Cintica Enzimtica.

Curso Tcnico de Qumica Industrial Bioqumica

Cintica Enzimtica

TURMA: QIM 261 PROFESSORA: Maisa COMPONENTES DO GRUPO: Daniel Eduardo Fernanda Leal Laercio Vitorino Quintino Junior Priscila Gonalves Renata Maria de Freitas Yasmin Guimares Pedro

NILPOLIS NVEMBRO DE 2010. Pgina 1 de 11

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Cintica Enzimtica INTRODUO Enzimas so protenas que catalisam uma reao qumica especfica e em sua maioria so conjugadas, estando associadas a grupos no-proticos. Sua atividade cataltica depende da conservao da sua estrutura original e qualquer variao nessa estrutura altera significativamente sua atividade. A reaco catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a mesma quantidade de produto que uma reao no catalisada. Tal como ocorre noutros tipos de catlise, as enzimas no alteram em absoluto o equilbrio da reaco entre substrato e produto.[1] Ao contrrio do que acontece noutras reaces qumicas, as enzimas saturam-se. Isto significa que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalticos estaro ocupados, o que incrementar a eficincia da reaco, at ao momento em que todos os stios possveis estejam ocupados. Nesse momento ter-se- alcanado o ponto de saturao da enzima e, embora se adicione mais substrato, no aumentar mais a eficincia. As duas propriedades cinticas mais importantes de uma enzima so: o tempo que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto mximo de saturao. O conhecimento destas propriedades torna possvel formular hipteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e prever como responder frente a mudanas nessas condies.

As reaes multisubstrato seguem uma srie de complexas equaes que descrevem como se unem os substratos e em que ordem o fazem. A anlises destas reaes muito mais simples se a concentrao do substrato A se mantiver constante e a do substrato B variar. Nestas condies, a enzima se comporta igual a uma enzima de nico substrato, pelo que num grfico de velocidade a concentrao do substrato dar um dos valores aparentes das constantes cinticas, Km e Vmax, para o substrato B. Se se realizarem uma srie de medidas a diferentes concentraes fixas de substrato A, os dados obtidos permitiro saber a que tipo de mecanismo pertence a reao enzimtica. Para uma enzima que una
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dois substratos A e B, e os transforme em dois produtos P e Q, existem dois tipos de mecanismos descritos.

Mecanismos de complexo ternrio

Mecanismo de complexo ternrio para uma reaco enzimtica. A enzima E une os substratos A e B e liberta os produtos P e Q em ordem no definida.

As enzimas (E) que apresentam este mecanismo de reaco unem ao mesmo tempo os dois substratos (A e B), dando lugar a um complexo ternrio EAB. A ordem sequencial da unio dos substratos pode ser ao acaso (mecanismo aleatrio) ou seguir uma ordem em particular (mecanismo ordenado). Se se fixar a concentrao do substrato A e variar a de B, ao representar-se graficamente o comportamento da enzima mediante um diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas com um ponto de interseco comum a todas elas. Entre as enzimas que apresentam este mecanismo podemos encontrar a glutatio S-transferase,[15] a di-hidrofolato redutase[16] e a DNA polimerase. [17] As seguintes ligaes mostram animaes do mecanismo de complexo ternrio da di-hidrofolato redutase e da DNA polimerase .

Nesta prtica ser verificada a cintica enzimtica da invertase uma enzima capaz de hidrolisar a sacarose em unidades de frutose e glicose, onde a determinao da velocidade da reao est relacionada com fatores cinticos como: temperatura, pH e concentrao de substrato e da enzima, presena de cofatores e inibidores, etc.

OBJETIVO
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Comparar a atividade enzimtica da invertase, em relao influncia da temperatura, pH e da variao de concentrao de substrato. PARTE EXPERIMENTAL

1-

Aparelhagem e Material utilizado:

2- Reagentes: Enzima invertase; Tampo acetato pH 5,0; Soluo de sacarose a 25 mmol/l (9,5 g/l) em tampo acetato pH 5,0; Soluo de cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS); gua destilada. Soluo de sacarose a 0,2 mol/l (6,8 g/100 ml) em diferentes tampes (acetato pH 3,6; acetato pH 5,0 e fosfato pH 8,0).

Tubos de ensaio 10 X 150 mm; Banho de gua 37C; Banho de gua fervente; Banho de gelo; Pipetas de 2, 5 e 10 ml; Becheres de 400 e 600 ml; Estante para tubos de ensaio.

3- Procedimento: Influncia da Concentrao de Substrato: Em 7 tubos de ensaio com tampa, enumerados de 1 a 7, adicionar tampo acetato pH 5,0 e soluo de sacarose 25 mmol/l conforme indicado pela tabela abaixo:
REAGENTES Tampo acetato pH 5,0 (ml) Soluo de Sacarose 25 mmol/l (ml) TUBO 1 2,0 TUBO 2 1,8 TUBO 3 1,6 TUBO 4 1,0 TUBO 5 0,5 TUBO 6 0,2 TUBO 7 0,0

0,0

0,2

0,4

1,0

1,5

1,8

2,0

Colocar os 7 tubos e o tubo contendo a enzima em banho de gua 37C por 5 minutos (aclimatao); Retirar os tubos do banho e adicionar, em cada tubo, 0,5 ml de enzima; Incubar os tubos a 37C por 15 minutos para que a hidrlise acontea; Adicionar 1 ml de DNS, em cada tubo, para paralisar a reao, retirar imediatamente do banho e levar ao banho de gua fervente por 5 minutos; Retirar os tubos do banho fervente e resfri-los em gua corrente; Pgina 4 de 11

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Adicionar, em cada tubo, 6,5 ml de gua homogeneiz-los; Ler a absorbncia em espectrofotmetro inferir, atravs da curava de calibrao, os concentrao de glicose correspondentes; Traar um grfico de Velocidade de Concentrao de substrato.

destilada e 570 nm e valores de catlise X

Influncia do pH: Colocar os 3 tubos contendo as solues de sacarose a 0,2 mol/l em diferentes tampes e o tubo contendo a enzima em banho 37C por 5 minutos (aclimatao); Adicionar 0,5 ml de enzima a cada um dos 3 tubos; Incubar os tubos a 37C por 15 minutos para que a hidrlise acontea; Adicionar 1 ml de DNS, em cada tubo, para paralisar a reao, retirar imediatamente do banho e levar ao banho de gua fervente por 5 minutos; Retirar os tubos do banho fervente e resfri-los em gua corrente; Adicionar, em cada tubo, 6,5 ml de gua destilada e homogeneiz-los; Observar a colorao dos 3 tubos e anotar.

Influncia da Temperatura:

Colocar os 3 tubos contendo a soluo de sacarose a 0,2 mol/l em tampo acetato pH 5,0Tubo tubo contendo a e o I = 0,0 ml enzima em banho 37C por 5 minutos (aclimatao); Adicionar 0,5 ml de enzima a cada um dos 3 tubos; Incubar os tubos, a diferentes temperaturas, por 15 Tubo II = 0,2 ml minutos para que a hidrlise acontea: banho de gelo (4C), banho 37C e Banho fervente (100C); Adicionar 1 ml de DNS, em cada tubo, para paralisar a reao, retirar imediatamente do banho e levar ao banho Tubo III = 0,4 ml de gua fervente por 5 minutos; Retirar os tubos do banho fervente e resfri-los em gua corrente; Adicionar, em cada tubo, 6,5 mlTubogua 1,0 ml de IV = destilada e homogeneiz-los; Observar a colorao dos 3 tubos e anotar. Cintica Enzimtica Tubo V = 1,5 ml

Tubo VI = 1,8 ml

Tubo VII = 2,0 ml Pgina 5 de 11

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INFLUNCIA DO SUBSTRATO Diferentes volumes de soluo de sacarose

Tubo I = pH 3,6

INFLUNCIA DO pH Diferentes tampes

Tubo II = pH 5,0

Tubo III = pH 8,0

Tubo I = 4C INFLUNCIA DA TEMPERATURA Diferentes temperaturas de incubao Tubo III = 100C

Tubo II = 37C

RESULTADOS E DISCUSSES

Influncia da Concentrao de Substrato: As solues foram colocadas em banho-maria conforme mandou o procedimento (em temperatura de 37) e, aps os 5 minutos foram retidas as quantidades devidas de soluo da enzima invertase que foram adicionadas aos tubos contendo substratos devidamente identificados (0,5mL). Realizado esse procedimento, esperou-se 15 minutos para se adicionar
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1mL de DNS em cada tubo. Resfriando em seguida os tubos em gua corrente. Por fim foi feita a leitura de absorbncia das amostras. A reao ocorrida nos tubos foi:

Figura 1: Hidrlise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose so acares redutores. A leitura foi feita da seguinte forma; a leitura do tubo "branco" serviu somente como referencial para o aparelho realizar as medies nos tubos numerados de 1 a 7 e fornecer dados como a concentrao de produtos e absorbncia analtica. A leitura da absorbncia no "branco" definida como 0, ou seja, o valor dela ser descontado do valor de absorbncia obtido nos outros tubos. Isso se deve ao fato de que a soluo tampo + DNS tambm absorve parte da luz incidida, alterando o resultado de todos os tubos analisados no aparelho, por isso necessrio efetuar a correo dos valores medidos. Tabela 1:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Absorbncia analtica 0,074 0,089 0,092 0,099 0,119 0,130 0,134

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Figura 1 tubos com as amostras em diferentes concentraes.

O grfico pilotado da prtica est exibido a seguir. Porm o mesmo no foi feito com os valores obtidos, Curva de Calibrao - Mtodo DNS isso y = 0,2598x - 0,0096 0,3 R = 0,9973 porque a 0,25 0,2 gente no 0,15 fez as 0,1 0,05 medies 0 dos 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Concentrao de glicose (g/L) padres.
Absorbncia a 570 nm
2

Observou que os valores obtidos no formam uma reta perfeita (teoricamente). Essa experincia serviu para a anlise do efeito da concentrao do produto (formado pela reao do acar redutor com o DNS) na leitura da absorbncia, pois este apresenta cor caracterstica. Esta reta de extrema utilizade da determinao das concentraes de glicose obtidas na prxima experincia e, consequentemente, na concentrao de sacarose hidrolisada, visto que a reao (exibida em "Fundamentos das experincias") tem proporo de 1:1 da sacarose em relao glicose. Como a prxima experincia envolve tambm o tempo de reao, ser possvel calcular a velocidade da reao, ou seja, a quantidade de sacarose hidrolisada por minuto. Influncia do pH Foram realizados o estudo em 3 tubos diferentes com quantidades de sacarose iguais nos tubos (1,5mL de sacarose a 0,2mol/L). A variao efetuada foi a do pH, sendo que no tubo 1 continha pH 3,6; no tubo 2 pH 5,0; e no tubo 3 pH 8,0.

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Os

tubos

de

substrato

invertase

foram

colocados em banho-maria temperatura de 38C durante 15 minutos e, aps esse tempo, misturou-se 1mL da soluo de DNS. Tabela 2: TUBOS I pH=3,6 II pH=5,0 III pH=8,0 RESULTADOS Colorao mais clara que as demais Colorao mais escura parecida com a de pH=8,0 Colorao mais escura parecida com a de pH=5,0

As diferenas observadas deve-se ao fato de que as enzimas, em sua maioria, possuem um pH caracterstico no qual sua atividade mxima. No caso da invertase, seu pH relativamente cido (pH=4,0), sendo por isso que o ponto acrmico foi alcanado num tempo menor quando se utilizou a amostra de pH 3,6. Acima desse pH timo a atividade enzimtica se reduz, motivo pelo qual o ponto acrmico demorou mais de ser alcanado quando se utilizou a amostra de pH 8,0, e pH = 5,0.

Figura 2 amostras contendo a mesma concentrao, porm em pHs diferentes. 1 pH = 8,0; 2 pH = 5,0 e 3 pH = 3,6.

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Influncia da Temperatura A temperatura de atividade mxima da invertase por volta de 38C, porm percebeu-se que no houve diferena significativa em relao as coloraes das solues apresentadas. No podendo assim, a partir s desta caracterstica, falar se a enzima age bem ou no em determinada temperatura.

Figura 3 amostras em diferentes temperaturas.

Tabela 3: TUBOS I 4C II 37C III 100C CONCLUSO RESULTADOS Colorao escura, porm no diferente das demais Colorao escura, porm no diferente das demais Colorao escura, porm no diferente das demais

Notou-se uma eficincia cataltica admirvel das enzimas devido ao seu alto grau de especificidade por seus substratos, acelerando reaes qumicas especficas. Observou-se que tais reaes ocorrem em condies necessrias para que ocorra uma boa atividade da enzima, j que elas funcionam em condies suaves de temperatura e pH. Pde-se verificar tambm que a velocidade da reao enzimtica est relacionada com a concentrao do substrato e que atravs da equao de Michaelis-Menten possvel descrever o comportamento cintico de grande maioria das enzimas.
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Vale ressaltar que o bom conhecimento da estrutura das enzimas e suas condies de funcionamento so de fundamental importncia para nossos experimentos. BIBLIOGRAFIA

- LEHNINGHER, Arthur. et al. Princpios de Bioqumica. 2 ed. So Paulo: Sarvier Editora, 1995. - http://www.radarciencia.org/doc/producao-de-acucarinvertido-pelo-uso-de-invertase-imobilizada-emresinas/o2ScYKIzqF5vpv01AGH=/ http://www.scielo.br/scielo.php? pid=S141370542007000600002&script=sci_arttext Acesso em: 21/11/2010.

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