e col.39 investigaram a influncia de fatores solveis, liberados por clulas-tronco provenientes de tecido adiposo, sobre a captao de glutamato em astrcitos cultivados de ratos SOD1 (G93A). Os resultados indicaram maior expresso do transportador de glutamato 1 (GLT1) cuja funo a de promover a captao do glutamato, alm da inibio da ativao de caspase-3. Alm disso, as clulas-tronco de tecido adiposo em co-cultura com astrcitos SOD1 produziram VEGF, HGF e IGF-1, os quais possuem efeitos neuroprotetores. Corroborando com estes achados, Corti e col.40 avaliaram o efeito da terapia celular utilizando a injeo por via venosa de uma populao especfica de clulas-tronco/progenitoras c-kit (+) da medula ssea no modelo animal SOD1-G93A. O transplante de clulas-tronco prolongou a sobrevida dos animais e promoveu a sobrevivncia dos neurnios motores e melhora da funo neuromuscular. Esta neuroproteo foi mediada em especial pelo aumento da expresso dos transportadores de glutamato GLT1. Estes resultados sugerem que o transplante de clulas-tronco pode tornar-se uma terapia eficaz para ELA e outras doenas neurodegenerativas.
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DISCUSSO Dada a falta de tratamentos eficazes para ELA, os estudos atualmente tm investigado o uso e aplicao das clulas-tronco como candidatas na terapia de escolha contra a doena. O transplante de clulas-tronco tem se mostrado eficaz em vrios modelos animais, mas os caminhos biolgicos subjacentes aos processos de reparao ainda no foram elucidados. Vrios mecanismos tais como a fuso celular, liberao do fator neurotrfico, proliferao de clulas-tronco endgenas e transdiferenciao, podem explicar resultados pr-clnicos teraputicos em modelos animais em adio reposio do neurnio motor perdido. O alvo clnico na ELA tem buscado ainda elucidar a interao entre neurnios motores e clulas no neuronais (principalmente astroglia ou microglia). De fato, uma das perguntas fundamentais sem resposta se, e quanto a morte do neurnio motor depende de clulas vizinhas41. A tica e o rigor cientfico nos estudos que utilizam as clulas-tronco devem ser meticulosos e apoiados por mdicos, cientistas e pacientes que participam destes estudos. Os efeitos adversos e a segurana na utilizao da terapia devem ser seriamente avaliados. Devem ser definidos os melhores critrios para a seleo dos pacientes e, antes da cirurgia, o procedimento de transplante deve ser personalizado, relacionando a dose e a localizao das clulas enxertadas ao paciente, de modo a que a reparao seja to completa quanto possvel. Deve-se tambm avaliar qual a fonte mais apropriada para a obteno das clulas-tronco que originaro as clulas desejadas, e se possvel, buscar fontes alternativas para a obteno de clulas-tronco. necessrio, ainda, avaliar minuciosamente os detalhes tcnicos, verificando melhor local para implantao, o tempo aps o diagnstico da doena e o nmero de clulas mais adequadas. O sucesso da terapia com clulas-tronco depender de uma investigao mais aprofundada na biologia dessas clulas e da maior compreenso da patognese da ELA23,42. Enquanto todas as indagaes a respeito das clulas-tronco no forem elucidadas, como a segurana aos pacientes e a eficcia, ou outras formas de tratamento sejam testadas, aprovadas e disponveis, imprescindvel a busca por uma teraputica adequada que possibilite aumentar a sobrevida e a qualidade de vida do paciente. Desta forma, novos estudos sobre o emprego das clulas-tronco no tratamento da ELA so necessrios, mas, com base nos dados da literatura, os resultados obtidos at ento sugerem que a terapia celular poder ser, num futuro prximo, a maior ferramenta de cura ou de melhoria da qualidade de vida dos pacientes com ELA. REFERNCIAS
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