I

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOREMEDIASI

MOHAMAD YANI
JURUSAN TEKNOLOGIINDUSTRI PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
,
\
DAFTAR 151
Halaman
I. PENDAHULUAN ....................................... ... ......... .............. ..... 1-1
1.1. BIOREMEDIASI .................................................................... 1-1
1.2. BIODEGRAD!ISI POLUTAN ORGANIK ..................................... 1-2
i
1.3. JENIS POLUl a.N ORGANIK ................................................... 1-3
1.4.lINGKUP PEllELITIAN BIOREMEDIASI .................................. 1-4
II. ISOLASI, KARAK1ERISASI DAN IDENTIFIKASI MIKROBA POTENSIAL
DARILOKASI TERKONTAMINASI ................................................. 2-1
2.1. ISOLASI MIKROBA ........................ '" ...... ... ......... ......... ........ 2-1
2.2. PENGAWETAN MIKROBA .................................................... 2-3
2.3. PENGUJIAN ISOLAT........................... ................................. 2-3
2.4. PERTUMBUHAN ISOLAT ...................................................... 2-6
~
2.5. IDENTIFIKASIISOLAT ......................................................... 2-8
III. PROTOKOL UNTUK MENENTUKAN KINETIKA BIOAVAILABILITAS
DAN BIODEGRADASI POLUTAN ORGANIK TANAH DALAM SISTEM
TANAH UNTUK MENINGKATKAN BIOREMEDIASI TANAH YANG
TERPOLUSI ........................ ............ ...... ...... ...... ...... ......... ....... 3-1
3.1. PENDAHULUAN ...... ...... ......... ......... ... ...... ......... ............... 3-1
3.2. BAHAN............................................................................ 3-6
3.3. METODE......... ...... .......................................... .... ........ .... 3-9
3.4. CATATAN ........................................................................ 3-15
IV. PENGUJIAN BIODEGRADASI MINY AK BUMI ............... ........ ........ 4-1
4.1. PENGUJIAN BIODEGRADASILIMBAH MINYAK BUMI DAtAM
AIR ................................................................................. 4-1
4.2. PENENTUAN MINYAK DALAM AIR SECARA GRAVIMETRI ..... 4-3
IV. SIMULASI PENGUJIAN TREATABILITAS LABORATORIUM UNTUK
MEMPERKIRAKAN KESIAPAN LAHAN ....................................... 5-1
ii
5.1. EVALUASI TRETABILITAS .............................................. . 5-1
5.2. METODA PENGUJIAN TREA TABILITAS ............................. 5-4
5.3. STUDI KASUS TENTANG UJI TREATABILITAS KHUSUS...... 5-7
5.4. STUDI KASUS TERHADAP EVALUASI LABORATORIUM
KOMPLEKS ............................................................... 5-13
LAMPIRAN - LAMPI RAN ................................. '" ............... ... ... ... ..... L
iii
OAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Oaftar analisis contoh limbah minyak bumi dan batas
regulasinya pada Kep. 04/Bapedall09/1995 dan metoda
analisisnya ................................................................ L 1
Lampiran 2. Analisis Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) dengan GC/FIO
PIO (Modifikasi EPA 8015/8020) ...... ... ...... ... ......... ......... L2
1I
Lampiran 3. Prosedur analisis C. N. dan P ............ ...... ....................... L3
Lampiran 4. Penghitungan bakteri pengurai hidrokarbon secara MPN ....... L4
Lampiran 5. Peratuan tentang pengolahan minyak bumi (Kep.Bapedal) .. ... L5
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah Yang Maha Kuasa, atas segala
rahmat yang telah diberikan sehingga penulis mampu menyelesaikan penulisan
penuntun praktikum Bioremediasi. Tujuan penulisan penuntun ini adalah untuk
membantu mahasiswa dalam memahami teknologi bioremediasi dan menerapkan teori
yang mereka peroleh dari kuliah untuk dicoba di laboratorium dan lapangan.
Pada kesempatan ini penulis sampaikan terima kasih kepada Dr. Jr. Anas
Miftah Fauzi, M.Eng. dan Dr. Jr. Nastiti Siswi Indrasti, sebagai pengajar mata kuliah
bioremediasi yang telah memberikan arahan dan masukan materi praktikum. Selain
itu, terima kasih kepada Farida Yulianti, STP. atas bantuannya daJam pengetikan
materi dan pengeditan.
Kritik dan saran perbaikan materi praktikum ini sangat diharapkan, dan semoga
penuntun praktikum ini dapat menambah wawasan dan keterampifan mahasiswa dan
pembaca umumnya.
Bogor, Nopember 2002
Penulis
,
I. PENDAHlILUAN
1.1. BIOREMEDIASI
Bioremediasi merupakan bagian dari bioteknologi lingkungan yang
memanfaatkan proses alami biodegradasi dengan menggunakan aktivitas
mikroba yang dapat memulihkan lahan tanah, air dan sedimen dari kontaminasi
terutama senyawa organik. Mikroba telah digunakan untuk menghilangkan
bahan organik dan bahan kimia beracun lainnya dari limbah domestik dan
keluaran industri selama beberapa tahun terakhir. Hal yang "baru" dari
bioremediasi adalah penanganan cepat pada pengolahan limbah suatu industri
sejak beberapa dekade ini, dan penerimaannya sebagai suatu metoda yang
efektif dan ekonomis sebagai alternatif untuk membersihkan tanah, permukaan
air, dan kontaminasi air tanah dengan kandungan sejumlah bahan beracun,
seperti rekalsitran dan kimia. Bioremediasi menjadi pilihan teknologi untuk
pemulihan (remediasi) dari berbagai lingkungan yang terkontaminasi. khususnya
lahan yang terkontaminasi hidrokarbon dari minyak bumi (petroleum) (Cookson,
1995 dan Crawford dan Cravlford, 1996).
Bioremediasi juga menjadi suatu bidang intensif untuk penelitian dan
pengembangan dalam akademisi, pernerintah dan industri di beberapa negara.
Perkembangan ini, sehagian disebabkan perundangan baru yang mensyaratkan
perlindungan yang lebih ketat terhadap lingkungan dan kewajiban membersihkan
lahan yang terkontaminasi. Besarnya pendanaan antara penelitian dasar dan
terapan dalam bioremediasi oleh instansi pemerintah maupun industri swasta
tetah meningkat dalam beberapa dekade ini. Hasilnya berupa kemajuan yang
cepat pada pengembangan efektivitas, ekonomis dalam proses mikrobial
bioremediasi. Pada pandangan yang lebih luas, terjadi peningkatan aktivitas
dalam bidang mikrobiologi lingkungan, suatu bidang ilmu yang mencakup
spektrum disiplin yang meliputi phisiologi mikrobial dan ekologi. kimia organik.
biokimia, kimia air dan tanah, geologi. hidrologi, dan teknik. Pada penelitian
lingkungan di perguruan tinggi. bioremediasi menjadi ilmu pengetahuan yang
Juas dan kompleks antara aspek dasar dan terapan yang memerlukan dan
melibatkan multidisiplin dan membutuhkan suatu pusat peneJitian bioremediasi
tersendiri. Hal ini merupakan tantangan bagi para peneliti untuk tetap mengikuti
perkembangan yang capat dari bioremediasi, khususnya arahan diversitas
1-1
fingkungan dan kontaminan, sebagaimana aneka pendekatan bioremediasi yang
muncul dalam beberapa tahun terakhir.
Hampir sebagian besar kimia organik dan beberapa inorganik juga
merupakan substrat proses enzimatis melalui aktivitas mikroorganisme hidup.
Hampir seluruh polutan lingkungan di masyarakat maju meliputi kimia dan aksi
enzim yang biasanya disebut dengan istilah biodegradasi. Biodegradasi dapat
meliputi banyak proses dengan keluaran yang amat berbeda dan
konsekuensinya. Misalnya, polutan xenobiotik mungkin dapat dimineralisasi,
diubah menjadi produk oksidasi sempurna seperti karbon dioksida, atau
ditransformasikan menjadi senyawa lain yang lebih sederhana dan tidak
berbahaya atau beracun, terakumulasi dalam tubuh mikroorganisma, atau
terpolimerisasi atau terikat secara alami dalam tanah, sedimen, atau air. Lebih
dari satu proses mungkin t e ~ a d i untuk polutan tunggal pada waktu yang
bersamaan. Phenomena proses tersebut sangat berpengaruh terhadap sukses
tidaknya pengolahan polutan xenobiotik dalam teknologi proses bioremediasi
(Cookson, 1995 dan Crawford dan Crawford, 1996).
1.2. BIODEGRADASI POlUlAN ORGANIK
Jenis polutan organik yang dapat dibiodegradasi dilaporkan sebagai
berikut (Crawford dan Crawford, 1996): BlEX, minyak bumi, polisiklik aromatik
hidrokarbon (PAH), PCB, senyawa nitroaromatik, phenol berkhlor, senyawa
alifatik terklorinasi, dan metal. Prinsip biodegradasi minyak bumi secara
sederhana adalah sebagai berikut. Limbah minyak bumi yang terdiri dari
berbagai jenis komponen mulai C
4
- C
40
, didegradasi oleh mikroba menjadi
senyawa sederhana seperti C02, asam organic sederhana, biomass a cell.
Namun demikian, selalu terdapat senyawa-senyawa yang tidak dapat
dibiodegradasi oleh mikroba. Sekumpulan mikroba tertentu akan mendegradasi
komponen minyak bumi secara berurutan dan berantai. Populasi yang hidup dan
berkembang sesuai dengan keberadaan substrat yang tersedia padasuatu saat.
Selain minyak bumi, pestisida merupakan limbah potensial yang sulit
didegradasi. Oegradasi mikrobial terhadap pestisida bukan merupakan
penemuan baru, tetapi telah lama dikenal. Penelitian awal terhadap degradasi
pastisida dihadapkan pada kegagalan pada saat dilakukan pengulangan aplikasi
pada tanah untuk mengontrol pestisida pertanian. Fenomena ini merupakan
masalah yang dipertimbangkan oleh industri pertanian, tetapi merupakan
1-2
keuntungan ekologi bagi para ahU dan insinyur lingkungan. Pengulangan
aplikasi ini menghasilkan pengembangan mirobial yang sacara efektif
menghasilkan pestis ida yang aplikatif. Mekanisme yang pasti untuk adaptasi
mikrobial terhadap pastisida belum dimengertL Mekanisme ini dapat berupa
pertumbuhan populasi yang sederhana atau terjadi perubahan secara genetika.
Mikroorganisme dapat memperoleh materi genetik yang menyandikan
mekanisme biokimia penting dalam hubungannya dengan substrat potensial
yang baru. Alternatifnya, mikroorganisme mungkin menghasilkan komponen
untuk menghilangkan toksisitas, sehingga lebih baik baginya daripada
menggunakannya sebagai sumber energi.
Prinsip degradasi untuk pestisida, insektisida. dan herbisida tidak berbeda
dengan komponen organik pada umumnya. Bahan pestis ida, insektisida, dan
herbisida ini disajikan dalam bagian yang terpisah karena komponen ini ini sering
ditemui sebagai kontaminan yang terpisah dari komponen organik yang lain dan
sebagian besar di antaranya tidak sangat sulit untuk dibioremediasi. Kemudian
dari sudut pandang insinyur, bahan kimia pestisida, insektisida, dan herbisida ini
biasanya diperlakukan sendiri dan akan menjadi pertimbangan yang terpisah.
1.3. JENIS KONTAMINAN
Jenis kontaminan yang perlu dibioremadiasi adalah senyawa xenobiotik
(termasuk pestisida), yaitu senyawa ciptaan manusia yang sulit dibiodegradasi
oleh mikroba, serta senyawa turunan rninyak bumi.
Lebih dari 125 herbisida, 300 insektisida, dan 325 fungisida telah terdaftar
dalam United State (Kearney, 1972). Bahan kimia ini menunjukkan bervariasinya
struktur bahan kimia yang tidak sama, sebagian di antaranya sangat resisten dan
beberapa yang lain dapat didegradasi menjadi komponen yang memiliki
toksisitas yang lebih tinggi dari pada sebelum didegradasi. Keberadaan
komponen ini dalam tanah merupakan fungsi dan beberapa variabel, dan
rnenarik untuk mengukur keberadaannya dalam tanah dalam rangka
mengevaluasi manfaatnya. Alexander (1977) telah melaporkan beberapa data
dengan menekankan bahwa periode aktual dari klodane, DDT. dieldrin dan
heptaklor mungkin lebih lama (3 - 10 tahun).
Selain itu senyawa zat warna sintesis umumnya sulit didegradasi oleh
mikroba. Sejumlah zat warna tekstil yang merupakan bahan pencelup mampu
didegradasi oleh jamur P. chrysosporium berikut ini.
TabeI1.1. Mineralisasi Bahan Pencelup Azo Oleh P. chrysosporium
Bahan Pencelup Persen Mineralisasi dalam 12 Hari
4-fenilazofenol 26-38
4-fenilazo-2-metoksifenol 21-48
Dispersi yellow 3 43
4-fenilazoanilin 26
N,N-dimetil-4-fenilazoanilin 30-46
Dispersi orange 40-43
Pelarut yellow 14 5-23
Tropaeolin 0 tidak ada data
Orange II tidak ada data
Congo red tidak ada data
Sumber: Spadaro (1992) : Cripps (1990)
1.4. LlNGKUP PENELITIAN BIOREMEDIASI
Masing-masing tempat lim bah berbahaya menawarkan parameter yang
membutuhkan operasi remediasi yang potensial. Bentuk kontaminan di suatu
tempat umumnya terdiri atas padatan (tanah dan sludge) dan cair (kolam dan air
tanah). yang dapat diklasifikasikan berdasarkan bahan yang membutuhkan
penanganan. Teknologi pengolahan biologi untuk bahan yang terkotaminasi ini
dibagi menjadi empat katagori : (1) fase biopengolahan-padat (Iandfarming). (2)
fase biopengolahan-slurry. (3) fase pengolahan bioreaktor-cair. dan (4)
biopengolahan in-situ. Proses pengolahan yang spesifik membutuhkan fungsi
fisiklkimia kontaminan alami dan matrik dimana kontaminan ini ditemukan.
Pengolahan yang kompleks biasanya membutuhkan satu atau lebih kombinasi
proses di atas dan juga intergasi dengan proses fisiklkimia untuk remediasi
secara menyeJuruh pada suatu tempat.
Apabila ada satu pertimbangan proses bioJogi untuk remediasi
kontaminasi spesifik suatu tempat, maka pertimbangan ini penting untuk
mendapat informasi yang mengindikasikan keberhasilan sebelum malaksanakan
remediasi pada skala penuh. Pengujian treatibilitas di laboratorium
menghasilkan data untuk mengevaluasi kesiapan proses pada tempat tertentu
dan mengidentifikasi parameter yang pantas untuk impJementasi.
Pengujian treatabiJitas di laboratorium meniru pengolahan yang
diantisipasi untuk penggunaan di lapangan. Pengujian ini dilakukan dalam
1-4
beberapa cara yang berbeda, tergantung pada tipe pengolahan pada skala
penuh yang diantisipasi. Secara umum, ada tida gipe pengujian : (1) kajian di
nampan (fase padat), (2, kajian erlenmeyer (fase cair dan fase slurry), dan (3)
kajian kolom (in-situ). Derajat spesifisitas dan kompleksitas pengujian spesifik
akan sangat tergatung pada kebutukan p e k e ~ a a n dan pada jumlah informasi
yang diperlukan untuk membuat keputusan yang realistis tentang keperluan
pengolahan untuk membersihkan tempat tertentu. Kajian dilakuakkn dari yang
masih sederhana, dimana satu uji aktif dibandingkan dengan kontrok inaktif dan
hanya hilangnya kontaminan target yang diamati, sampai pegujian ganda yang
kompleks, dimana beberapa parameter fisik, kimia dan mikrobiologi divariasikan.
Tujuan utama dari pegujian pada bench-scale treatmet adalah untuk
mencapai hasil awal apakah pengolahan seperti ini yang potensial untuk aplikasi
di lapangan. Keberhasilan pegujian pada skala bench akan menghasilkan data
yang cukup tentang kemampuan pengolahan untuk meremediasi kontaminan
untuk menjamin percobaan di lahan. Berdasarkan pada proses yang spesifik
dan luasnya tempat, pengujian lahan pada skala pilot mungkin tepat sebelum
mengawali pengolahan pada skala penuh.
Daftar Pustaka :
Cookson, J.T. 1995. Bioremediation Engineering: Design and Application.
McGraw-Hili, Inc., Toronto.
Crawford, R.L. dan D.L. Crawford. 1996. Bioremediation principles and
applications. Cambridge University Press.Cambridge.
Shaheen, E.I. 1992. Technology of Environmental Pollution Control. Pen Well
Books Tulsa, Oklahoma.
1-:'l
II. ~ S O L A S I J KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI MIKROBA
POTENSIAL DARI LOKASI TERKONTAMINASI
2.1. ISOLASI MIKROBA
Proses bioremediasi menggunakan konsorsium mikroba, untuk itu diperlukan
sumber mikroba lokal dalam berbagai jenis yang dapat mendegradasi minyak bumi
(senyawa organik) dengan cepat. Jenis bakteri lokal (indigenous bacteria) diisolasi
dari sample limbah yang ada dilokasi lahan atau tanah terknontaminasi minyak
bumi clalam waktu yang relatif lama, sehingga diharapkan telah tumbuh mikroba
pendegradasi minyak bumt Tidak semua mikroba yang terdapat di lokasi (alam)
dapat ditumbuhkan di laboratonum. Mikroba aerobik lebih mudah ditumbuhkan
dari pada mikroba anaerobic. Bakten diisolasi dengan menggunakan medium NA
(Nutrient Agan, sedangkan kapang diisolasi dengan menggunakan medium PDA
(Potato Dextrose Agar). Pada kegiatan ini akan dilakukan percobaan isolasi
bakteri atau kapang aerobik dengan menggunakan media yang sederhana.
Beberapa kegiatan yang diperlukan untuk isolasi, pengujian dan pemeliharaan
mikroba.
Bahan
1. Tanah, air atau sedimen terkontaminasi minyak bumi atau kontaminan B3
lainnya dalam waktu yang lama.
2. Kontainer atau botol plastik yang bersih dan telah disterilisasi dengan bilasan
alcohol untuk sampel tanah.
3. Tabung pengencer yang bensi 10 ml akuades steril
4. Media NA dan PDA dalam cawan p::::tri masing-masing 6 buah.
Peralatan
1. Peralatan untuk menumbuhkan bakteri : pipet, batang penyebar, lampu sprittus
2. Clean bench
3. Autoclave
4. Cawan petri, tabung reaksi, tabung ulir
5. Inkubator
2-1
Prosedur isolasi mikroba
1. Ambil sedikit sample (1 gram) (tanah. air atau sedimen) masukkan dalam tabung
pengencer yang telah berisi larutan fisiologis (1-2% NaCI) atau akuades secara
.
aseptis.
2. Buat pengenceran sampel pada tabung yang lain sampai 10-4. 10-
5
, dan 10-
6

3. Pindahkan 1 ml biakan dari tabung pengencer ke atas media NA dan PDA dalam
cawan petri, masing-masing dua ulangan. kemudian ratakan dengan batang
glass. Bisa juga dilakukan goresan 4 kuadran dengan menggunakna ose.
4. Inkubasikan pada suhu 30C, 3PC atau suhu ruang selama 2-3 hari
5. Setelah terlihat ada pertumbuhan bakteri atau kapang. ambil single koloni
secepatnya dan goreskan atau pindahkan ke media NA atau PDA yang baru.
Setelah terlihat tumbuh kembali pada media baru, lanjutkan pemurnian isolat
hingga benar-benar tidak ada isolat lain yang tumbuh.
6. Pad a pemurnian isolat ini dapat dilakukan beberapa kali, hingga benar-benar
mumi atau tidak terkontaminasi oleh lainnya dengan cara melihat dibawah
mikroskop.
7. Amati morphologi isolat secara visual pada cawan petri dan di bawah mikroskop.
Catet hasil pengamatan pada Tabel berikut.
8. Isolat yang tumbuh, dimumikan kembali untuk meyakinkankan tidak
terkontaminasi oleh yang lainnya dan disimpan sebagai stok sementara.
TabeI2.1. Pengamatan isolasi mikroba
No Kode Sumberl Media Suhu Morphologi secara
isolat lokasi tumbuh inkubasi visual (wama, bentuk
NA PDA 30 37 koloni, dll)
1
2
3
4
5
2-2
2.2. PENGAWETAN MIKROBA
Prosedur pengawetan mikroba :
1. Setelah murni, isolat diperbanyak dalam media agar miring dan cawan petri untuk
dilakukan pengujian karakterisasi isolat.
2. Pengawetan isolat dilakukan pula dalam media cair (Nutrient broth atau media
lainnya), dengan penambahan gliserol steril 20 - 50%. Tuangkan 0.8 ml kultur
segar pada akhir phase logaritmiknya ke dalam tabung eppendorf steril dan
tambahkan 0.2 ml gliserol steril, kemudian tutup tabung dan beri label kode isolat
dan tanggal pembuatan. Setelah itu, simpan secara bertahap pada suhu -20C
(penyimpanan pada suhu ini akan mengawetkan mikroba selama beberapa
bulan) selama 1-2 hari, kemudian pindahkan ke frezer suhu -70C untuk
penyimpanan beberapa tahun.
3. Bila telah isolat telah dikarakterisasi atau diidentifikasi, maka pengawetan
mikroba selaian dilakukakn seperti diatas, lakukan pula pengawetan dengan
Iyopilisasi dalam tabung hampa udara yang dapat disimpan pada suhu kamar
selama beberapa tahun.
2.3. PENGUJIAN ISOLA T
Pengujian kemampuan mikroba dilakukan dengan menggunakan media selektif
baik dalam pada media padat maupun cairo Pengujian pada media padat dilakukan
untuk mengetahui kemampuan isolat dalam mendegradasi atau menggunakan substrat
tertentu. Sedangkan pengujian pada media cair dilakukan untuk menentukan laju
degradasi substrat (subtsrat terbaik hasil pengujian pertama).
2.3.1. Pengujian pada media selektif padat I
Pengujian kemampuan isolat terhadap senyawa kontaminan atau polutan
tertentu dapat dilakukan dengan menggunakan media selektif. Media ini terdiri dari
komponen mineral dan sebagai sumber nitrogen, kemudian sumber karbonnya dapat
menggunakan senyawa polutan target. Pengujian ini dilakukan sebagai tahapan
seleksi isolat berdasarkan kemampuannya memanfaatkan sumber karbon dari minyak
diesel, minyak tanah atau turunan minyak bumi lainnya, Asumsinya, isolat yang
2-3
mampu memanfaatkan sumber satu-satunya karbon yang berasal dari minyak diesel
berarti bisa mendegradasi komponen hidrokarbon dalam minyak diesel.
Sebelum pengujian dilakukan, substrat minyak yang akan diujikan terlebih
dahulu disaring menggunakan membran organik ke dalam tabung ulir steril setelah itu
diletakkan di bawah sinar ultraviolet selama 20 menit. Seluruh proses persiapan
substrat tersebut dilakukan secara aseptis untuk menghidari tumbuhnya
mikroorganisme kontaminan. Sebanyak 2 persen minyak tersebut kemudian dilarutkan
dalam Carbon Minimal Salts Culture Media (CMSC) yang sudah disteriliasi dengan
autoklaf. Media yang sudah homagen selanjutnya dituang ke cawan petri masing
masing sebanyak 15 - 20 ml. Isolat digoreskan ke media yang sudah padat untuk
diamati pertumbuhannya setiap hari. Komposisi CMSC adalah sebagai berikut :
Table 2.1. Komposisi media mineral CMCS dalam 1 liter akuades.
Bahan Berat
K
2
HP0
4
.3H
2
O 2.2 9
KH
2
P0
4
0.73g
(NH4)2S04 1 9
NaCI 30g
MgS04 0.2 9 *
Agar 15 g **
* Tambahkan setelah media selesai diautoklaf dan suhunya mencapai suhu
ruang.
** Untuk media padat.
Untuk kebutuhan seleksi kemampuan isolat dalam menderadasi sumber karbon
yang lain, dapat dilakukan pengujian dengan menggantikan sumber karbon dari
polutan lainnya. Polutan B3 antara lain PCB, PAH, PCP, atau senyawa turunnya, dan
sebagainya.
2-4
2.3.2. Pengujian pad a media padat dengan substrat berbeda
Selain menggunakan media selektif di atas, dapat pula menggunakan media
mineral yang mengandung nitrogen (yeast ekstrak), kemudian sumber karbonnya dari
senyawa polutan target diujikan dalam spot kertas saring sebagai berikut :
1. Siapkan media CMCS (bisa juga ditambahkan yeast ekstrak) padat. Siapkan
media tadi dalam cawan petri seperti biasa, dan beri label media yang sesuai.
2. Siapkan substrat minyak bumi (sludge, pelumas, diesel, bensin, minyak tanah),
minyak makan I minyak sawit atau minyak goreng. Semua bahan disterilasi
terpisah dengan cara tiltrasi dan sinar UV selama 20 menit.
3. Siapkan pula cincin stainless stell (diameter 5mm) atau bulatan kertas saring yang
dibuat dengan punch hole, kemudian sterilkan dengan panas atau kering.
4. Tuangkan 0.1 ml suspensi bakteri yang segar ke dalam masing-masing cawan
yang berisi media padat. kemudian tebarkan dengan batang gelas penyebar
sampai rata (homogen).
5. Pasang 5 cincin pada media yang berisi mikroba, kemudian tuangkan 100 1-11
substrat minyak steril. Cara lain adalah dengan mencelupkan bulatan kertas
sa ring ke dalam substrat. kemudian tempelkan di atas media yang teJah
disebarkan mikroba (Lihat Gambar)
6. Inkubasikan kultur cawan tersebut pada suhu yang sesuai (30
0
atau suhu ruang)
selama 2-7 hari. Amati pertumbuhan mikroba pada daerah sekitar cine in atau
bulatan kertas saring yang berisi substrat.
7. Bila mikroba dapat tumbuh di sekitar cincin atau bahkan dapat tumbuh di atas
bulatan kertas saring, menandakan bahwa mikroba terse but dapat menggunakan
atau mendegradasi substrat terse but, seperti diperlihatkan pada Gambar 2.1.
8. Catat pengamatan tersebut dalam table.
2-5
Gambar 2.1. Contoh pengujian isolat dengan menggunakan 5 jenis
substrat, mulai dan atas searah jarum jam : lim bah
minyak bumi (1), olilpelumas (2), minyak diesel (3),
minyak goreng (4) dan minyak tanah (5).
Tabel 2.2. Pengujian pertumbuhan isolat pada media padat dengan substrat minyak
No Kode isolat Pert:.ambuhan pada substrat yang diujikan
Sludge Pelumas diesel kerosin m. sawit
1
2
3
4
5
2.4. PERTUMBUHAN ISOLAT
Karaktensasi isolat yang penting adalah pengukuran grafik pertumbuhan isolat
dalam media cairo Kecepatan oksidasi minyak bumi dilakukan dalam media cair
dengan menggunakan medium mineral dan 5 substrat yang sama dan dibandingkan
dengan kontrol substrat tanpa mikroba. Kecepatan pelarutan minyak dalam medium
dan oksidasi minyak oleh mikroba diamati secara fisik kimia dengan mengamati
perubahan : kekentalan, konsistensi, wama, homogenitas, kekeruhan media, dan pH.
2-6
Prosedur
1. Siapkan stok isolat pada media padat atau cair yang sehat dan segar.
2. Sediakan media cair CMCS yang mengandung senyawa polutan target pad a
konsentrasi 1, 5, dan 10 % pada botol serum atau botol berulir volume 100 ml.
3. Inokulasikan isolat pad a media cair dan inkubasikan pada shaker incubator suhu
30
D
C.
4. Pada selang 24 jam. ambil 2 ml sample secara aseptis, ukur pH. kekeruhan
(OD
660
dengan spektrophotometer). Kemudian inkubasikan kembali seperti yang
lainnya.
5. Amati perubahan pada media bakteri dan kosistensi substrat.
6. Catat hasil pengamatan pada Tabel berikut. Bila perlu catat perubahan lainnya
pada lembaran lain.
7. Buat grafik perubahan kekeruhan dan pH terhadap waktu.
8. Bila terlihat grafik menujukkan hasil mendekati phase pertumbuhan logaritmik.
maka perlu diJakukan pengamatan pada selang 12 jam atau 6 jam, untuk
mendapakan phase Iogartitmik yang baik.
Tabel 2.3. Pengamatan visual kultur bakteri dan konsistensi substrat
Kode isolat
Substrat yang diujikan
Mulai pengamatan
Hariltanggal
Pukul
2-7
I
2.5. IDENTIFIKASI ISOLA T
2.5.1. Pengujian gram
Sesuai dengan bahan identifikasi yang tersedia untuk bakteri gram negatif,
maka lakukan pengujian gram terhadap isolat bakteri.
2.5.2. Identifikasi Bakteri
Prosedur identifikasi isolat menggunakan Microbact
1. Specimen diinokulasikan ke media, inkubasi selama 18 - 24 jam.
2. lakukan uji oksidasi.
3. Ambil koloni tunggal yang sudah diisolasi dart kultur berumur 18 - 24 jam yang
ditumbuhkan pada media non selektif atau pun selektif. [Bila koloni terlalu keeil
atau pertumbuhannya terhambat, inokulasikan koloni ke dalam 3 ml larutan
pepton lalu inkubasikan pada suhu 35C selama 4 jam. Pindahkan 2 - 3 tetes
ke dalam 3 ml garam fisiologis.]
4. Siapkan suspensi isolat dalam 3 ml garam fisiologis steril, kocok hingga merata.
Hari
ke
Kultur Bakteri Konsistensi substrat
kekeruhan warna pH kekeruhan volume warna
0
1
2
3
4
5
6
7
"
14
2-8
5. Inokutasikan masing-masin sumur uji dengan 3 tetes atau 100 III suspensi
kultur sampai larlltan memenuhi setengah tinggi sumur tarutan.
6. Teteskan minyak mineral steril pada sumur:
7. Pada kultur dengan hasil uji oksidasi negatif, minyak diteteskan pada sumur
bertanda lingkaran hitam penuh.
8. Pada kultur dengan hasil uji oksidasi positif. minyak diteteskan pada sumur
bertanda lingkaran hitam putus-putus.
9. Inkubasi 18 - 24 jam Enterobacteriaceae atau 48 jam untuk berbagai basilus
gram negatif.
10. Cocokkan hasil tes dengan tabel warna. Tambahkan reagent yang sesuai pada
sumur dengan lingkaran hijau. Pastikan proses pembentukan wama terjadi
dengan sempurna.
2.5.3. Identifikasi Kapang
Prosedur identifikasi kapang secara sederhana dapat dilakukan dengan
mengamati morphologi kapang di bawah mikroskop, dan dibandingkan dengan buku
manual identifikasi kapang.
Daftar Pustaka
Sheehan, D. (ed). 1997. Methods in Biotechnology: Bioremediation protocols.
Humana Press, New Jersey.
2-9
III. PROTOKOL UNTUK MENENTUKAN KINETIKA BIOAVAILABILITAS
DAN BIODEGRADASIPOLUTAN CRGANIK TANAH DALAM SISTEM
TANAH UNTUK MENINGKATKAN BIOREMEDIASI TANAH YANG
TERPOLUSI
3.1. PENDAHULUAN
Kajian treatabilitas penting untuk mensukseskan implementasi teknologi
bioremediasi baik secara in situ maupun ex situ. Sedikit tempat terkontaminasi yang
identik dan hanya dapat diaplikasikan dalam jumlah yang terbatas. Beberapa veriabel
yang mempengaruhi keberhasilan proses bioremediasi yang merupakan fungsi dan
kondisi lingkungan. tipe kontaminan, dan media yang terkontaminasi. Protokol untuk
melakukan kajian treatabilitas diperlukan untuk mengevaluasi keefektifan substrat primer,
substrat tambahan. aseptor elektron dan modelnya untuk pemindahan elektron.
Pengetahuan tentang kinetika bioremediasi diperlukan untuk mengetahui
kemampuan teknologi bioremediasi in situ maupun ex situ. Kajian laboratorium untuk
menentukan kecepatan biodegradasi dapat digunakan sebagai uji penseleksian untuk
menentukan kecepatan dan keluasan bioremediasi yang mungkin dicapai selama
remediasi dan untuk menyediakan kriteria desain. Secara tradisional, kinetika
biodegradasi secara in situ telah ditentukan dengan menggunakan mikrokosm tanah. yang
sulit untuk. dimodelkan secara matematika. Kajian laboratorium meliputi reaktor slurry
tanah yang telah dilaporkan oleh Bachmann et a/. ( ). Kaplan dan Kaplan. Mihelcic dan
Luthy, dan Brunner et a/. ( ) Saat ini tidak ada metodologi yang sistematis untuk
menentukan kinetika biodegradasi kontaminan dalam sistem tanah yang padat.
Biodegradasi dalam tanah merupakan proses yang agak kompleks. yang meliputi
difusi kontaminan ke dalam matrik tanah yang berongga. adsorpsi ke permukaan tanah,
dan biodegradasi dalam biofilm yang ada pad a partikel tanah dan dalam pori yang besar,
dan juga dalam ikatan dan fase air bebas setelah desorpsi dari permukaan tanah. Dalam
reaktor slurry tanah, biodegradasi kontaminan terjadi dalam fase cair oleh mikroorganisme
dari matrik tanah dan oleh biofilm terimobilisasi pad a permukaan partikel tanah. Dalam
sistem tanah yang padat, biodegradasi t e ~ a d i dalam fase air bebas dan air terikat,
3-1
terutama oleh mikroorganisme tanah yang terimobilisasi dan kontribusi mikrobiota yang
tersuspensi dalam air. Kontribusi mikrobiota ini kedl karena kadar air yang rendah.
Bab ini lebih menitik beratkan kajian biodegradasi terhadap fenol, beberapa alkil
fenol (p-cresol, 2,4-dimetil fenol, katekol, hidroquinon, dan resorcinol), dan hidrokarbon
polisiklik aromatik (PAH) terseleksi (nafialena, fenantrena, acenafialena, dan
acenafiilena). Model matematika untuk slurry tanah, air, reaktor kolom atau tabung
berpori digunakan untuk menentukan difusivitas kontaminan dan kinetika biodegradasi
dalam slurry tanah dan sistem tanah yang padat. Informasi tentang difusivitas kontaminan
dan biokinetika dalam tanah dapat digunakan untuk mengevaluasi segala sesuatu yang
dapat dicapai pad a titik akhir untuk bermacam-macam teknologi treatment tanah, seperti
biotreatment slurry tanah, land farming, bioventing, atau bioremediasi in situ.
3.1.1. Fenol dan Fenol Tersubstitusi
Fenol merupakan salah satu komponen organik yang telah digunakan secara luas
secara terus menerus, dan merupakan unit struktur dasar untuk bermacam-macam
komponen organik sintesis, termasuk bahan kimia pertanian. Fenol dan fenol tersubstitusi
merupakan kontaminan yang ada di dalam tanah dan air. Keberadaannya dalam tanah
atau air mungkin disebabkan oleh degradasi pestisida dan bahan kimia lain yang
diaplikasikan secara sengaja terhadap tanah atau oleh pembuangan dengan sengaja dari
proses pabrikasi, produksi energi, dan prosedur penanganan limbah.
Fenol telah dilaporkan terdapat dalam limbah dari pembakaran dan konversi bahan
bakar fosil. Karena komponen fenolik merupakan fraksi yang signifikan dari komponen
organik terlarut dalam air yang ada dalam lim bah cair dari proses industri, maka
komponen ini penting dalam pengaturan pemilihan penanganan lim bah dan
konsentrasinya merupakan subjek dalam pengujian kualitas air. Komponen organik juga
menjadi perhatian, karena komponen ini lebih terlarut sehingga memiliki mobilitas yang
lebih tinggi pada permukaan tanah, tidak seperti komponen polisiklik. Teknik penanganan
untuk meminimalkan mobilitas dan bahaya dari limbah kimia beracun harus didasarkan
pada pengetahuan tentang komposisi polutan organik dan interaksi antara polutan
tersebut dengan zat organik tanah.
3-2
Diskusi yang lebih detail tentang literatur yang malatarbelakangi penyerapan dan
biodegradasi komponen fenol telah ditampilkan di muka. Hal ini telah disimpulkan bahwa
biodegradasi dalam bioremediasi tanah mungkin dihambat oleh faktor abiotik, seperti
penyerapan komponen pada partikel tanah dan oleh bahan organik.
3.1.2. Hidrokarbon Polisiklik Aromatik (PAH)
Sifat fisika dan kimia yang mempengaruhi interaksi antara PAH dengan tanah,
penting untuk mengevaluasi transporasinya dan secara kebetulan, komponen terse but
ada di dalam tanah dan sedimen, yang tidak dikarakterisasi atau dihitung. Penyerapan
diketahui sebagai faktor penting dalam menentukan faktor ketidaksengajaan dari molekul
hidrofobik terse but dalam sistem airlsedimen atau tanahlair. Pengalaman yang diperoleh
dari kajian terhadap remediasi tanah secara biologi menunjukkan bahwa biodegradasi
mungkin dihambat oleh faktor abiotik. Hal ini dianggap bahwa satu faktor yang
menyebabkan penurunan kemampuan biodegradasi komponen adalah penyerapan
terhadap partikel tanah dan bahan organik. Kemudian, kemampuan biodegradasi PAH
yang terserap dalam tanah mungkin berhubungan dengan keefektivan degradasi mikrobia!
dan juga terhadap perkiraan resiko toksikologi. Karena pengetahuan tentang faktor abiotik
terse but masih kurang, maka penting untuk menentukan karakteristik tanah yang
mempertahankan biodegradasi PAH dan untuk meneliti hubungan biodegradabilitas dan
biotoksisitas PAH yang terserap. Mekanisme dimana polutan seperti PAH memasuki air
tanah perlu dipelajari dan diidentifikasi, dan teknik sesuai untuk memperkirakan
perjalanannya dalam Iingkungan perairan perlu untuk dikembangkan. Karena sifat
hidrofobik PAH, penyerapan menjadi sangat penting dalam menentukan transportasinya
dan ketidaksengajaannya dalam sistem subpermukaan tanah. Diskusi yang lebih detail
tentang PAH, ketidaksengajaan dalam lingkungan, dan biodegradasi dalam tanah telah
disajikan di muka.
3.1.3. Penentuan Kinetika Biodegradasi Dengan Menggunakan Respirometri
8aru-baru ini, beberapa penelitian melaporkan penggunaan respirometri untuk
mengevaluasi kinetika biodegradasi polutan organik dalam tanah. Analisis respiromeri
3-3
terhadap biological oxygen demand (BOD) dalam jangka panjang telah dicoba untuk
kajian skala bench untuk memantaLi respirasi bak1eri secara kontinyu selama
pertumbuhan d a ~ a m campuran limbah organik dari air dan tanah yang terkontaminasi,
untuk memperkirakan potensial untuk menstimulasi biodegradasi limbah tersebut.
Informasi ini digunakan untuk membuat penentuan awal mengenai kebutuhan eksplorasi
bioremediasi lebih lanjut sebagai potensi teknologi remediasi yang digunakan pada tempat
yang terkontaminasi, sebelum pengujian skala pilot.
Kajian treatabilitas menggunakan respirometer elektrolitik dan biometer untuk
menentukan potensial biodegradasi minyak mentah (lumpur pengeboran, bahan yang
tertinggalltersisa, dan hidrokarbon berat) sebagai kontaminan pada tanah yang terpolusi.
Data treatabilitas menyediakan efisiensi biotreatment limbah petroleum dan digunakan
untuk memastikan waktu pembersihan (clean up) dengan bioremediasi.
Panggunaan radioisotop dalam kajian biodegradasi dapat meningkatkan
sensitifitas pengukuran biodegradasi dengan signifikan dan memperkirakan secara
realistis terhadap biodegradasi yang dapat dicapai dengan interferensi analitik yang
minimum dari matrik lingkungan, pada konsentrasi yang biasanya melebihi kisaran metode
screening. Produk biodegredasi mungkin dapat dihitung dengan menggunakan kombinasi
pembagian dan teknik deteksi radiokimia. Baru-baru ini, teknik ini dikembangkan untuk
pengukuran koefisien kinetika Monod, hasil mikrobial, dan koefisien kematian indogen,
melalui pengukuran kecepatan awal dalam durasi percobaan yang singkat dengan
menggunakan substrat yang radiolabel.
Aplikasi teknik substrat radiolabel baru-baru in; telah dikembangkan menjadi
penentu biodegradasi terhadap komponen organik dalam tanah. Teknik radiolabel
digunakan untuk mempelajari keberadaan pentaklorofenol (PCP) dan timbal klorida dalam
tanah, efeknya terhadap mikrobiota, dan kemampuan untuk mengembalikan kerusakan
terhadap berbagai tipe tanah, pada konsentrasi substrat yang berbeda. Kajian juga
dilaporkan pada determinasi kecepatan biomineralisasi komponen kimia dengan karbon
C-14 dalam minyak bumi tersuspensi secara aerobik dan anaerobik.
Pengembangan model biodegradasi terhadap polutan organik dalam tanah
adalah sulit, karena adanya beberapa faktor yang kompleks, meliputi :
1. Adanya difusi barier komponen, oksigen atau nutrien.dalam pori mikro dan
makrotanah
3-4
2. Pengaruh penyerapan kimia ke tanah lempung dan bahan humic.
3. Adanya bahan organik lain yang biodegradabele dalam tanah.
4. Perubahan pertumbuhan mikrobiota yang dihasilkan dari protozoa paras it
terhadap populasi biodegradasi.
5. Pengaruh kelarutan komponen pada fase cairo
6. Formasi biofilm pada perrnukaan tanah dalam hubungannya dengan kultur
tersuspensi.
7. Adanya mikrobiota tanah yang tidak teraklimatisasi.
Hampir semua model kinetika biodegradasi mengabaikan penyerapan kontaminan
pada partikel tanah, yang menunjukkan pentingnya pemindahan kontaminan. Secara
kinetika. penyerapan merupakan proses dua fase. dengan tahap awal yang cepat 1
jam) yang diikuti oleh fase panjang yang lebih lambat (hari). yang dikontrol oleh difusi
terhadap adsorpsi internal.
Tanah memiliki bermacam-macam ukuran pori, dengan kira-kira 50% dari total
volume pori memiliki pori dengan jari-jari < 1 mm. Hampir semua bakteri tanah berukuran
dari 0.5 sampai 0.8 mm, dan oleh karena itU, bagian yang signifikan dari tanah yang
mug kin tidak dapat diperoleh dari hampir semua bakteri.
Peranan agregat tanah dan pengaruh dari karakteristiknya terhadap bioremediasi
dalam tanah telah dianalisis dalam model bioremediasi agregat terkontaminasi (CAB).
Analisis sensitivitas model CAB menunjukkan pengaruh jari-jari agregat, koefisien
pembagi, dan konsentrasi awal kontaminan pada waktu tertentu dan mekanisme
remediasi. Kecepatan difusi sUbstrat dan kinetika peningkatan oksigen dan biodegradasi
terbukti mampu mengontrol mekanisme remediasi dalam agregat.
Keberhasilan proses bioremediasi terletak pada degradasi kontaminan organik dan
pada penurunan toksisitas dan potensial migrasi bahan berbahaya dalam tanah. Hasilnya
menunjukkan bahwa kinetika yang pertama menggambarkan hilangnya komponen fenol
dengan baik dan hilangnya kontaminan dalam bentuk fraksi terlarut da1am air lebih cepat
dibandingkan dengan bahan kimia yang sama dalam tnah. Labih lanjut, toksisitas fraksi
yang terlarut dalam air menurun deng2n konsentrasi dan tidak meningkatkan mobilisasi
dari bahan kimia yang dicoba, yang dipantau selama proses degradasi.
3-5
Berdasarkan pada penelitian awal terhadap kinetika bioavalabilitas dan biodegradasi
komponen fenolik dan hidrokarbon polisiklik aromatik. protokol multilevel yang sistematik
(ditunjukkan dalam Gambar 1) dikembangkan untuk mengevaluasi bioavailabilitas
(kesetimbangan dan kinetika penyerapanl desorpsi). pendekatan difusi kontaminan dan
peningkatan oksigen. dan kinetika biodegradasi polutan organik dalam sistem tanah yang
padat. Pendekatan ini meliputi penggunaan mikrokosm tanah dan tiga tipe respirometik
slurry tanah. air dan bioreaktor kolom dan tabung prous. Protokol ini dapat diaplikasikan
untuk tanah yang terkontaminasi. difusivitas dan kinetika biodedgradasi yang dieapai dari
model matematika yang dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi treatment tanah
yang terkontaminasi dengan menggunakan proses bioremediasi.
3.2. BAHAN
3.2.1. Karakterisasi Tanah
1. Tanah terseleksi untuk kajian ini adalah top soil yang tidak terkontaminasi (Faywood
silty loam, kemiringan 12-20 %, kelompok : baik, mesic; SUbgrup : typic Hapludalfs;
Order: Alfisols) dengan kelembaban tanah 17.5-20 % basis berat, densitas 1060
(gIL). kandungan total karbon 0.415 %, pH 6.65 dalam air distilata deionisasi dan pH
5.79 dalam CaCI
2
0.01 M.
2. Tanah dikeringkan dengan kering udara dan dilalukan pada sieve 2-mm.
3. Distribusi ukuran prtikel tanah yang terukur adalah sebagai berikut (J!m, wt %) : <2
J!m. 15.65 wt %; 2-10, 5; 10-20, 7.75; 20-75, 13.45; 75-150, 6.5; 150-300, 14.3; 300
600, 22.10; 600-1000, 16.25. Perhitungan rata-rata ukuran pertikel tanah adalah
0.0334 em.
4. Porositas partikel tanah, diukur sebagai porosimetri adsorpsi dan desorpsi nitrogen
(micrometries ASAP 200). adalah 0.03. Porositas tanah padat dalam reaktor tabung,
diukur sebagai densitas bulk, adalah 0.2.
3.2.2. Metode Analisis
Konsentrasi komponen kimia dalam contoh cair dianalisis deengan menggunakan
tiga metode : ekstraksi standar (metode EPA 604 dan 610) dengan metilen klorida yang
3-6

diikuti dengan anal isis -GC/MS; analisis HPLC; dan perhitungan pancaran sinar radiasi C
14 menggunakan komponen radiolabel. Ketiga metode analisis tersebut dikalibrasi
dengan menggunakan larutan standar. Data kalibrasi digunakan untuk mengkonversi
peak area (GC/MC atau HPLC) atau menghitung disintegrasi per-menit (OPM) kompponen
radiolabel menjadi konsentrasi larutan yang sebenamya. GC yang digunakan adalah
model HP-5890A yang membutuhkan detektor ionisasi cahaya (FlO). Kondisi berikut
digunakan untuk mengukur konsentrasi fenol : suhu awal oven adalah 60 OCt waktu
holding awal adalah 5 menit, kecepatan suhu oven adalah 8 C/menit. suhu akhir oven
adalah 280 OCt waktu holding akhir adalah 5 menit, temperatur injektor 225 c, suhu
detektor 310 OCt kecepatan gas (nitrogen) 35 mUmenit, kecepatan aliran gas detektor 32
mUmenit hidrogen dan 435 mU menit udara, gas pembawa (helium) 2 mUmenit, kolom
HP-5 gum meti! silikon dan ketebalan film 5 m x 1.53 mm x 2.54 mm dan softmware HP
Chemstation.
3.2.3. Persia pan tarutan Stok Kontaminan
Untuk fenol, buat 1.0 L atau lebih larutan fenol stok utama dengan konsentrasi 2.5
gIL fenol dalam air biaquades. Gunakan larutan stok utama, buat 50-200 mL larutan stok
percobaan dengan konsentrasi fenol 500 mglL atau 1 gIL, sesuai keperluan. Oalam kasus
PAH, tim bang masing-masing bahan kimia yang setara dengan 80 % standar kelarutan
dalam heksan. Larutkan bahan kimia yang telah ditimbang dalam heksan dengan
sempuma. Capai larutan standar yang mengandung 60, 40, 20 dan 10 % level kelarutan
standar dengan mengencerkannya dengan heksan. Gunakan HPLC kolom (Supelco LC
PAH 15 x 4.6 cm) untuk mencapai peak area untuk masing-masing larutan standar. Buat
plot peak area terhadap konsentrasi untuk mencapai kurva kalibrasi standar untuk
masing-masing bahan kimia. Untuk bahan kimia dengan kelarutan yang sangat rendah
1 ppm), gunakan komponen radiolabel dengan perhitungan pancaran sinar radiasi. Buat
larutan satndar dalam zat yang sarna dan kalibrasi dengan hitungan disintregasi per menit
(OPM). Buat larutan stok masing-masing bahan kimia PAH dengan pertama-tama
menimbang bahan kimia yang setara dengan kira-kira dua kali level kelarutan standar
dalam air. Campur bahan kimia dengan air yang ultra mumi menggunakan batang
magnetic stirer yang dilapisi dengan teflon selama 48 jam. Kemudian larutan didiamkan
3-7
selama 48 jam. Tuangkan larutan dan saring dengan menggunakan saringan milipore 5
)lm untuk menghilangkan semua partikel terJarut. A"alisis konsentrasi cairan dengan
menggunakan HPLC atau perhitungan pancaran sinar radiasi. Capai larutan stok yang lain
dengan mengencerkannya dengan air ultra mumi untuk mencapai larutan dengan level
kelarutan standar 80, 60, 40, 20, dan 10 %.
3.2.3. Persiapan Tanah Terkontaminasi
Dalam kasus fenol, tambahkan larutan stok fenol secara langsung ke'tanah pad a
saat mempersiapkan slurry tanah, wafer tanah, tabung porous, atau reaktor kolom tanah.
Dalam kasus PAH, yang terhambat pada kelarutan air yang rendah, larutkan komponen
PAH dalam aseton dan gunakan laritan aseton untuk mengkontaminasi tanah.
Khususnya, larutkan 700 mg naftalena dalam 0.5 L aseton. Cam pur aseton dengan baik
untuk memastikan naftalena yang ditambahkan yang terlarut sempuma. Diamkan 1 kg.
tanah yang tidak terkontaminasi dengan 0,5 L larutan aseton yang mengandung 700 mg
naftalena. Cam pur tanah pada saat penambahan larutan terkontaminasi. Semprotkan
tanah dan kemudian sebarkan pada permukaan yang inert dengan lapisan tipis dan
tinggalkan dalam ruang asam selama 24 jam untuk menguapkan aseton. Secara periodik
baliklah tanah untuk membuat permukaan menjadi segar selama periode 24 jam. Buat
empat contoh dari tanah sebelum dan setelah larutan kontaminan ditambahkan dan
tentukan konsentrasi naftalena dalam tanah dengan menggunakan prosedur ekstraksi
EPA.
3.2.4. Persiapan Larutan Stok Nutrien
Larutan nutrien yang digunakan dalam respirometer adalah medium sintetis OECD
yang mengandung bahan-bahan berikut dalam air biaquades : KH
2
P0
4
(85 mg/L), K
2
HP0
4
(217.5 mg/L). Na
2
HP0
4
.2 H
2
0 (334 mg/L), NH
4
CI (25 mg/L), MgS0
4
.7H
2
0 (22.5 mg/L),
CaCh (27.5 mg/L) dan FeCb.6H
2
0 (0.25 mg/L), MnS04-H
2
0 (0.0399 mg/L). H
3
B0
3
(0.0572 mg/L). ZnS04.7H20 (0.0:428 mg/L), (NH
4
)6MOJ024 (0.0347 mglL), FeCb.EDTA (0.1
mg/L) dan yeast extract (0.15 mg/L). Tanah digunakan sebagai sumber inokulum.
3-8
3.3. METODE
3.3.1. Pengukuran Adsorpsi Bakteri Tanah Secara Isotenn
1. tnkubasi mikrobiota tanah dengan fenol radiolabel dalam reaktor r-espirometrik
sampai kestabilan peningkatan oksigen tercapai, mengindikasikan bahwa semua
fenol te/ah dibiodegradasi menjadi biomass a C-14 dan CO
2
-14, yang diadsorpsi
dalam tarutan KOH.
2. Biarkan tarutan mengendap da/am 30 menit
3. Ambi/ sampet sebanyak 1 mL supematan dan ukur aktivitas C-14 nya dengan
perhitungan scintillation cair (Packard scintillation counter)
4. Tentukan kesetimbangan jumlah biomassa C-14 yang diadsorpsi ke dalam tanah
dengan subtracting persen C-14 dalam biomassa dalam suspensi dan persen C-14
sebagai karbon dioksida yang diadorpsi dalam larutan KOH dari total C-14 yang
ditambahkan di awal. Rasio biomassa teradsorpsi terhadap tanah dan persen
biomassa dalam suspensi yang memberikan parameter adsorpsi isoterm
biomassa/tanah.
3.3.2. Reaktor Mikrokosm Tanah
Metodologi untuk membuat reaktor mikrokosm dalam skala bench, meliputi
konfigurasi realdor dan deskripsi kebutuhan yang mendukung, tidak diganggunya lubang
sampling tanah yang dimasukkan ke dalam mikrokosm. prosedur untuk mengkontaminasi
lapisan tanah dengan seri homolog komponen organik, deskripsi aplikasi nutrien, dan
operasi realdor mikrokosm (analisis penurunan CO
2
dan analisis kimia terhadap sampel
tanah dan realdor lumpur untuk komponen induk dan metabo/it) lelah dideskripsikan
dengan jelas pada bagian yang lain. Skema realdor mikrokosm tanah ditunjukkan pada
Gambar 2. Reaktor mikrokosm merupakan kotak persegi panjang yang kedap udara
dengan ukuran 50 x 30 x 30 em, yang terbuat dari bahan gelas (kaca) dan didukung oleh
panel stainless steel. Nutrien dan kontaminan yang diduga disemprotkan dari atas
dengan menggunakan penyemprot atom cairo Pada dasar reaktor dilengkapi dengan
suatu sisi untuk memberikan drainase pada lumpur. Pengotrolan terhadap kecepatan
3-9
aliran karbon dioksida sebagai udara bebas yang dialirkan metalui reaktor dan gas
buangan adalah dengan menghitung gelembung yang melalui larutan potasium hidroksida
untuk mengetahui kecepatan evolusi rata-rata karbondioksida dalam reaktor.
Masing-masing reaktor mikrokosm menunjukkan pengontrolan setempat. yang pada
akhirnya menyeleksi aklimatisasi populasi mikrobial indogen dalam tanah untuk
mengkontaminasi bahan organik. Sampel tanah kemudian diambil dari reaktor mikrokosm
dan digunakan sebagai sumber inokulum mikrobial teraklimatisasi untuk mengukur
peningkatan oksigen secara cepat dengan menggunakan met ode respirometri ; kinetika
penurunan karbon dioksida dalam reaktor shaker flask; dan untuk mempelajari sistem
reaktor tanah yang lain. Unit reaktor mikrokosm juga digunakan secara langsung untuk
mengevaluasi biodegradabilitas polutan organik dan untuk mengukur kecepatan
biodegradasi rata-rata secara lengkap, tanpa menggangu lapisan tanah.
8eberapa reaktor mikrokosm dikontaminasi dengan campuran komponen fenol yang
dilarutkan dalam air biaquades sehingga total chemical oxygen demad (COD) per kilogram
tanah dalam rekator mikrokosm mencapa 300 mg. Konsentrasi fenol, resorcinol, katekol,
2,4-dimetil fenol, cresol dan hidroquinon yang setara digunakan dalam campuran.
Reaktor mikrokosm yang lain dikontaminasi dengan 25 ppm dari masing-masing PAH
yang dilarutkan dalam campuran air biaquades dengan 0.5 % larutan surfaktan, Triton X
100. Reaktor mikrokosm kontrol merupakan sistem tanah yang tidak dikontaminasi, yang
hanya disemprot dengan air biaquades dengan jumlah yang setara dan reaktor yang
dikontaminasi dengan 0.5 % larutan surfaktan, Triton X-100.
3.3.3. Kajian Adsorpsi
1. Keringkan tanah secara alami dengan udara dan kemudian ayak dengan
menggunakan ayakan dengan diameter lubang 2.00 mm.
2. Gunakan botol yang distriffer dengan baik secara batch dalam suhu ruang yang
konstan untuk kajian ini.
3. Tempatkan 10 gram sampel tanah dalam masing-masing boto' dan campur dengan
100 mL air biaquades yang mengandung konsentrasi komponen dan timbal klorida
yang bervariasi untuk meminimalkan biodegradasi. Rasio tanah : larutan
3-10
menunjukkan massa equivalen adsorben kering oven dalam gram per volume
larutan.
4. Ambil sampel setelah 2, 4,8,10,12,14,16,18,20, dam 24 jam
5. Sentrifuse isi botol dan ambil sampel cair dengan menggunakan syringe yang
dihubungkan dengan membran filter penahan yang terbuat dari perak dengan
ukuran pori 0.45 j..lm. Filter menahan partikel tanah agar tidak masuk ke dalam
sampel.
6. Analisis sampel cair dengan menggunakan analisis HPLC, analisisGC/MS dan
perhitungan pancaran cahaya radisi untuk komponen yang radiolabel (lihat Catatan
1.).
7. Capai jumlah komponen yang teradsorpsi dalam tanah dengan mengurangi jumlah
total awal dengan jumlah komponen yang ada dalam fase cair (lihat Catalan 2).
3.3.4. Kajian Desorpsi
1. Cam pur 100 mL air biaquades dengan 20 9 tanah dan konsentrasi awal bahan kimia
tertentu, seperti dalam kasus adsorpsi.
2. Setelah kesetimbangan adsorpsi tercapai (Iihat Catatan 2), tambahkan 100 mL air
biaquades yang mengandung 2 gIL timbal klorida untuk menghambat biodegradasi
(lihat Catalan 3).
3. Ambil 20 mL sampel dengan menggunakan syringe pada jam ke-4, 8, 16, 24, 48, 72,
96, dan 120, masing-masing sampel diambil dari botol yang terpisah dan disaring
dengan filter yang berukuran 0.45 j..lm.
4. Analisis konsentrasi komponen dalam sampel cair dengan menggunakan ekstraksi
metilen klorida yang diikuti oleh analisis GCIMS atau HPLC. Analisis perhitungan
pancaran sinar radiasi C-14 mungkindapat digunakan untuk komponen yang
radiolabel (lihat Catatan 1).
3.3.5. Teknik Rasiokimia Untuk Menentukan Biodegradasi OrganikOalam Tanah
1. Siapkan reaktor percobaan dan reaktor kontrol dalam respirometer.
2. Tambahkan 1 mL komponen radiolabel C-14 (konsentrasinya setara dengan 1
j..lCi/mL) untuk masing-masing reaktor percobaan dan kontrol. Satu j..lCi selara
dengan 2.22 x 10
6
DPM.
3-11
- - - - - - - - - - - - - ~ ' - - - - - . . . ; ; ; , . . . . . . - ' - - ~ - - - - : . . : . . . . - -
3. Tambahkan 5 mL larutan KOH 2 N setelah wakttu aklimatisasi yang diperkirakan,
berdasarkan pada komponen yang akan dipelajarL Tambahkan 5 mL larutan KOH 2
N segar untuk melanjutkan adsorpsi CO
2
-14.
4. Campur 5 mL sampel KOH deengan larutan cocktail (Ultima Gold) dengan
perbandingan 1 : 10 (1 mL KOH dengan 9 mL larutan coctail). Analisis sampel
dengan menggunakan perhitungan pancaran sinar radisi cairan (Packard TRI-CARB
2500 TR Uquid Scintillation Analyzer).
3.3.S. Kajian Bioreaktor Respirometrik
Konsentrasi tanah terseleksi dalam reaktor labu bervariasi dari 2 sampai 10 %
basis berat, menggunakan berat kering tanah sebagai basis. Total volume slurry dalam
labu adalah 250 mL Tiga tipe bioreaktor digunakan untuk menentukan parameter kinetika
mikrobiota tersuspensi dan terimobilisasi dan parameter pendukung dari kontaminan dan
oksigen dalam matrik tanah. Ketiga tipe reaktor tersebut adalah :
1. Bioreaktor slurry, dimana konsentrasi tanah adalah 5 % slurry yang dicampur
dengan kontaminan dengan cepat, dilarutkan dalam air bersama dengan nutrien.
2. Reaktor wafer, dimana lapisan tipis wafer tanah didiamkan bersama dengan
kontaminan dan nutrien yang terlarut dalam air, untuk mencapai kelembaban total
tanah 50 %
3. Reaktor kolom atau tabung berpori, dimana tanah disaring dengan kontaminan yang
dipadatkan dalam tabung gelas yang berpori atau kolom dengan kelembaban yang
hampir sama dengan reaktor wafer.
Skema reaktor slurry tanah, wafer, tabung berpori dan kolom ditunjukkan dalam
Gambar 3 dan 4. Dalam reaktor slurry tanah, tidak ada pendekatan oksigen yang
berdifusi secara bebas ke dalam slurry yang diaduk dengan baik dan nutrien yang terlarut
dalam fase cairo Oleh karena itu, kecepatan biodegradasi dalam reaktor slurry tanah
tergantung pada kecepatan biokinetika intrinsik, konsentrasi mikroorganisme dalam matrik
tanah dan diffusivitas yang melekat pada kontaminan. Dalam reaktor wafer tanah, difusi
bebas oksigen melalui matrik tanah yang tipis, dan oleh karena itu, kecepatan
biodegradasi dikontrol oleh kandungan wafer sebagai tambahan parameter intrinsik yang
3-12
lain, seperti dalam kasus reaktor slurry tanah. Dalam reaktor kolom atau tabung berpori,
kecepatan biodegradasi dikontrol oleh kandungan air dan difusivitas oksigen dan
parameter biokinetika intnnsik yang lain. Reaktor kolom atau tabung berpori memberikan
perkiraan kecepatan biodegradasi yang lebih baik untuk bioremediasi in situ dari pada
reaktor wafertanah dan slurry tanah.
3.3.7. Reaktor slurry tanah
1. Campur 25 gram tanah yang telah didiamkan dengan 250 mL air biaquades,
nutrien OECD dan 7 mL inokulum (lihat Catatan 4) dan shaker flask dengan
menggunakan batang stirrer yang dilapisi dengan teflon. Lakukan secara duplo
(buat duplikasinya) untuk meyakinkan reproducibilitasnya.
2. Siapkan reaktor kontrol yang mengandung 25 gram tanah yang tidak
terkontaminasi dengan 250 mL air biaquades, nutrien OECD dan 7 mL inokulum
(Iihat Catatan 4) dan shaker flask.
3. Hubungkan tabung (flask) dengan respirometer ycmg mengukur peningkatan
oksigen kumulatif dan penurunan karbon dioksida secara terus menerus (lihat
Catatan 5).
Dalam kasus fenol. 20 gram tanah yang tidak terkontaminasi dicampur dengan 250
mL air biaquades dan 2.5-10 mL larutan stok percobaan untuk menghasilkan konsentrasi
fenol yang diinginkan dalam tiap-liap tabung (flask).
3.3.8. Reaktor wafer tanah
1. Campur 25 g tanah yang telah didiamkan dengan 250 mL air biaquades, nutnen
OEDC dan 7 mL inokulum (Iihat Catatan 4) dan shaker flask dengan menggunakan
batang stirrer yang dilapisi dengan teflon.
2. Biarkan air dalam tabung (flask) menguap sampai kelembaban lanah yang
diinginkan tercapai.
3. Tempatkan tanah dalam reaktor flask sebagai lapisan tipis (Iihat Catatan 6).
3-13
4. Kontaminasi tanah dengan !arutan stok komponen dan aduk tanah dengan batang
geJas untuk meyakinkan komposisi yang seragam.
5. Biarkan keJebihan air menguap pada suhu ruang untuk mencapai kelembaban yang
diinginkan.
6. Set reaktor kontrol tanpa kontaminan (seperti langkah 4 dan 5).
7. Hubungkan tabung (flask) dengan respirometer.
Dalam kasus fenol, 20 gram tanah yang tidak terkontaminasi dicampur dengan 20
30 mL air aquabidest ditempatkan dalam reaktor flask dan teJah tercampur dengan baik
untuk membenkan konsentrasi biomassa yang seragam dalam matrik tanah. Wafer dari
reaktor flask diuapkan pada suhu ruang sampai kandungan air daJam tanah yang
diinginkan tercapai. Wafer tanah dikontaminasi dengan 2.5-10.0 mL larutan stok
percobaan, tergantung pada konsentrasi yang diinginkan, dan wafer tanah dicampur
dengan syringe needle ketika larutan stok diinjeksikan.
3.3.9. Reaktor kolom tanah
1. Campur 100 9 tanah yang telah didiamkan dengan nutnen OECD, dan 28 mL
inokulum (Iihat Catatan 4) dan shaker flask dengan menggunakan batang stirrer
yang dilapisi dengan teflon.
2. Biarkan air dalam tabung (flask) menguap sampai kelembaban tanah yang
diinginkan tercapai.
3. Masukkan tanah ke dalam tabung gelas berpori atau dalam labu (flask) sebagai
kolom (lihat Catatan 7).
4. Kontaminasi tanah dengan Jarutan stok komponen dan aduk tanah dengan batang
kaca untuk meyakinkan komposisi yang seragam.
5. Biarkan kelebihan air menguap pada suhu ruang untuk mencapai kelembaban yang
diinginkan.
6. Set reaktor kontrol tanpa kontaminan (seperti langkah 4 dan 5).
7. Hubungkan tabung (flask) dengan respirometer.
3-14
Dalam kasus fenol, tabung gelas berpori yang digunakan terbuat dari gel as vycor,
dengan diameter pori rata-rata 40 nm. Ukuran pori ini dipilih karena ukuran pori ini terbukti
paling baik untuk menahan semua tanah dan air dalam tabung berpori ketika dialirkan
oksigen dari udara bebas. Dalam kasus ini, tabung gelas tidak mempengaruhi hasil
peningkatan oksigen yang diperlukan untuk percobaan, tabung gelas ini hanya digunakan
untuk mendukung tanah selama proses kontaminasi dan biodegradasi. Percobaan
dengan tabung ini membiarkan degradasi bahan kimia dilakukan mikroorganisme tanah
secara menyeluruh terhadap tanah yang terkontaminasi agar disimulasi pada kondisi yang
iebih tertutup.
Kinetika adsorpsi dan desorpsi abiotik kontaminan ke dalam matrik tanah dan data
peningkatan oksigen yang dicapai untuk reaktor slurry tanah, wafer tanah, dan kolom
digunakan dalam hubungannya dengan model matematika yang mendetail untuk
memberikan parameter biokinetika dan transportasi intrinsik. Protokol yang digambarkan
dalam bab ini diaplikasikan untuk fenol, alkif fenol, dan PAH, dan hasil yang telah dicapai
disajikan dalam tulisan yang lain. Respirometer elektrolitik termodifikasi (didiskusikan
dalam tulisan yang baru) digunakan untuk memonitor peningkatan oksigen dan penurunan
karbon dioksida secara kontinyu. Sebagai tambahan, kontaminan yang radiolabel
digunakan untuk memperkuat peningkatan oksigen dari kontaminan daripada yang
dihasilkan dari respirasi tanah secara normal.
3.4. CATATAN
1. HPLC memiliki manfaat yang jelas yang tidak membutuhkan ekstraksi dengan pelarut,
seperti dalam kasus analisis GC/MS. Meskipun demikian, metode HPLC tidak cukup
sensitif untuk fase cair dengan konsentrasi di bawah 1 ppm. Ekstraksi pelarut
membutuhkan waktu yang cukup lama, menggunakan jumlah pelarut yang berlebih,
biasanya tidak dapat menghasilkan pemumian komponen sampai 100 %.
Perhitungan pancaran sinar radiasi C-14 membutuhkan komponen yang bersifat
radiolabel tetapi dapat digunakan dengan cepat dan mudah. Meskipun demikian,
jumlah komponen C-14 yang tersedia terbatas dan mahal. Lebih lanjut, metode
perhitungan pancaran sinar radiasi menghasilkan turunan limbah radioaktif yang
3-15
membutuhkan penanganan yang lebih. Untuk fase cair dengan konsentrasi di bawah
1 ppm, perhitungan pancaran sinar radiasi C-14 merupakan metode yang lebih
disukai. Untuk konsentrasi yang lebih tinggi dan untuk komponen dengan koefisien
partisi oktanol-air yang rendah, HPLC lebih baik digunakan daripada ekstraksi dengan
pelarut organik dan analisis GC/MS. Dalam kajian ini, hasil dari ketiga metode
analisis yang ditetapkan sebagai anal isis yang tertutup.
2. Kesetimbangan didefinisikan sebagai tempat dimana konsentrasi cairan yang dicapai
berada pada nilai yang stasioner, yang biasanya dicapai dalam waktu 24 jam. Data
kesetimbangan digunakan untuk mendapatkan parameter isoterm Freundlich.
3. Awalnya, fase' cair dituang setelah sentrifugasi, dan kemudian air aqua bides
ditambahkan untuk membiarkan komponen diserap dari tanah. Meskipun demikian.
hal ini telah terbukti, setelah sentrifugasi, fase air mengandung partikel koloid yang
memiliki sejumlah kompopnen teradsorpsi yang signifikan. Oleh karena itu
diusahakan untuk menggunakan filter dengan ukuran pori yang lebih kecil, yang
membutuhkan gradien tekanan yang besar untuk memberi tenaga agar cairan dapat
melaui filter.
4. Set beberapa shaker flask. masing-masing terdiri dari 100 9 tanah dari reaktor
mikrokosm yang telah diaklimatisasi, dan campur dengan 1 Lair aquabides yang
mengandung 4 mL sludge teraktivasi sekunder dan nutrien OECD. Inokulum diambil
dengan mengambil sejumlah volume slurry yang tetap dari shaker flask.
5. Percobaan terhadap slurry tanah memberikan wawasan tentang degradasi
kontaminan dalam kedua fase tanah dan cairo Bakteri dan kontaminan berdifusi dari
fase tanah ke fase cair sampai mencapai kesetimbangan. Peningkatan oksigen
kumulatif dan penurunan karbon dioksida dikontrol oleh difusi dan transpor
kontaminan dari dalam partikel tanah ke larutan.
S. Seperti pada sistem slurry, air yang ada dalamreaktor wafer adalah sangat kecil dan
stasioner, yang meningkatkan konsentrasi kontaminan dan menurunkan transfer
massa dalam fase cairo Peningkatan oksigen dan penurunan karbondioksida sangat
dipengaruhi oleh perbedaan tersebut.
7. Reaktor kolom tanah mirip dengan reaktor tabung berpori karena reaktor ini
membiarkan oksigen rnempengaruhi kecepatan biodegradasi dalam sistem tanah
yang padat untuk dikaji. Alasan menggunakan kolom tanah untuk kajian PAH
3-16
terutama disebabkan oleh sistem tabung berpori dapat digunakan jika jumlah tanah
yang harus dianalisis kecil, khususnya < 30 g. Jika komponen menunjukkan kelarutan
dalam air yang kecil, seperti PAH, maka harus dipelajari jika air jenuh dibiarkan
dengan kontaminan sehingga menghasilkan konsentrasi kontaminan yang rendah
dalam tanah. Lebih lanjut, konsentrasi kontaminan yang rendah dapat digunakan
untuk mencegah efek penghambatan. Jika konsentrasi kontaminan dalam tanah
rendah, kelebihan tanah digunakan dalam reaktor untuk mencapai peningkatan
oksigen kumulatif yang signifikan daripada reaktor kontrol yang berisi tanah yang tidak
terkontaminasi. Oleh karena itu, reaktor kolom tanah dikembangkan, dim ana jumlah
tanah yang lebih besar secara' signifikan (Iebih dari 30 g) dapat diuji sebagai
pembanding terhadap reaktor tabung berpori.
Dafta Pustaka
Cookson, J.T. 1995. Bioremediation Engineering: Design and Application. McGraw-Hili,
Inc., Toronto.
Sheehan, D. (ed). 1997. Methods in Biotechnology: Bioremediation protocols. Humana
Press, New Jersey.
3-17
IV. PENGU..IIAN BIODEGRADASI MINYAK BUMI
4.1. PENGUJIAN BIODEGRADASI LlMBAH MINYAK BUMI OALAM AIR
Percobaan ini bennaksud menguji aktivitas mikroorganisme dalam mendegradasi
minyak bumi. Oalam hal ini digunakan kultur campuran untuk mendegradasi minyak
bumi dalam air pada suhu kamar dengan kondisi aktif (dikocok) selama 24 jam.
Peralatan
1. Inkubator pengocok
2. Inkubator
3. Autoklaf
4. Rotary evaporator
5. Eksitkator
6. Alat-alat gelas
7. Instrumen penguji minyak
Bahan
1. Nutrient broth (NB) untuk medium uji di Erlenmeyer
2. Agar nutrient broth (NBA) untuk medium penanaman mikroorganisme di cawan
petri
3. Minyak bumi steril
4. Akuades steril
Prosedur kerja
Kegiatan ini dilakukan dalam kondisi aseptic
1. Siapkan media NB pada Erlenmeyer kapasitas 250ml. NBA dalam cawan petri
dan akuades dalam tabung reaksi. Erlenmeyer diisi dengan 100ml medium,
cawan petri diisi 10 ml medium, dan tabung diisi 9 ml akudes.
2. Sehari sebelum dilakukan pengujian lakukan pengaktifan kultur campuran
dalam medium dan kondisi yang sarna untuk pengujian serta dikocok dalam
incubator pengocok.
3. Ke dalam 4 erlenmeyer yang telah berisi media yaitu P1 sampai P4 masukkan
kultur campuran yang telah diaktifkan masing-masing sebanyak 5 ml.
4-1
4. Setelah diaduk merata dari Erlemeyer P1 dan P2 masing-masing diambil 1 ml
untuk dimasukkan ke dalam 9ml akuades pada tabung reaksi. Hal inidilakukan
bertahap untuk pengenceran. Masing-masing pengenceran diambil 0.1 ml
inokulasikan ke dalam medium cawan petri selanjutnya diinkubasikan. Hal ini
untuk melihat populasi pada jam ke O.
5. Masukkan 2ml minyak bumi masing-masing ke dalam Erlenmeyer P1 sampai
dengan P4 serta Erlenmeyer lain yang telah berisi medium yaitu Erlenmeyer K 1
dan K2.
6. Erlenmeyer P1, P2, K1 dan K2 diinkubasikan dalam incubator pengocok pada
suhu kamar selama 24 jam.
7. lsi Erlenmeyer P3 dan P4 masing-masing diekstrak dengan menggunakan
metode kerja penentuan minyak dalam air secara gravimetric. Hal ini untk
menentukan Kadar karbohirbon pad a jam ke O.
8. Setelah inkubasi 24jam. dari P1 dan P2 secara hati-hati (minyak jangan sampai
terbawa) diambil1 ml medium dan selanjutnya dilakukan kegiatan seperti pada
butir 4. Kemudian isi P1, P2, K1 dan K2 diekstrak dan selanjutnya dilakukan
kegiatan seperti prosedur butir 7. Dari sini akan diperoleh data kandungan
hidrokarbon dan populasi pada jam ke 24.
Perhitungan
Dari hasil pengujian ini dapat dihitung koefisien laju pertumbuhan kultur yang diuji
dan besamya biodegradasi. Dasar perhitungan dapat ditentukan dengan rumus
berikut:
1. Koefisien laju pertumbuhan ( ~ )
~ = 2.3ft log (alb)
dimana t = waktu inkubasi
b = jumlah populasi setelah tx
a = jumlah populsi pada to
4-2
2. Persentase biodegradasi (PB)
(M1-M2) - (S1-S2)
PB =------x100%
M1
Dimana M1 = total hidrokarbon jam ke 0 (mgll) dalam kondisi steril
M2 = total hidrobarbon jam ke x (mgll) dalam kondisi steril
S 1 =total hidrokarbon jam ke 0 (mgll) dalam kondisi non steril
S2 =total hidrokarbon jam ke x (mg/l) dalam kondisi non steril
4.2. PENENTUAN MINYAK DALAM AIR SECARA GRAVIMETRI
Prinsip
Penentuan minyak dalam air didasarkan pada kelarutannya dala kloroform. Minyak
yang terlarut atau teremulsi dalam air dapat diekstraksi dengan kloroform. Setelah
ekstraksi pelarut diuapkan, dan minyak daoat ditentukan secara gravimetric.
Bahan
1. HCl 1: 1 dalam akuades
2. Kloroform
3. Sodium sulfat anhidrat
Peralatan
1. Corong pemisah 500 ml
2. Labu didih 100ml, 250ml
3. Rotary evaporator
4. Kertas saring
Prosedur kerja
1. Dalam 100ml contoh yang mengandung minyak tambahkan 5ml HC11:1 dalam
akuades sampai pH 2
4-3
2. Pindahkan *e corong pemisah, bilas botol contoh dengan 30 ml kloroform,
kemudian masukkan ke dalam corong pemisah
3. Kocak corong pemisah selama 2 men it, kemudian biarkan ke dua fasa terpisah
4. Keluarkan kloroform dan lewatkan melalui kertas saring yang diisi dengan 1
gram Na2S02 anhidrat dan ditampung dalam labu didih.
5. Lakukan kembali ekstraksi 2 x 30ml dengan kloroform, setelah ekstraksi, botol
contoh dibilas dengan pelarut.
6. Satukan hasil ektraksi ke dalam labu didih di atas
7. Cuci kertas saring dengan 10-20 ml petarut
8. Uapkan pelarut dalam rotary evaporator pada suhu 70C.
9. Masukkan dalam incubator suhu 100C selama 15menit dan kemudian simpan
di eksikator selama 30 menit, dan timbang sampai be rat konstan.
10. Perbedaan penimbangan menunjukkan berat minyak bumi.
Perhitungan
(x-y)
Berat minyak bumi (mg/l) = ----x 1000
ml contoh
x = Berat labu didih + minyak (gram)
y =Berat labu didih kosong (gram)
Daftar Pustaka
Arnold E. Greenberg, at sl., 1992. Standar methods for the examination of water and
wastewater, 18
th
-ed.
Udiharto, M. 1996. Bioremediasi Minyak Bumi. Prosiding Pelatihan dan Lokakarya
"Peranan Bioremediasi dalam Pengelolaan Lingkungan-, Cibinong 24-28 Juni
1996. LlPI-BPPT-HSF.
4-4
V. SIMULASI PENGUJIAN TREATABILITAS LABORATORIUM UNTUK
MEMPERKIRAKAN KESIAPAN LAHAN
Pad a simulasi pengujian treatabilitas memberikan gambaran yang dilakukan
sebelum implementasi di lapangan, mendiskusikan pengujian laboratorium yang
lebih kompleks, dan menghadirkan beberapa studi kasus dari tipe treatabilitas yang
berbeda untuk memberi contoh kebutuhan mereka sebagai langkah awal pada
implementasi pada skala penuh. Studi kasusini menunjukkan kebutuhan
pelaksanaan pengujian laboratorium yang relatif murah sebelum mengawali operasi
di lapangan yang mahal.
5.1. EVALUASI TREATABILIT AS
Bagian ini mendiskusikan metodologi dan pendekatan umum yang diikuti
selama pengembangan pengujian treatabilitas untuk memeperkirakan implementasi
teknologi yang spesifik. Tujuan dari evaluasi treatabilitas adalah untuk membangun
antisipasi proses yang dapat diterapkan untuk membersihkan suatu tempat. Hal ini
mencakup karakterisasi bahan untuk parameter kimia dan mikrobiologi dan
optimalisasi proses untuk mencapai standar kebersihan yang diinginkan pada
interval waktu yang sing kat. langkah-Iangkah evaluasi treatibilitas: rencana k e ~ a ,
evaluasi latar belakang permasaJahan, perencanaan sampling, sampling. dan
analisis sample. analisis data, dan laporan akhir
Rencana kerja merangkum semua aktifitas proyek yang disiapkan untuk
perizinan oleh kHen danlatau agen pengatur yang tepat sebelum memulai pekerjaan.
Rencana kerja meliputi rencanasampling, desain percobaan dan kebutuhan analitik
dan program quality assurance untuk evaluasi biotreatabilitas.
Biasanya, latar belakang data mengenai tanah di suatu tempat, keberadaan
kontaminan, dan sejarah operasi disediakan sebelum pengujian treatabilitas.
Tinjauan tantang ketersediaan data dipilih untllk membiasakan orang-orang dalam
5-1
proyek dengan data yang ada dan untuk mengidentifikasi perbedaan informasi dan
keperluan pertimbangan untuk mengevaluasi teknik remediasi.
Sampel tanab dan/atau air untuk evaluasi biotreatabilitas dikumpulkan setelab
dilakukan tinjauan terhadap data pendabuluan. Rencana sampling diperlukan untuk
mengindentifikasi sampel yang mewakili kontaminan yag menjadi perhatian.
Rencana sampling dikhususkan pada area dimana sam pel yang mewakili akan
dikumpulkan untuk kajian tipe treatabilitas yang dipilih.
Sampel dari suatu tempat mula-mula dianalisis untuk memberikan data fisik,
kimia dan mikrobiologi dasar. Ada beberapa tujuan untuk dicapai dalam
melaksanakan analisis ini. Pertama adalah untuk menentukan tipe dan konsentrasi
kontaminan yang ada dalam sampel yang akan digunakann untuk memperkirakan
biotreatabilitasnya. Hal ini penting untuk memperkirakan konsentrasi awal yang
akurat dari kontaminan yang ada dalam sampel yang dikaji untuk mengevaluasi
reduksi level kontaminan. Tujuan lain adalah untuk menentukan jika nutrien, seperti
nitrogen dan fosfor, ada dalam konsentrasi yang cukup untuk mendukung
peningkatan aktivistas mikroba. Analisis dilaksanakan untuk mengevaluasi
parameter yang mungkin dapat menghambat aktivitas mikroba (sebagai contoh.
konsentrasi logan, pH dan lain-lain yang tinggi). Analisi fisika dan kimia dirangkum
dalam Tabel 5.1.
Pada penyelesaian kajian treatabilitas, laporan akhir disiapkan secara garis
besar untuk semua i1mu yang ditemukan dan data yang mendukung. Metode yang
digunakan untuk memperkirakan keberadaan biodegradasi yang potensial pada
suatu tempat diterangkan secara te:-perici. Tipe informasi di bawah ini didukung oleh
data laboratorium di antaranya :
1. Keberadaan level aktivitas mikrobial dalam sampel yang diambil dari suatu
tempat
2. Keberadaan potensial biodegradasi kontaminan di dalam sam pel yang
diambil dari suatu tempat
5-2
3. Oiskusi tentang rencana remediasi berdasarkan pada evaluasi pada skala
bench.
Ookumen ini biasanya digunakan sebagai landasan untuk menyiapkan
rencana tindakan remediasi (remedial action plan / RAP), dimana garis besar
langkah menjadi acuan implementasi pada skala penuh.
Tabel 5.1. Analisis Fisika dan Kimia
Parameter Fisika
Analisis ukuran pasir
Porositas
Kelembaban
Oensitas, di tempat dan partikel
Permeabilitas
Kadar air
Reologi. viskosotas, % padatan
Analisis Kimia
Parameter Anorganik
pH
Oksigen terlarut
Temperatur
Chemical oxygen demand (COD)
Total padatan terlarut
Kation utama
Anion utama
Fosfat
Kekerasan
Alkalinitas
Kondukstivitas elektrik
Parameter Organik
Total Organic Carbon (TOC)
Biochemical Oxygen Demad (BOO)
Total Petroleum hydrocarbon (TPH)
Kontaminan target
5-3
5.2. METODA PENGUJIAN TREATABILITAS
Karakterisasi bahan di bawah ini, satu atau lebih pengujian skala-bench
dilakukan untuk menentukan potensial penggunaan teknik biodegradasi pada suatu
tempat. Pada interval yang tetap selama periode inkubasi, aktivitas mikrobial
diperkirakan dengan pengujian mikrokopis atau teknik hitunya standar yang lain.
Biodegradasi kontaminan dimonitor dengan teknik analisis yag tepat. Untuk
mengevaluasi penurunan hidrokarbon petroleum, sebagai contoh. digunakan
spektroskopi infra merah (infrared spectroscopy fiR) dan kromatografi gas (GC).
Peningkatan biodegradsi kontaminan dengan penambahan nutrien dievaluasi
dalam seri pengolahan dalam laboratorium m ikrokom is. Seleksi terhadap pilihan
pengolahan yang tepat ditentukan oleh hasH evaluasi kimia dan mikrobiologi.
Contoh evalusl pengolahan khusus adalah :
1. Tanpa pengo/ahan (kontrol). Pengolahan ini mnegukur kecepatan populasi
mikroba yang ada yang dapat mendegradasi kontaminan pad a kondisi
oksigenasi yang baik tanpa penambahan nutrien tambahan.
2. Pengaturan Nutrien Anorganik. Jika evalusi kimia memberi kesan bahwa
nitrogen dan fosfor ada pada konsentrasi minimum untuk pertumbuhan.
maka konsentrasi nutrien ini diatur untuk menyediakan rasio C:N:P yang
optumum. Pengolahan ini akan menentukan berapa kecepatan pembersihan
kontaminan dapat ditingkatkan dengan mengoptimalkan rasio ini.
3. /noku/asi. Jika evaluasi mikrobial dasar menunjukkan bahwa aktivitas alami
mikrobial yang t e ~ a d i dalam sampel tanah dan air tanah tidak mencukupi
kebutuhan untuk meningkatkan degradasi kontaminan, maka limbah perlu
diinokulasi dengan mikroorganisme yang telah diketahui dapat mendegradasi
kontaminan target pada suatu tempat. Evaluasi ini akan menentukan apakah
kecepatan pembersihan kontaminan dapat ditingkatkan oleh inokulasi
mikroba.
5-4
4. Kontrol steril. Pengolahan kontrol steril didesain untuk menentukan
pengaruh proses amotik, seperti penguapan, konsentrasi kontaminan.
Metode yang tepat untuk sterilisasi sampel dipilih setelah meninjau data
kimia dasar.
Metoda pengujian treatbilitas pada umumnya dibagi dalam 3 cara sesuai dengan
maksuda dan tujuannya, yaitu kajian labu erlemeyer, kajian nampan, dan kajian
kolom masing.
5.2.1. Kajian Labu Erlenmeyer
Kajian pada labu atau botol relatif sederhana dan murah. Berdasarkan pada
pengujian yang spesifik, satu labu dapat disampling dengan cepat atau labu replikasi
dibuat untuk masing-masing sampling. Pengujian dilakukan secara terbuka atau
masuk dalam sistem.
Kajian pada labu digunakan untuk menguji biodegradasi kontaminandalam
air atau dalam tanah sebagai slurry tanah/air. Pangujian ini mung kin digunakan
untuk menstimulasi pengolahan slurry air atau tanah yang terkontaminasi dalam
bioreaktor dengan kepercayaan bahwa data laboratorium akan mencerminkan hasil
yang dapat dicapai di lapangan. Tipe pengkajian ini digunakan untuk menentukan
parameter untuk proses bioremediasi yang diharapkan dapat dilaksanakan pada
fase padat atau pengolahan in-situ (dalam sub permukaan). Kajian pada labu
marupakan indikator yang berguna untuk menentukan apakah bioremediasi
memungkinkan pada kondisi yang terakhir ini, tetapi karena kajian ini tidak
setertutup kondisi di lapangan, kajian ini tidak seharusnya digunakan untuk
menentukan pemrograman secara langsung untuk pengolahan pada skala penuh.
Kajian pada labu ini layak digunakan karena indikator untuk pengolahan in-situ atau
pada fase padat yang digunakan sebagai penyaring yang relatif cepat dan murah
untuk menentukan apakah bioremediasi mungkin atai tidak mungkin Jika
hasilnya seperti yang diharapkan, kajian lebih lanjut harus dilakukan, seperti
dilakukannya pengujian pada skala pilot di lapangan atau pada fase padat atau
treatabilitas kolom-padat untuk fase padat atau pengolahan in-situ.
5-5
5.2.2. Kajian Pada Kolom
Kajian pada kolom dibuat sebagai kolom yang direkatkan diisi dengan tanah
setempat, dialirkan melalui air, dengan atau tanpa perubahan. Tujuan kajian pad a
kolom ini adalah untuk mensimulasi kondisi in-situ. Tipe kajian ini mensimulasi
kondisi in-situ yang lebih baik daripada kajian pada labu. Kajian pad a kolom ini
menyediakan informasi yang lebih konsisten seperti apa yang diharapkan di
lapangan, seperti pembilasan tanah terhadap biodegradasi, mengidentifikasi
pembatas fisik pengiriman nutrien dan mengidentifikasi pembatas presipitasi kimia
dan penyumbatan. Kajian pembuatan dan pengoperasian kolom lebih luas
dibandingkan dengan kajian pada labu, dihasilkan dalam pelaksanaan yang lebih
mahal. Juga, dalam kajian pada kolom adanya perbedaan potensial antara replikasi
kolom mungkin menghasilkan variansi yang besar secara statistika; Proses dan
konsentrasi pelaksanaan kajian pada kolom terhadap kajian pada labu untuk aplikasi
dilapangan secara in-situ harus dipertimbnagkan dengan matang.
5.2.3. Kajian pada Nampan
Kajian pada nampan atau pada fase padat merupakan kajian treatabilitas
khusus yang dibuat pada nampan stainless steel atau gelas, tanpa menggunakan
dilusi. bahan padat, tanah khusus, dari suatu tempat. Kajian ini menguji
kemampuan tanah atau sludge untuk dipengolahan tanpa dilusi ke dalam slurry cairo
Kajian ini menguji kemungkinan penanganan bahan daJam matrik padat dengan
perubahan dan pengadukan fisik yang tepat dengan menggunakan met ode yang
mirip dengan yang digunakan pada landfarming. TJpe treatabilitas ini sangat
bermanfaat untuk memperkirakan kecepatan dan tingkat biodegradasi kontaminan
selama pengolahan pada fase padat pada skala penuh.
5-6
5.3. STUDI KASUS TENTANG TRETABILITAS KHUSUS
Studi kasus di bawah ini memberi simulasi tipe treatabilitas yang umum yang
dicoba untuk mengevaluasi proses bioremediasi untuk membersihkan tempat yang
spesifik. Dari 2 studi kasus berikut ini, buat pembahasan hasil uji tretabilitasnya,
kemudian perkirakan tahap selanjutnya pada kondis lapangan.
5.3.1. Kajian Treatabilitas Pada Labu,Dan Kolom Untuk Tanah Terkontaminasi
Dengan Pelumas Dan Pentaklorofenol
Contoh kajian treatabilitas pada tabu dan kolom merupakan satu set kajian
yang dilaksanakan untuk membentuk fasilitas penanganan kayu yang tetah
dioperasikan selama hampir 100 tahun. Bahan-bahan yang digunakan untuk
memelihara kayu terdiri dari seng kloroda, minyak pelumas, dan pentaklorofenol
(PCP). Limbah yang dibersihkan dari tanaman berdasarkan pada standar,
menghasilkan kontaminasi kira-kira 100 acre. Kontaminasi terdiri dari sejumlah
besar immiscrible. lebih rendah dari campuran air dengan minyak pelumas dan PCP.
Pada prinsipnya komponen yang menjadi perhatian adalah PCP dan hidrokarbon
poliaromatik (PAH). Kisaran tempat kontaminasi bervariasi dari pasir dan kerikil
yang jenuh dengan minyak sampai air tanah yang metarutkan fenol, PCP, PAH, dan
fraksi hidrokarbon petroleum yang lain dengan level ppb.
Tempat yang dijamin dengan sistem isolasi kontaminan dan tindakan lain
yang difokuskan pada pembersihan dengan penghilangan kontaminan dan teknologi
biopengolahan. Kondisi lapangan (site) menunjukkan formasi batu yang lebih berat
dan porositas tanah yang tinggi ..
Kajian awal pada labu mengindikasikan degradasi yang kuat untuk
komponen target (PCP dan PAH), kajian pada kolom dilaksanakan untuk
menentukan apakah degradasi kontaminan dapat dicapai pada kondisi insitu yang
disimulasi. Berdasarkan pada apakah pengolahan pendahuluan dipilih untuk
pembersihan pada skala penuh, bioremediasi secara in-situ dapat
diimplementasikan dalam satu atau dua lingkungan tanah yang berbeda.
Jelaskan kemungkinan tahapan pengolahan ?
Kajian pad a kolom di laboratorium dilaksanakan untuk mengevaluasi
bioremediasi secara in-situ dalam tanah yang dicuci dan yang tidak dicuci. Kajian
dilakukan untuk mengevaluasi bioremediasi secara in-situ dalam tanah yang tidak
dicuci yang didesain untuk menjawab pertanyaan di bawah ini :
1. Dengan pertimbangan toksisitas kontaminan tertentu, dapatkah aktivitas
degradatif mikroba disimulasi dalam tanah yag terkontaminasi berat setelah
pemurnian minyak utama ?
2. Apakah pengolahan spesifik dibutuhkan untuk stimulasi aktivitas yang lebih
efektif di dalam tanah ini ?
3. Apakah level pembersihan dapat dicapai sebagai fungsi waktu dalam proses
yang spesifik ??
5-8
Tabel 5.2. Level Residu Kontaminan Yang Dicapai Dalam KajianBioreklamasi Sub Permukaan Terseleksi Setelah 15
Minggu
Parameter Pengolahan 1
a
----Pengolahan 2D
Pengolahan 3
c
Awal Setelah Persen Awal Setelah Persen Awal Setelah Persen
15 Minggu Reduksi 15 Minggu Reduksi 15 Minggu Reduksi
COD 7900 3800 16500 11500 13000 17250
TPH 415 123 650 70 300 300
Minyak & Pelumas 325 207 964 72 580 290
Hidrokarbon Polinuklear Aromatik
cincin PAH k e ~ 2 dan k e ~ 3 59.4 ND 365 76.4 189 62
cincin PAH k e ~ dan ke-5 70 14.6 175 157.4 138 81
PAH total 129.4 14.6 540 233.8 329 143
a Perlakuan dengan air yang diaerasi
b Perlakuan dengan air yang diaerasi dan mengandung nutrien anorganik
C Perlakuan dengan air yang diaerasi dan mengandung nutrien anorganik dan inoulum
5-9
TabeI5.3. Reduksi Kontaminan (mg/kg) dalam Kajian Bioreklamasi Sub Permukaan Pada Kolom Yang Mewakili
Tanah Parit-1 Tanah Parit-4
Parameter
Pengolahan 1 Pengolahan 2b Pengolahan 2Ab
Awal Setelah Setelah Awal Setelah Setelah Awal Setelah Setelah
15 Minggu 92 Minggu 15 Minggu 92 Minggu 15 Minggu 92 Minggu
COD 10000 8000 9500 38400 35000 28000 24480 23000 14000
Minyak & Pelumas 1025 692 5660 4240 5100 5230 2380 2800
TPH 865 572 5760 4000 4436 4410 3500 2460
PAH total 659 68 33.5 2850 1010 583 2490 183 359
a Perlakuan dengan air yang dioksigenasi (sampai DO 12 mgll) yang mengandung nutrien anorganik
b Perlakuan dengan air yang mengandung nutrien anorganik dan hidrogen peroksida 100-250 ppm
5-1()
5.3.2. Treatabilitas Fase Padat Untuk Bahan Bakar Diesel
Tabel 3.4. merupakan data tentang karakterisasi dari tanah yang membutuhkan
pengolahan untuk mereduksi kontamaminasi oleh bahan bakar diesel. Standar
bersih adalah TPH 100 ppm dengan menggunakan metoda GC. Kajian remediasi
pada fase pad at merupakan bagian dari kajian kemungkinan yang lebih besar yang
juga mengevaluasi data slurry.
Tabel 5.4. Perkiraan Dasar Secara Analitik dan Biologi
Analisis TempatYang TempatYang Off-site
Lebih Tinggi Lebih Rendah
pH 8.7 8.0 8.3
Komponen Anorganik
COD 1 4 0 0 0 m g O ~ g 43000 mg 02/kg 24000 mg 02/kg
CI 3.1 mg/kg 4.0mg/kg 14 mg/kg
N0
3
-N <0.11 mglkg <0.11 mg/kg 0.44 mg/kg
0-P0
4
-P 2.0 mg/kg 1.3 mg/kg 1.3 mg/kg
S04 87 mg/kg 35 mg/kg 12 mg/kg
TKN 300 mglkg 210 mg/kg 40 mg/kg
TOC 5100 mglkg 11000 mglkg 2000 mg/kg
Komponen Logam (ICP)
AI 13800 mglkg 15300 mg/kg 25300 mg/kg
Ba 58 mg/kg 91 mg/kg 115 mg/kg
Ca 6600 mglkg 6890 mglkg 8990 mg/kg
Fe 17200 mg/kg 20600 mg/kg 33100 mg/kg
Mg 5270 mglkg 7400 mglkg 12500 mg/kg
Mn 261 mg/kg 292 mglkg 505 mg/kg
K 1190 mglkg 1150 mg/kg 3130 mg/kg
Na 696 mg/kg 513 mg/kg 948 mg/kg
Bahan Organik 010A)
T ermodifikasi 624
5-11
Etilbenzena 8450 I!g/kg
Xilena(Total)
23000 I!g/kg
Benzena
730 I!9/kg
2-Butanon 3550 1!9/kg
1850 1!9/kg
Aceton
175 mg/kg
Bahan Organik (TPH)
TPH (IR)
Termodifikasi 418.1 3240 mg/kg
9140 mg/kg
1780 mg/kg
TPH (GC) 2040 mglkg
7800 mg/kg
1770 mg/kg
Mikrobiologi
Total Heterotrop 3.9 x 10
6
cfu/g
5.8 x 10
6
cfu/g
1.1 x 10
6
cfu/g
Total pendegradasi
petroleum 2.5 x 10
4
cfu/g
2.5 x 10
3
cfu/g
9 x 10
2
cfu/g
Parameter Fisik
Kelembaban berat
basah 10.2 %
10.4 %
17.5%
Catatan : Analisis anion berdasarkan pada perbandingan air terhadap ekstrak tanah
5: 1
5.4. STUD. KASUS TERHADAP EVALUASI LABORATORIUM KOMPLEKS
Pola "kajian treatabilitas sering digunakan untuk menggambarkan operasi
laboratorium yang bervariasi yang dimaksudkan untuk mengidentifikasi kondisi yang
pantas untuk remedisi di lapangan yang sukses. Pernyataan keras, kajian
treatabilitas yang sederhana menguji kemampuan suatu proses untuk mencapai
penghilangan target kotaminan yang diinginkan; kemudian kajian akan menguji satu
kondisi pengolahan yang tetap. membandingkan hasilnya dengan kontrol tanpa
perlakuan yang tepat. Kemampuan untuk melaksanakan uji treatabilitas yang
sederhana tergantung pada proses antisipasi yang telah didefinisikan secara
lengkap; kemudian uji treatabilitas sudah cukup kuat sebelum penelitian dasar dan
pengembangan proses dilakukan. Selain itu dibutuhkan pengetahuan tentang
5-12
Gambar 5.1. menunjukkan hasil dari kajian treatabilitas
Gambar 5.2. menghadirkan hasil analisis dengan GC dari sampet TPH dari titik
utama kajian dan untuk kontrol steril dan kehidupan setelah 6 minggu
pengolahan.
5-13
proses, pekerjaan laboratorium yang lebih mendalam untuk mencapai informasi
yang cukup untuk keberhasilan transisi ke lahan.
Jika infonnasi tentang ketersediaan bioremediasi secara kimia sangat sedikit,
penelitian dasar harus dilakukan di laboratorium dalam usaha untuk menemukan
proses yang mungkin cocok untuk aplikasi di lapangan. Pada level dasar,
kompleksitas kajian pada level yang paling tinggi, menghasilkan biaya pokok untuk
pelaksanaanya sedangkan kemungkinan berhasil masih belum tentu. Usaha pada
level kajian laboratorium dibenarkan apabila biaya untuk ketersediaan teknologi
berlebih, dan pengembangan alternatif dan metode secara biologi akan
menghasilkan reduksi biaya yang besar untuk pembersihan.
Level lebih lanjut dari pengujian laboratorium adalah pengembangan proses. Pada
level ini, satu atau lebih proses telah diidentifikasi yang mungkin berguna untuk
aplikasi di lapangan, tetapi sedikit telah dilakukan untuk menentukan parameter kritik
untuk keberhasilan implementasi. Pada level kompleksitas pertengahan ini, jumlah
parameter (seperti oksigen, nutrien, mikroorganisme) mungkin divariasikan untuk
membuat sesuatu kombinasi yang lebih efektif untuk perlakuan. Biaya untuk kajian
tipe ini adalah biaya menengah dan kemungkinan berhasil merupakan cukup
beralasan.
Kajian treatabilitas yang sederhana merupakan kajian yang cukup kompleks
dan cukup mahal. Tujuannya adalah untuk membuat proses yang biasanya telah
dikembangkan dan telah diuji di lapangan yang akan dilaksanakan sebagai harapan
pada tempat yang spesifik (seperti dalam tipe tanah dan kondisi Iingkungan yang
spesifik). Kajian ini dapat dibenarkan apabila beberap penyimpanan yang dilakukan
setelah teknologi lebih disukai.
Bagian berikut ini menghadirkan studikasus penelitian dasar dan
pengembangan proses untuk menpengolahan kontaminan dalam air tanah. Kajian
pertama mengahadirkan pengembangan sistem pengolahan terhadap kontaminan
air tanah setelah ekstraksi. Kajian kedua menghadirkan pengembangan sistem
untuk pengolahan air tanah teerkontaminasi secara in-situ. Pengolahan biologi
5-14
secara in-situ bersandar pada pengembnagan aktivitas mikroba dalam sub
permukaan, menghasilkan kerusakan kontaminan tanpa ekstraksi.
5.4.1. Pengembangan Sistem Pengolahan Untuk Air Tanah Yang
Terkontaminasi Pelarut
Fasilitas pencampuran, penyimpanan dan distribusi bahan kimia berlokasi pada
tempat seluas 12 acre (4.9 ha) pada California'shank Silicon Valley telah
terkontaminasi dengan 11 tipe pelarut hidrokarbon, meliputi toluena, aceton,
bermacam-macam keton, alkohol dan etHena glikol. Tempat tersebut terdiri dari
perkantoran, dermaga truk dan kereta muatan, warehouse, tempat penyimpanan
dan 36 unit tangki bawah tanah. Tangki ini digunakan untuk menyimpan bahan
organik yang volatil (VaC) maupun yang non-volatil dalam tangki sebesar 6000
sampai 10000 galom (23000 sampai 38000 L). Sejumlah pengujian untuk
menkarakterisasi tempat dan mengevaluasi teknologi remediasi untuk tempat yang
akan diremediasi telah diimplementasikan.
Investigasi hidrogeologi pada suatu tempat menghasilkan empat kesimpulan di
bawah ini:
1. Tempat didasarkan pada tiga zona air dugaan : tanah Iiat berlumpur, tanah
liat berpasirl pasir yang mengandung tanah liat, dan pasir dan kerikil.
2. Aliran langsung air tanah ke arah barat laut, dengan rata-rata kecepatan
rembesan pada zona yang dangkal diperkirakan sebesar 20 kaki (6.1
m)/tahun.
3. Peningkatan kontaminasi air tanah oleh vac didefinisikan dengan baik.
secara horizontal dan vertikal. Konsentrasi VOC dan alkohol yang tinggi
yang ditemukan pada mata air yang terletak dekat tangki penyimpanan;
konsentrasi yang terletak di perbatasan sebelah barat laut adalah rendah
tetapi mengindikasikan bahwa migrasi telah terjadi di atas zona air dugaan.
5-15
Peningkatan kontaminasi air tanah secara vertikal didefinisikan dengan lebih
jelas di dekat area tangki dari pada di perbatasan.
4. Kontaminasi alkohol pada mata air yang terletak di dekat area tangki sangat
tinggi; perbandingan antara konsentrasi alkohol dalam air dan dan dalam
tanah memberi kesan bahwa sumber dapat berasal dari permukaan
tumpahan atau dari kebocoran yang berasal dari bawah tangki penyimpanan.
Investigasi lingkungan dilakukan dalam beberapa fase sejak tahun 1983
sampai 1987, sistem telah dibangun pada tempat yang terkontaminasi untuk
menangani kontaminasi air tanah oleh voe dan komponen organik terlarut,
.
termasuk hidrokarbon terklorinasi, komponen aromatik, dan bermacam-maccam
keton, alkohol dan glikol. Desain sistem didasarkan pada data yang diperoleh
selama kajian treatabilitas di laboratorium.
Untuk memperkirakan kondisi di lapangan secara akurat, sampel air tanah
dikumpulkan dari tujuh tempat mata air yang ditemukan untuk analisis kimia dan
evaluasi mikrobioJogi. Dafiar bermacam-macam dan' konsentrasi kontaminan
ditentukan dari masing-masing mata air, yang disajikan pada Tabel 5.5
5-16
TabeI5.5.
Rangkuman Analisis Kimia (konsentrasi dalam ppb)
Komponen
Nomor Mata Air
6 14 15 16 29 30 31
1,1 ,1-trikloroetana
1 ,1-dikloroetana
1,1 ,2-trikloroetana
1,1-dikloroetena
Trans-1,2-dikloroetena
Etilbenzena
Metilen klorida
Tetrakloroetena
Toluena
Trikloroetena
Vi nil klorida
Aceton
2- Butanon
Total xilena
320000
NO
NO
35000
NO
NO
870000
48000
100000
43000
NO
500000
100000
23000
NO
NO
NO
3800
3500
NO
ND
NO
970
NO
16000
NO
NO
NO
320
4700
NO
NO
6800
NO
NO
1000
430
NO
92000
3300
NO
ND
72000
5700
NO
8900
8300
3200
67000
67000
9600
16000
3900
32000
13000
14000
100
a
500
100
a
900
100
a
500
100
a
500
100
a
2500
0.5 5
1000 5000
280 500
1.7 20
280 580
200 1000
NA NA
NA NA
0.9 5
1600
650
50
970
6400
21
500
2500
48
720
150
NA
NA
51
Catatan : NO : tidak terdeteksi
NA : tidak dianalisis
a
: nilai yang sebenamya ditentukan di bawah treshold ini
Tabel 5.6. Kajian Pada SkalaBench Yang Menurunkan Konsentrasi (ppm)
Kontaminan Terlarut Yang Terseleksi
Kontaminan Konsentrasi Awal Konsentrasi Setelah 24 Jam
Aseton 101 BOL
Metil elil keton 20 BOL
Metil isobutil keton 21 BOL
Isopropanol 53 12
Etilena glikol 131 77
Catatan: BOL : di bawah batas deteksi
Batas deteksi =1 ppm
5-17
Tabel 5.7. Konsentrasi Kontaminan Organik Pada Kajian Aliran Kontinyu
(ppm)
Hari Influent Effluent
ke- ACE MEK MIBK EG IPA ACE MEK MIBK EG IPA
1 159 35 40 103 80 4 4 NO 32 6
2 159 35 40 103 80 4 NO NO 69 27
3 151 31 38 97 71 6 NO NO 70 12
4 156 30 39 99 77 4 NO NO 75 14
5 155 32 39 ' 101
73 NO NO NO 40 18
6 156 31 37 101 74 NO NO NO 3 6
7 154 30 35 102 73 NO NO NO 4 9
8 151 30 35 97 75 NO NO NO NO 3
9 153 31 36 101 73 NO NO NO NO 5
10 151 31 35 100 74 NO NO NO NO 4
15 NO
. . .
Catatan : NO ; Tldak terdeteksl. Level deteksl minimum untuk ACE, MEK, MIBK
adalah 1 ppm; untuk EG dan IPA adalah 0.5 ppm.
5.4.2. : Pengembangan Sistem In-situ Untuk Biodegradasi TCE
Hampir semua diskusi terdahulu tentang biodegradasi telah menunjukkan
bahwa keadaan dimana terdapat kontaminan merupakan substrat pertumbuhan
(seperti makanan) bagi mikroorganisme. Prinsip yang termasuk dalam percobaan
tipe proses biologi ini adalah didasarkan pada optimasi kondisi lingkungan sebagai
tempat tumbuh mikroorganisme yang paling baik pada kontaminan target. Situasi
yang lain yang berlangsung terus secara alami juga digunakan untuk bioremediasi.
Jumlah proses mikrobial telah diidentifikasi, di mana mikroorganisme akan merubah
satu komponen (komponen A) hanya dalam keadaan dimana komponen kedua
(komponen B) tersedia. Komponen B sering digunakan, tetapi tidak diperlukan,
sebagai substrat pertumbuhan bagi mikroorganisme. Komponen ini juga diperlukan
5-18
untuk memproduksi enzim yang dibutuhkan, atau mungkin menjadi komponen yang
diperlukan untuk perubahan komponen A. Komponen A sendiri tidak dapat
digunakan oleh mikroorganisme dan mungkin digunakan apabila tersedia kmponen
B. Fenomena yang digambarkan di sini mengacu kepada kometabolisme, dan
aplikasinya untuk bioremediasi adalah sangat potensial. Bagian ini menggambarkan
penemuan dan pengembangan sistem kometabolisme untuk biodegradasi
trikloroetilena (TCE).
Beberapa tahun yang lalu, proses kometabolisme untuk biodegradasi TCE
telah diidentifikasi. Proses yang asli membutuhkan penggunaan Pseudomonas
cepacia strain G4 atau organisme yang sejenis yang diinduksi dengan fenol dan
telah dikembangkan untuk digunakan dalam bioreaktor untuk menangani air tanah
yang terkontaminasi TCE dalam tipe remediasi pompa-dan-pengolahan. Penelitian
lebih lanjut menunjukkan penggamtian fenol dengan komponen yang tidak
berbahaya seperti Suplemen Karbon yang juga dapat memelihaya aktivitas strain G4
untuk mendegradasi TCE. Penemuan ini memberikan kesempatan untuk
menggunakan proses pengolahan secara in situ untuk perairan yang terkontamonasi
oleh TCE.
Kajian juga melakukan sejumlah uji yang menentukan kebutuhan terhadap
strain G4 dan juga menguji apakah sisten akan dioperasikan pada temperatur yang
diharapkan dalam sub permukaan perairan. Percobaan degradasi TCE dilakukan
pada temperatur yang lebih rendah untuk menyesuaikan dengan degradasi dalam
perairan yang lebih akurat. Percobaan ini dilakukan pada suhu 15C dan dilakukan
pengujian terhadap degradasi TCE setefah 1 dan 4 hari inkubasi (TabeIS.)
5-19
Tabel 5.8. Oegradasi TeE (/-lg/ml) Oleh Strain G4 dan Mikroflora Alami Pada
Suhu 15 DC
Kultur Inducer Hari ke-1 Hari ke-4
TeE Persen yang
dipertahankan
a
TeE Persen yang
dipertahankan
Tanpa kultur
Strain G4
Strain G4
Mikroflora alami
b
Mikroflora alami
b
Tanpainducer
Fenol
Karbon tambahan
Fenol
Karbon tambahan
2.250.05
1.60O.09
2.050.06
1.820.21
1.990.04
101
72
92
82
89
2.190.15
0.250.02
0.070.03
0.240.02
.
1.920.09
98
11
3.1
11
86
a TCE ditentukan dengan kromatografi gas (detektor ECD). TCE pada awal
percobaan =2.23 0.12 Jlg/ml (100 %)
b Mikroflora alami yang digunakan adalah berasal adari sampel yang diperoleh dari
danau dekat Redmond, WA. Organisme diperkaya untuk pertumbuhan pada fenol
atau tambahan karbon dengan pengayaan kultur pada suhu 15 DC.
Tabel 5.9. Konsentrasi (/-lg/ml) dalam Perairan Yang Oisimulasi Sebelum dan
Sesudah Dilalukan Melalui Zona Aktif
Waktu Sampling
a
Konsentrasi TeE
Gradien Atas Gradien 8awah Persen
Penghilangan
Sebelum inokulasi 1.8 2.2 -22
Pada saat inokulasi (+4 0.6 0.75 -20
jam)
Setelah inokulasi 2.2 0.68 69
(+48 jam) 3.2 0.14 96
(+60 jam) 2.1 0.24 89
(+72 jam) 2.7 0.11 96
(+96 jam)
Waktu relatif untuk memperkenalkan strain G4
5-20
Daftar Pustaka
Cookson, J.T. 1995. Bioremediation Engineering: Design and Application.
McGraw-Hili, Inc., Toronto.
Sheehan, D. (ed). 1997. Methods in Biotechnology: Bioremediation protocols.
Humana Press, New Jersey.
5-21
Lampiran 1. Daftar analisis contoh limbah minyak bumi dan batas regulasinya pada
Kep. 04IBapedal10911995 dan metoda analisisnya
NO Deskripsl analisis
PHENOL
1Pentachlorophenol (PCP)
22. 4, 5 - Trichlorophenol
4, 6 - Trichlorophenol
"onocycllc Aromatic

1[t-.!jtrobenzene
Polycyclic Aromatic

1Q:-Cresol
2m-Cresol
3p-Cresol
4Total Cresol
5 2,4-Dinitrotulen
6 Methyl Ethyl Ketone
7Pyridine
irotal Petroleum
1[PH (CrC9)
2 rPH (>C
9
)
3IPH(C
o
l
Organo Chlorine Compounds
1 Carbontetrachloride
2Chlorobenzene
3Qhloroform
4Tetrachloroethylene, PCE
5Tetrachloroethylene TCE
61 4 - Dichlorobenzene
11,2 - Dichlorobenzene
a1 1 - Dichlorobenzene
S!1exach/orobenzene
1(J
Hexachlorobenzene
11 Hexach/orobenzene
12 Vynil Chloride
!Additional Parameter

tro/uene
_3 !=thvlbenzene
.4 IXvlenes (total)
Batas regulasi
UNIT
maksimum
A B
10 1 mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mglKg
7C 7 mg/Kg
mg/Kg
20C 2 mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
100C 100 mg/Kg
10000 1000 mg/Kg
- -
mg/Kg
10 1
m{l/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mg/Kg
mgli(g
mg/Kg
mg/Kg
mglKg
mg/Kg
mgIKg
mg/Kg
- -
mglKg
- -
mg/Kg
- - mg/Kg
-
-
mg/Kg
Metoda Analisis
Lampiran 2. Analisis Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) dengan GCIFID-PID
(Modifikasi EPA 8015/8020)
LlNGKUP: SOP ini meliputi penentuan MBTXE dan TPH/Gasoline-range volatile
hydrocarbons (TVH) dalam air, air limbah, dan matriks padatan.
Metode ini dapat diterapkan untuk penentuan MTBE sampai 20 I-Ig/Kg dalam tanah, 2 I-Ig
IL dalam air, dan BTEX sampai 5 lJ9/kg dalam tanah, dan 0.5 I-Ig IL dalam air. Juga dapat
diterapkan untuk penentuan TVH (as gasoline) sampai 1.0 mg/kg dalam tanah dan 50 I-Ig
IL dalam air.
PENGAWETAN SAMPEL & WAKTU PENANGANAN :
Pengawetan air: Hel sampai pH < 2.
Waktu penanganan : 14 hari untuk sam pel tanah dan air yang telah diawetkan
(7 hari untuk sampel air yang tidak diawetkan)
INSTRUMEN:
Gas Kromatografi ; Hewlett-Packard, 5890
Konsentrator Sam pel : 014460
Purge-and-Trap : Dynatech PT A-30 WI Dynatrap - Dynatech
Kolom Analitik : 30 meter x 0.53mm 1.0., 3.0 IJm film thickness.
Primary: Restek RTX-1
Secondary: Restek RTX-502.2
Photoionization Detector (PID) : 01, Model 4430
Flame Ionization Detector (FlO) : 01. Model 4410
Sistem Data Kromatografi : PE-Nelson, Turbochrom IV
PROSEDUR:
1.0) Kl:llibrasi Awal:
Kalibrasi awat harus dilakukan jlka standar kalibrasi selanjutnya tidak memenuhi
kriteria, atau jika dilakukan pemeliharaan yang mempengaruhi kondisl analisis
(misalnya pemasangan kolom baru, pembersihan detektor, dll).
Blanko instrumen harus dianalisis sebelum standar kalibrasi awal. untuk
menunjukkan bahwa sistem bebas dari kontaminan dan tidak mempengaruhi
standar konsentrasi rendah. Blanko instrumen juga dianalisis setelah standar
L2-1
konsentrasi tinggi untuk menunjukkan bahwa standar tidak terbawa.
2.0) Analisis Sampel:
3.1) Artefak Sampel: Ketika menimbang sampel untuk analisis, analis harus
memperhatikan keragaman sampel yang disebabkan oleh tanah yang
bercampur sisa tanaman, batu dan benda-benda lain. Jika sampel
memiliki keragaman yang nyata, buat catatan dalam buku persiapan
sampel, dan usahakan sedapat mungkin untuk mengambil sampel yang
secara visual paling mewakilL
Persiapan rangkaian sistem data untuk analisis satu batch dali sampel.
Pastikan bahwa pengenceranifaktor konsentrasi dimasukkan secara
benar. Rangkaian sampel harus dibatasi sampai tidak iebih dan satu
batch untuk menjaga kesederhanaan perhitungan data.
Jika diketahui atau diduga sampel mengandung hidrokarbon dengan
konsentrasi tinggi. blanko instrumen dianalisis segera mengikuti sampel
untuk mencegah terbawanya hidrokarbon pada sampel berikutnya. Jika
konsentrasi yang sangat tinggi terdeteksi dalam sampel, dan blanko
instrumen tidak dianalisis segera setelah sampel konsentrasi tinggi. ujilah
data dari sampel berikutnya untuk menentukan apakah ada senyawa
terbawa yang ikut terdeteksi. Jika diduga terjadi hal tersebut, analisis
kembali sampel untuk memastikan seberapa jauh pengaruhnya.
3.3) SAMPEL CAIR: PTA-30 W/S dan Dynatrap
Tempatkan vial 40 ml pada posisi yang tepat dalam autosampler; catat
informasi sampel dalam catatan run, dan pada rangkaian Turbochrome.
Autosampler akan menambahkan campuran surrogate dan melakukan
purging pada suhu 40C. Catat pH sampel dan kode wadah dalam
catatan run.
3.4} SAMPEL PADAT: PTA 30-W/S and Dynatrap
Timbang 1.0 0.1 9 (atau secukupnya) ke daram vial 40 mL. Catat
nomor samper, kode wadah, timbang sampai dua desimal, dan catat
berat dalam buku persiapan sampet. Letakkan vial ke lokasi yang tepat
dalam autosampler. Autosampler akan menambahkan campuran
surrogate dan melakukan purging pada suhu 40C.
L2-2
Buat ekstrak metanol seperti di bawah ini, jika sampel diduga
mengandung senyawa target dengan konsentrasi yang tinggi dan/atau
jika pengellceran >2x (atau < 0.5g berat sampel) akan dibutuhkan.
Autosampler akan menambahakan campuran surrogate dan melakukan
purging sampel pada suhu 40C. Catat informasi sampel dalam catatan
run dan rangkaian data Turbochrom.
Ekstraksi untuk sampel tanah dengan kontaminasi tinggi. Timbang
5.0 0.5 9 ke dalam vial bersih 20mL, dan gunakan pipet tera untuk
menambahkan reagen metanol 5.0mL. Catat berat sampai 2 desimal,
nomor sampel, dan kode wadah dalam buku persiapan sampet. Vorteks
selama dua menit dan tempatkan dalam sentrifus sampai metanol dan air
terpisah seluruhnya. Tambahkan sejumJah volume ekstrak metanol,
sampai 200 uL
t
ke daJam VOA sampai konsentrasi berada di setengah
bagian atas kurva kalibrasi. Catat faktor pengenceran dalam catatan run
dan file sistem data. Uhat Appendix_5 untuk tabel pengenceran metanol
untuk tanah. Pindahkan ekstrak metanolyang tersisa ke dalam vial
bertutup ulir 4 mL dan simpan di freezer suhu < _5C.
4.0) Analisis SampeJ Batch QC
Kriteria penerimaan in-house LCSI MSI MSD adalah spesifik di daJam SOP
'TVHlMBTXE Laboratory Control Umits, Table-1'. Batas ini diperoJeh secara
tahunan, menggunakan bagan kontrol.
4.1) MS/MSD: Siapkan matriks spike dan spike duplikat, untuk MBTEX atau
Gasoline, untuk masing-masing duapuluh sampel atau kurang. Pilih
sampel dari klien untuk dilakukan spike secara bergiliran, sehingga tidak
ada sampel salah satu klien yang dominan selama periode waktu. Untuk
Gasoline, tambahkan 5 uL dar! 2,000 mgIL standar Gas. Untuk MBTEX,
tambahkan 5 uL dan sumber kedua 20 mgIL larutan standar MBTEX.
4.2) LCS: Untuk MBTXE. LCS harus disiapkan dari standar yang berbeda
sumber dengan larutan standar yang digunakan untuk kalibrasi dan untuk
CCV. Siapkan LCS untuk MBTEX dengan menYUlltikkan 5 ul dari 20mg/L
larutan standar MBTEX. Gunakan hanya standar yang tercatat dalam
LlMS; catat nomor LlMS di tempat yang tepat (level 20 ppb).
L2-3
Karena rnasing-rnasing standar gasoline adalah komposit yang unik,
tide-k diper1ukan standar kedua. Gas CCV yang pertama juga berfungsi
sebagai lCS. Siapkan 10,000 nanogram Gasoline lCS dengan
menambahkan 5 ul dari standar Gasoline 2.000mgll ke 5 mt air dalam
vialVOA.
5. PERHITUNGAN
KONSENTRASI SAMPEL (Sampel cair): Menggunakan metode katibrasi eksternal
standar, tentukan konsentrasi analit dari larutan yang tidak diketahui berdasarkan respon
dari instrumen terhadap konsentrasi analit yang sarna, yang piketahui konsentrasinya.
[Ax * A * Vt * DJ
Konsentrasi ugll =
[avRf * Vi VsJ
Dimana: Ax = Respon Area untuk analit dalam sampel
A = Jumlah (massa) standar kalibrasl yang disuntikkan
dalam ng
AvRf = Rata-rata faktor respons dari kurva kalibrasi awal
Vi = Volume ekstrak yang disuntikkan dalam ul
D = Faktor pengenceran, jika tanpa pengenceran 0 =1,
tanpa satuan
Vt = Volume Ekstrak Total dalam ul. Untuk ekstraksi PIT,
Vt=1
Vs = Volume Sampel yang diekstrak (purged) dalam mt.
KONSENTRASI SAMPEL (Sampe' Non-Aqueous): Menggunakan metode kalibrasi
ekstemal standar, tentukan konsentrasi analit dan larutan yang tldak dlketahul
berdasarkan respon instrumen terhadap analit yang sama, yang aiketahui konsentrasinya.
[Ax A Vt OJ
Konsentrasi IJg /kg = -,-----
[avRf * Vi * W]
Oimana: Ax = Respon Area untuk analit dalam sampel
L2-4
A = Jumlah (massa) standar kalibrasi yang disuntikkan
dalam ng
AvRf = Rata-rata faktor respons dari kurva kalibrasi awal
Vi = Volume ekstrak yang disuntikkan dalam uL
o = Faktor pengenceran, jika tanpa pengenceran 0 =1,
tanpa satuan
Vt = Volume Ekstrak Total dalam uL. Untuk ekstraksi PIT,
vt=1
W = Massa Sampel yang diekstrak (purged) dalam gram.
FAKTOR RESPON (Rf): Untuk kalibrasi standar ekstemal. tentukan faktor respon suatu
analit dengan membagi respon instrumen (area peak) dengan konsentrasi analit dalam
standar.
Area Total dan Peak
Rf =
Massa yang Disuntikkan (nanogram)
APPENDIX_1 : REAGEN & STANDAR
REAGEN ________________________________________________
Metanol: Metanol Purge & Trap Grade harus digunakan untuk persiapan seluruh
standar dan pengenceran dengan metanol dilakukan untuk sam pel
konsentrasi tlnggi.
AirDI: Hanya air bebas bahan organik, yang diproses dengan sistem MiIIi-Q
Deionization, yang digunakan untuk persiapan standar dan sampel.
Gas Pembawa: Helium harus 99.99% mumi atau lebih tinggi.
PERSIAPAN STANDAR ___________________
Alat & Bahan:
Reagen: Metanol: Purge & Trap Grade.
Air: Bebas bahan organik dengan sistem MiIIi-Q Deionization.
Syringe: 1, 10, 25, 50, dan 100 mikroliter gas-tight.
SmL dan 10mL tabu takar.
L2-S
Persiapan & Penyimpanan:
1. Semua standar harus disiapkan dalam lingkungan yang bebas kontaminan.
2. Standar kerja segar harus disiapkan setiap 3 bulan atau lebih cepat
tergantung dari penggunaan. Waktu kadaluwarsa standar kerja tidak dapat
melebihi waktu kadaluwarsa sumber standar yang digunakan untuk
menyiapkan standar kerja.
3. Larutan stok baru disiapkan setiap 6 bulan atau lebih cepat jika kUlva
kalibrasi menunjukkan penurunan.
4. Larutan stok disiapkan dalam metano\ dengan komposisi seperti di bawah.
5. Standar kerja disiapkan da\am metano\ dengan komposisi seperti di bawah.
6. Standar disimpan dalam freezer pada suhu < -5 derajat.
Dokumentasi:
1. Semua standar stok dicatat dalam LlMS Source Standard database setelah
diterima; LlMS memberikan nomor standar stok (SS#). Vial standar dilabel
dengan LlMS (SS#) dan tanggal penerimaan.
2. Srtifikat Analisis dari ~ t a n d a r stok dilabel dengan LlMS SS# dan tanggal
penerimaan, dan dimasukkan dalam binder 3 lubang.
3. Persiapan semua standar kerja harus didokementasikan dalam buku catatan
dan dalam LlMS Working Standards database; LlMS memberikan nomor
standar kerja (WS#). Entri yang dicatat dalam buku catatan adalah tanggal
persiapan, konsentrasi dan LlMS SS#, volume SS yang digunakan, volume
akhir, tanggal kadaluwarsa, inisial petugas preparasi. Vial standar dilabel
dengan LlMS WS# dan tanggal kadaluwarsa.
STANDARSTOK__________________________________________
BFB: 1-Brom0-4-fJuorobenzene
Nama LlMS:
BFB
densitas 1.593 glmL (Aldrich)
.
TFT: a,a,a-Trifluorotoluene, 99% NamaLIMS:
TFT
densitas 1.199 g1mL (Aldrich)
L2-6
MBTXE: Larutan Stok Primer:
MTBE, Benzene. Toluene. Ethylbenzene, and o,m.p,-Xylenes
Masing-masing 2,000 uglm:" dalam Metano!.
Restek Cat# 30402-520 (lIMS: MTBE_ONLY) & 30213-520 (lIMS:
BTXE)
Sumber Kedua (lCV) Larutan Stok :
MTBE, Benzene. Toluene, Ethylbenzene. and o,m,p,-Xylenes.
Masing-masing 2,000 ug!mL dalam Metanol.
Protocol Cat# BTEX-CT (lIMS: BTXE-CT)
GASOLINE: Larutan Stok Primer dan Sekunder: Nama LlMS:
GASXHC
Unleaded Gasoline Composite Standard
50,000 ug/mL
Diperoleh daTi Restek, Nomor Katalog 30205.
Lot yang berbeda digunakan untuk konfirmasi dan kalibrasi.
PERSIAPAN STANDAR SEKUNDER_____________
Standar Stok Campuran Surrogate TFT! BFB 45,000 mglL (Nama LlMS:
SS45KSTOCK):
Menggunakan timbangan analitik, tambahkan 2.25g masing-masing neat surrogate (TFT
dan BFB) dalam Metanol Purge-&-Trap grade dalam labu takar 100mL Class-A dan
tepatkan volumenya. Balikkan 3 kali untuk mencampur, pindah dalam vial VOA 40mL
yang dilabel dan disimpan dalam freezer suhu < -5"C. Catat berat sesungguhnya dan
LlMS SS# untuk masing-masing standar dalam buku catatan persiapan standar. Standar
kadaluwarsa dalam 180 hari.
Standar Kerja Harian TFT! BFB 450 mgIL (Nama LlMS: DAILYSS450):
Tambahkan 1.0 mL dan 45,000 mg/L Stok Campuran Surrogate ke dalam Metano! Purge
&-Trap grade dalam labu takar 100mL Class-A dan tepatkan volumenya. Balikkan 3 kali
untuk mencampur, pindah dalam vial VOA 40mL yang dilabel dan disimpan dalam freezer
suhu < -5"C. Catat volume sesungguhnya dan lIMS SS# daTi stok 45K dalam buku
catatan persiapan standar. Standar kadaluwarsa dalam 90 hari.
Intermediet Gasoline:
L2-7
Dalam labu takar 2.0 mL Class-A, encerkan standar stok 50,000 ug/mL seperti di bawah,
tepatkan volumenya menggunakan Metanol Purge-&-Trap grade, buat pengenceran
beriurut-turut dan standar :
Kons.
yang dibutuhkan Stok Penambahan Stok
(ug/mL) (ug/mL) Volume (uL) LlMS WS-Name
10,000 50,000 400 GAS 10000
2,000 10,000 400 GAS 2000
500 2,000 500 GAS 500
50 500 200 GAS SO
Intermediet BTXE:
Da/am tabu takar 2.0 mL Class-A, encerkan volume yang sama dan dua standar stok
(MTBE dan BTXE) 2,000 ug seperti di bawah, tepatkan volumenya menggunakan
Metanol Purge-&-Trap grade.
Kons. yg StokMTBE Stok BTXE LlMS
dibutuhkan(ug/mL) Volume (uL) Volume (uL) WS-Name
100 100 100 MBTXE100
50 SO SO MBTXESO
20 20 20 MBTXE20
2.5 2.S 2.S MBTXE2.S
0.5 400 dr MBTXE 2.5, 400 dr MBTXE2.5 MBTXEO.5
STANDAR KALIBRAS' __________________
Standar Waktu Retensi:
Waktu retensi LUFT dan peak Heptane (C7) sampai peak Dodecane (C12). Untuk
Alaska, Arizona. dan Washington, waktu retensi GRO berasal dan peak pertama
(Hexane. C6) sampai peak terakhir (Decane, C10) dan standar GRO.
n-Heptane (C7) pada 1000 mg/mL, katalog Supelco # 44-2677
L2-8
n-Dodecane (C 10) pada 1000 mglmL, katalog Supelco # 44-2671
Persiapan: Tambahkan 1.0 uL masing-masing standar ke dalam 5mL air
Millipore.
Standar Kalibrasi Awal Gasoline & JP-4 :
Persiapkan kurva kalibrasi awal dengan menambahkan volume berikut dari intermediet
ke 5mL air deion Millipore dalam vial VOA:
Level Cal Konsentrasi
Intermediet Intermediet
(mg/L) (uL)
GAS_1 50
GAS_2 500
GAS_3 2,000
GAS_4 10,000
GAS_5 10,000
Volume
Final
(ng)
5.0
5.0
5.0
2.5
5.0
Konsentrasi
250
2,500
10.000
25,000
50,000
L2-9
Lampiran 3. PROSEDUR ANALISIS C, N, dan P
Prosedur pengujian kadar tanah yang tercemar minyak bumi dianalisis
dengan parameter kadar aair, abu, N, C. dan P (modifiktasi dan AOAC, 1980)
sebagai berikut :
.1. Kadar Air
Pengukuran kadar air dilakukan dengan metode oven. Sebanyak 2 - 10
gram sampel ditimbang dalam cawan yang telah diketahui bobotnya. Sampel
lalu dikenngkan dalam oven bersuhu 105C selama 2 jam. Kemudian
didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai bobotnya konstan.
Kadar air (%) = bobot awal- bobot akhir x 100 %
Bobot awal
2. Kadar Abu
Cawan poselein dimasukan ke dalam tanur selama 30 menit pada suhu
550C. kemudian didinginkan dalam desikator. Cawan tersebut kemudian
ditimbang. Contoh sebanyak 2 - 3 gram ditimbang dan dimasukan ke dalam
cawan porselein tersebut. Pengabuan dilakukan selama 30 menit pada suhu
550C. Cawan kemudian dimasukan dalam desikator. ditimbang dan
ditentukan kadar abunya.
Bobotabu
Kadar abu =-----
x 100%
Bobot contoh
3. Kadar Nitrogen
Sebanyak 0,25 gram sampel dimasukan ke dalam labu Kjeldahl dan
ditambahkan H
2
S0
4
pekat sebanyak 2,5 ml dan 0,25 gram sele. Larutan
tersebut kemudian didekstruksi hingga jernih.
L3-1
Masukan larutan dekstruksi ding in ke tabu destilasi, bilas dengan sedikit
aquades, kemudian ditambahkan NaOH 40% 15 ml. Siapkan larutan
penampung dalam Erlenmeyer 100 ml yang terd!ri 10 ml H
3
B0
3
4% dan
BCG-MR(Bromooressol Green- Methylene Red) dua atau tiga tetes. Destilasi
dihentikan apabila tidak ada lagi gelembung-gelembung yang keluar pada
larutan penampung.
Hasil destilasi kemudian dititrasi dengan HCI 0,01 N. Kadar Nitrogen
dihitung sebagai berikut :
(ml titrasi contoh - ml ttrasi blanko) x N HCI x 14 x 100
%N=
mg sampel
4. Kadar Karbon Total
Contoh kenng udara sebanyak 0,25 gram dimasukan ke dalam tabung
reaksi. Kemudian ditambahkan 5 ml K2Cr2071 N dan 2,5 ml H
2
S0
4
perla han
lahan. Larutan tersebut dikocok-kocok hingga reaksi sempurna.
Sebanyak 1 ml larutan di atas dimasukan ke dalam Erlenmeyer 125 mil
dan ditambah 9 ml aquadest. Kemudian. dititrasi dengan Fe2S0.. 0,1 N
dengan indicator diphenilamin sebanyak 2 atau 3 tetes.
Trtrasi dihentikan jika berubah menjadi wama hijau. Kadar karbon
dihitung dengan rumus sebagai berikut:
(ml titrasi blanko - ml titrasi contoh) x N Fe2S0 .. x3 x 100 x 10
%C=
mgsampel
5. Kadar Fostor
Kadar tostor diukur dalam bentuk P20S. Sebanyak 2 gram sampel I
kompos direndam dalam 10 ml HCI 25 % dan disimpan selama kurang lebih
24 jam. Rendaman terse but kemudian diambil 2 ml dan ditambah 18 ml
aqudest. Dan larutan tersebut diambil 1 ml untuk dlakukan pengenceran 10
kali.
L3-2
Ke dalam larutan hasil pengenceran ditambahkan 0,5 ml ammonium
molybdat serta 2 sampai 3 tetes SnCI
2
, kemudian diukur dengan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 700 nm. Hasil pengukuran
dikonversikan dengan menggunakan grafik untuk mendapatkan konsentrasi
Fosfor dalam contoh.
Sumber Pustaka :
AOAC
SNI
L3-3
Lampiran 4. Penghitungan Bakteri Pengurai Hidrokarbon
I. Pendahuluan
Produk petroleum (misalnya gasolin, diesel, creosot) yang mencemari tanah dan air
dapat dihilangkan menggunakan bioremediasi, yang tergantung dari aktivitas
mikroorganisme yang menguraikan hidrokarbon. Secara khusus, nutrien dan/atau
akseptor elektron ditambahkan ke dalam tanah untuk merangsang pertumbuhan dan
aktivitas bakteri ini. Peningkatan jumlah bakteri pengurai hidrokarbon pada tanah yang
terpolusi sejalan dengan perkembangan bioremediasi merupakan bukti bahwa bakteri
berperan penting dalam penghilangan polutan.
Teknik MPN (Most Probable Number) menggunakan media mineral cair dalam tabung
reaksi dan hidrokarbon volatil sebagai sumber karbon dan energi tunggal bersifat selektif
terhadap bakteri pengurai hidrokarbon, akan tetapi membutuhkan waktu banyak untuk
mempersiapkan dan harus diinkubasi dalam waktu yang cukup panjang (1-2 bulan)
untuk menghasilkan titik akhir dari pertumbuhan bakteri yang dapat teramati. Selama
waktu inkubasi, sejumlah kecil hidrokarbon yang diuji dapat ditambahkan ke dalam
masing-masing tabung reaksi. Konsentrasi awal hidrokarbon mungkin bersifat toksik
terhadap populasi yang tidak diketahui jumlahnya dan perkiraan yang lebih rendah dari
jumlah yang sebenamya dari bakteri pengurai hidrokarbon mungkin t e ~ a d i . Suatu
hidrokarbon volatil dapat digunakan sendiri maupun dalam bentuk campuran.
Penghitungan bakteri yang dapat menguraikan hidrokarbon non volatil dapat
disempumakan dengan menguji koloni pada agar cawan terhadap kemampuannya
untuk mengubah lapisan hidrokarbon yang tidak larut air (misalnya hidrokarbon polisiklik
aromatik atau PAH). Lapisan ini ditambahkan sebelum atau pada saat inokulasi, atau
setelah inkubasi agar cawan yang telah diinokulasi. Disini akan dijelaskan metode
pelapisan atas fenantren (phenanthrene overlayer method). Metode ini akan
menghindari penyemprotan agar cawan dengan PAH yang terlarut dalam pelarut
organik, dengan demikian mencegah kontaminasi atmosfir dan ruang asam dari
hidrokarbon. Adanya bakteri pengurai hidrokarbon dideteksi dengan pengurangan
jumlah iodonitrotetrazolium violet yang ditambahkan, atau dengan tampaknya metabolit
berwama dalam cairan.
U-l
2. Bahan
1. Sampel tanah dikumpulkan dalam botol steril atau stoples, dengan peralatan yang
steril, dan disimpan dalam gelap pada suhu 4-8C sebelum dianalisis, lebih disukai
dalam 5 hari. Sam pel cair dikoleksi dalam volume besar (> 1L) dalam wadah steril
(diisi penuh). disampan dalam gelap pada suhu 4-8C dan diproses dalam 16 jam
setelah pengumpulan untuk mencegah perubahan populasi mikroba.
2. Medium mineral yang cocok (Tabel 1) dibuat menggunakan air murni dapat
menyediakan semua nutrien yang dibutuhkan oleh bakteri kecuali karbon. yang
disediakan oleh hidrok.arbon. Nilai pH ditetapkan 7.0-7.2 dengan NaOH atau HC!.
Medium cair non steril untuk MPN dimasukkan sebanyak 8 ml ke dalam tabung
reaksi bertutup 13x125 mm (volume lebih kecil digunakan untuk tabung yang lebih
kecil) atau medium steril dimasukkan ke dalam plat mikrotiter secara aseptik. Untuk
metode pelapisan-atas fenantren. medium mineral untuk lapisan bawah dipadatkan
dengan Noble Agar (Difco Products, Detroit, MI) atau Purified Agar (Baltimore
Biological Laboratories, Baltimore, MD) (Tabel 1 dan 2). Setelah diotoklaf dan
didinginkan sampai suhu 60C, sikloheksimida (Acti-Dione) dapat ditambahkan
untuk menghilangkan kapang yang mung kin tumbuh jika diinokulasi dengan sampel
bukan berasal dari laut. Medium mineral untuk pelapisan atas disiapkan dengan
agarosa untuk biologi molekuler (suhu gelling 26C) (Type VII Sigma, St. Louis, MO)
dan 3.5 ml medium dimasukkan dalam tabung reaksi kecil bertutup. Semua media
disterilkan dengan otoklaf.
3. Seri 10 kali pengenceran dari sam pel air atau tanah dilakukan dengan larutan
p13ngencer bebas partikel dibuat dengan air reverse osmosis-purified atau air
destilata (17-18 megaQ) dan disaring melalui filter ukuran pori 0.22 J.1m. Penyaringan
ini tidak perlu aseptik (filter dapat digunakan kembali) tetapi larutan pengencer harus
digunakan segera, jika akan disimpan pada suhu ruang harus diotoklaf.
4. Plat mikrotiter steril dengan 24 sumur untuk metode layar mengkilap (sheen screen)
pada hari inokulasi diisi dengan 2.5 ml medium mineral per sumur, minimum lima
sumur untuk satu pengenceran, berkisar dari tanpa pengenceran sampai 1: 10
8
, dan
satu baris dari sumur yang tidak diinokulasi sebagai kontrol untuk perubahan abiotik
dari sifat kilap minyak. Beberapa sumur dapat dimuati dengan medium cair non
L4-2
selektif, misalnya trypticase soy broth atau air laut buatan ditambah suksinat, asetat
dan gliserol dan dibiarkan tanpa inokulasi untuk menentukan apakah bakteri
bergerak dari sumur yang diinokulasi. Setelah menghangatkan minyak kira-kira 37C
untuk menurunkan viskositas, sterilisasi dapat dilakukan dengan filter hidrofobik
sekali pakai (ukuran pori 0.22 atau 0.45 ).1.m). Plat mikrotiter 96 sumur diisi dengan
hidrokarbon polisiklik yang dipilih (misalnya fenantren, naftalen, dibenzothiofen.
anthracen, atau campuran) dengan cara menimbang secara aseptik dan melarutkan
sejumlah total 80 mg dalam 10 ml n- atau isopropanol dan pentana (3:1) dan
memipet 100 ).1.1 ke dalam setiap sumur. Tutup masing-masing plat disangga empat
sudutnya dengan pipet tip steril dan dibiarkan dalam ruang asam (dengan kipas
angin menyala) semalam atau sampat pelarut menguap. Plat mungkin digunakan
segera atau dibungkus dalam Parafilm atau pita elastis 3M Scotch Brand lebar 1 in
dan d!simpan pada suhu -20C.
3. Metode
3.1. Persia pan Sampel
Kocok sampel air dengan tang an selama 1 men it sebelum dituangkan. Gunakan
homogenizer tangan rJWR Scientific, South Plainfield, NJ) steril dengan penggerus
Teflon untuk memecah gumpalan yang terlihat. Timbang secara aseptik 1 9 tanah atau
sedimen (tanpa batu atau kerikil) ke dalam 24 ml larutan pengencer dalam botol steril
tertutup dan kocok dengan keras menggunakan tangan selama 1 menit. Tuang ke
dalam vial kecil steril dan biarkan pasir mengendap selama 2 menit; pipet bagian atas
10 ml. Siapkan seri 10-kali pengenceran dan gunakan dalam waktu 1 jam. Larutan
pengencer dibuffer dengan fosfat, berisi pirofosfat atau surfaktan atau dilakukan sonikasi
dan agitasi. Penerapannya harus dievaluasi untuk masing-masing studi (lihat catatan 1).
3.2. MPN Berdasarkan Turbidititas
Inokulasi lima tabung medium mineral cair dengan 0.1 ml dari masing-masing
pengenceran. dan termasuk set dari lima tabung masing-masing 0.1 ml dan 1 ml sam pel
air atau suspensi tanah tanpa pengenceran. Setelah inokulasi, tambahkan 10 ).1.1
L4-3
--_......._-------------
hidrokarbon volatil atau campuran (benzen:toluen:xylen = 1: 1: 1) digunakan jika
menghitung pengurai gasolin pada masing-masing tabung, kocok perlahan, dan
ketatkan tutup, tambahkan hidrokarbon jika diperlukan (diduga dari hilangnya droplet
tidak cam pur air), biasanya dua minggu sekali. Inkubasi tabung dengan tutup rapat pad a
suhu yang dipilih (misalnya 25C untuk sampel dari iklim subtropis) selama 1-3 bulan
(lihat catatan 2). Munculnya turbiditas dalam cairan, seperti diduga dari perbandingan
visual dengan tabung tanpa inokulasi, adalah bukti adanya pertumbuhan bakteri
pengurai hidrokarbon. ..Iika tidak ada penambahan hidrokarbon volatil, hanya tabung
yang diinokulasi dengan sampel tanpa pengenceran yang menunjukkan turbiditas
karena karbon diperoleh dari sampel air atau tanah. Hitung MPN menggunakan tabel
atau program komputer.
Tabel 1. Contoh dari Media Mineral untuk Penghitungan Bakteri Pengurai Hidrokarbon
(HK) dari Tanah dan Air Tawar
Bahan-bahan
Junlah yang ditambahkan ke 1 L mineral base
8
untuk penentuan dari :
Unit Pembentuk Koloni
dari Pengurai Fenantren
MPNdalam
Tabung
dengan
Plat Mikrotiter dengan
Lapisan
bawah
Lapisan
Atas
HK Volatil Meta-toluat HKnon-vol
Trace Metals ad 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL
Stok Vitamin
C
0.1 mL
Asam Meta-toluat
d
2.72g
Noble or purified agar 18 9
Agarose titik leleh rendah
10 ge
Acti-Dione
f
0.1 9
L4-4
a Mineral base adalah modifikasi dari larutan Winogradsky Salts seperti diterangkan
pada ref.21. Ke dalam 1 Lair destilata atau reverse osmosis ditambahkan 0.5 g,
KH
2
P04; 0.25 g, MgS0
4
.7H
2
0, 0.25 g. NaCI; 10 mg, FeS04.7H20; 10 mg,
MnS04.4H
2
0;10 mg, Na2Mo04.2H20;0.1 g, NH
4
CI dan/atau KN03;0.OS g, CaCI2. Karena
tidak semua bakteri dapat menggunakan nitrat sebagai sumber nitrogen, garam
ammonium lebih berguna. (Enam bahan pertama dapat disiapkan sebagai larutan stok
10x, dan pH ditepatkan menjadi 7.2 dengan NaOh pelet. Pengendapan adalah normal).
Pekerja lain (misalnya 27) menggunakan Bushnell-Haas mineral salt broth (Difco) sering
tanpa penambahan trace metai atau vitamin.
bLarutan stok ini mengandung (mg/L): FeS04.7H
2
0, 200; ZnS04.7H
2
0. 10;
MnCI
2
.4H
2
0.3; CoCI
2
.6H
2
0,20; CuCb.2H
2
0,1; NiCb.6H
2
0, 2; Na2Mo04.2H20. 500;
H
3
B0
3
.30.
CLarutan stok vitamin mengandung (mg/100mL) : biotin.2; asam folat,2; thiamin HCI,S;
asam d-phantotenat. garam kalsium,S; vitamin B12.S; riboflavin,5; niacin,20; pyridoxal
HCI,3; asam paraaminobenzoat,2.
CSetelah penambahan semua bahan-bahan, panaskan sambil diad uk sampai asam
meta-toluat larut dan tepatkan pH menjadi 7.2 dengan kira-kira 15 pelet NaOH .
.,.ambahkan bubuk agarosa sang at perlahan ke dalam medium dengan pengadukan
yang kuat; panaskan sambil diaduk sampai suhu 90C sampai seluruh agarosa meleleh.
Dinginkan sampai kira-kira 6ifC. tuangkan 3.5 mL ke dalam 11 x 100-mm tabung reaksi,
tutup dengan penutup plastik. dan otoklaf. Tabung masih dapat digunakan sampai lebih
dari 4 bulan jika disimpan tegak dalam kantung plastik dalam refrigerator.
'Timbang secara aseptik Acti-Dione, larutkan dalam sejumlah minimum aseton dalam
tabung reaksi kecil, dan ditambahkan dalam lapisan bawah medium sebelum dituang ke
dalam cawan.
Seluruh etanol dibiarkan menguap. Inkubasi plat mikrotiter pada suhu lUang, bungkus
dalam plastik jika ingin dicegah dari evaporasi, dan amati sumursetiap minggu untuk
melihat gangguan sifat kilau minyak (lihat catatan 3). Turbiditas mungkin tidak terbentuk
atau sulit untuk dikenali karen a lapisan minyak mengaburkan cairan.
L4-5
3.3. MPN Berdasarkan Penampakan Produk Metabolit Berwarna
Letakkan plat mikrotiter dengan 96 sumur yang diisi PAH dalam suhu ruang sebelum
melepas pembl!ngkusnya. Tambahkan 270 ~ L medium mineral stenl cair ke masing
masing sumur. Inokulasi set dari lima sumur dengan 30 ~ L sampel dari masing-masing
seri pengenceran 10 kali. Tutup rapat dengan ParafilmR atau pita elastis dan inkubasi
pada suhu ruang atau 25C (suhu yang lebih tinggi akan menyebabkan kondensasi air
pada tutup dan menyebabkan kontaminasi silang dari sumur). Pengamatan dilakukan
setiap minggu selama 24 minggu untuk penampakan produk metabolit berwarna dalam
sumur dan/atau turbiditas baur (Iihat catatan 4). Inokulasi seri sumur yang tidak
mengandung PAH untuk menentukan perbedaan antara turbiditas yang disebabkan oleh
sampel dan oleh bakteri. Juga termasuk disamping sumur yang diinokulasi terdapat
kolom untuk sumur yang tidak diinokulasi diisi dengan medium non selektif (misalnya
trypticase soy broth) untuk mengontrol pergerakkan bakteri diantara sumur.
3.4. MPN Berdasarkan Pengurangan Dye untuk mendeteksi Adanya Bakteri yang
Berespirasi
Pengujian adanya bakteri yang dapat merespirasi minyak bakar No. 2 dalam plat
mikrotiter dengan 96 sumur dilakukan dengan penambahan 50 ~ L iodonitrotetrazolium
violet (INn (3g/L) steril setelah periode inkubasi. ..lika INT tereduksi oleh elektron dari
rantai transpor elektron respirasi bakteri yang ada dalam sumur, terbentuk formazoan
merah yang tidak larut. Sumur berwarna merah muda atau merah diberi skor positif
terhadap adanya bakteri yang dapat menguraikan minyak bakar No.2. Jika minyak
berwarna sang at gelap (misalnya minyak mentah), wama merah tidak dapat terlihat.
Reduksi resazurin oleh bakteri yang tumbuh da!am tabung berisi medium mineral
dengan hidrokarbon mungkin berguna untuk mendeteksi keberadaannya.
3.5. CFU dart Pengurai Hidrokarbon Nonvolatil Menggunakan Metode Plating
Pelapisan
Masukkan tabung agarossa ke dalam air mendidih steril dalam gelas piala kecil sampai
meleleh, biasanya 15-20 menit. Pindahkan tabung satu buah dalam satu waktu ke
dalam penangas air bersuhu 300C selama 1-2 menit atau sampai suhu agarosa kira-kira
350C. Keringkan air di luar tabung, tambahkan 0.2 mllarutan 0.212 9 fenantren dalam
14-6
95% ethanol yang disiapkan secara aseptik (Iihat catatan 5), dan segera vorteks untuk
mengendapkan fenantren menjadi partikel kecil dan untuk melarutkan etanol.
Tambahkan cairan (0.1 atau 0.2 mL) dan sam pel hasil pengenceran {Iihat catatan 4),
vorteks kembali, dan segera tuang diatas permukaan lapisan bawah dalam cawan (lihat
catatan 5). Ketukkan tetes terakhir agarosa dengan memukulkan ke meja secara
perlahan pergelangan tangan yang memegang tabung. Miringkan cawan untuk
menyebarkan agarosda secara merata. Partikel fenantren harus sangat kecil dan
membentuk kabut tipis menutupi agarosa. Setelah inkubasi, uji lapisan atas melalui
dasar cawan dengan mikroskop dissecting yang mengiluminasi cawan dan bawah
menggunakan pembesaran 10 kalL Koloni yang mengandung bakten yang dapat
melarutkan fenantren akan dikelilingi oleh zone bening; zone ini harus jelas sepanjang
tepi koloni. Hitung koloni jenis ini setiap 5-7 hari selama 4 minggu. Koloni pengurai
fenantren sering tampak antara 14 han sejak plating jika sampel berasal dari tanah yang
terpolusi, tetapi dapat sampai 3-4 minggu jika sampel tidak terpolusi (14) (lihat catatan
5).
Catatan
1. Air reverse osmosis (RO) digunakan secara rutn untuk mengencerkan air tawar dan
tanah karena air tersebut tidak mengganggu penghitungan langsung dengan acridine
orange (28). Akan tetapi, perlu diingat ada kemungkinan air RO dapat secara osmotik
mengejutkan bakten tanah dan lamanya waktu bakten berada dalam kondisi ini harus
diminimumkan. Sedimen dan laut selalu diencerkan dengan air yang memiliki
kekuatan setengah air laut buatan (TabeI2).
2. Penentuan MPN bakteri pengurai BTX membutuhkan masa inkubasi sedikitnya 1
bulan; yang terbaik adalah menginkubasi secara rutin untuk 2 bulan, atau lebih lama
jika suhu inkubasi di bawah suhu kamar. Plat mikrotiter tidak dapat digantikan dengan
tabung gelas karena plastik mempengaruhi kebanyakan dan hidrokarbon volatil,
sehingga turbiditas sulit diukur, dan evaporasi dan medium cair tinggi.
3. MPN dari pengurai hidrokarbon nonvolatil menggunakan plat mikrotiter 96 sumur
adalah teknik baru. Hidrokarbon yang berbeda (misalnya fenantren, naftalen, pyren,
salisilat, atau campuran) dapat digunakan karena masing-masing cukup larut dalam
pelarut yang digunakan. Pelarut tidak boleh melarutkan plastik dan plat mikrotiter
L4-7
atau mendorong masuknya PAH ke datam plastik. Turbiditas yang disebabkan oleh
pertumbuhan bakteri atau kristal harus ditentukan dengan hati-hati dengan cara
membandingkan antara sumur yang tidak diinokulasi yang mengandung hidrokarbon
dan medium. Pada sa at ini belum diketahui secara pasti apakah turbiditas
mencerminkan pertumbuhan bakteri pada PAH atau pada komponen organik lain
(dari udara, medium, atau inokulum) dengan adanya PAH. Jika jumlah PAH lebih
sedikit (misalnya 0.1 sebagai ganti dari 0.8 mg), turbiditas mung kin tidak terbentuk
meskipun timbul intermediet berwarna yang menunjukkan adanya bakteri yang
mampu menyerang hidrokarbon, meskipun tidak berarti mampu menguraikannya
secara lengkap. Brian A. Wrenn (komunikasi pribadi) secara rutin memasukkan
f1uoren (0.01 mg/sumur) dengan campuran PAH karena metabolit berwarna kuning
cerah terbentuk dari senyawa itu oleh bakteri pengurai PAH, dengan demikian mudah
untuk mengenali sumur yang positif.
4. Gunakan selalu pengenceran lengkap dari sampel karena bakten yang diinginkan
mungkin jumlahnya sangat sedikit. Sebagai contoh, 15 koloni pengurai fenantrenlml
ditemukan dalam penampungan air minum San Diego dan 1.9 x 104/g tanah kebun di
pemukiman. Senngkali pertumbuhan yang bersamaan dan koloni non pengurai
fenantren pada lapisan atas mengaburkan zone pelarutan fenantren di sekitar koloni.
5. Perhatikan bahwa lapisan atas agarosa telah ding in sampai suhu 30-32oC sebelum
menambahkan bakten. Kejutan panas yang lemah dapat merusak beberapa bakteri
psikrofilik atau psikotropik. Untuk meminimalkan kejutan panas, cairan dan masing
masing pengenceran dapat disebarkan diatas permukaan lapisan bawah
menggunakan batang gelas steril, dan lapisan atas agarosa-fenantren diberikan
setelah kelembaban hilang (0.5-1 jam) .
..
L4-8
Tabel 2. Contoh Media Mineral untuk Penghitungan Bakteri Pengurai Hidrokarbon (HK) dari
Tanah dan Air Tawar
Ingredient
Jumlah yang ditambahkan ke 500 mL AASW
b
untuk penentuan
dari : 331r
Colony-forming units of Most probable number in
Phenanthrene degraders Tubes with Microtiter plates
Underlayer Overlayer Volatile HC With non-vol HC
NH
4
N0
3
1.0 g
NH
4
CI 0.2g 0.2 g
FeS04.7H20 0.025 g 0.025g 0.025 g
K
2
HP0
4
0.057 9 - 0.057 9
Trace Metals Bd 1 mL 1 mL 1 mL
Tris-HCI (1M, pH
7.5)
5mL 5mL
Pure water To make 1L To make 1L To make 1L To make 1L
Noble or purified
agar
18 9
Low melting point
agarose
12g
Daftar Pustaka
Sheehan, D. (ed). 1997. Methods in Biotechnology: Bioremediation protocols.
Humana Press, New Jersey.
L4-9
lampiran 5. PERATUAN TENTANG PENGOLAHAN 11MBAH MINY AK BUMI
(KEP .BAPEDAl)
A. BIOREMEDIASI
Pengolahan limbah sludge minyak bumi menggunakan teknik bioemediasi ek-situ.
Untuk teknik ini lapisan dasarnya harus dipersiapkan agar dapat mencegah infiltrasi.
Penyiapan lapisan dasar harus menggunakan lapisan tanah lempung dan
geomembran serta dilengkapi system drainase. Lindi yang keluar dari bioremediation
site harus ditampung untuk kemudian diolah sebagai limbah cairo
Tahapan bioremediasi adalah sebagai berikut:
1. Rancang bangun tempat bioremediasi
a. Di atas tanah setempat dipasang lapisan tanah lempung dengan ketebalan
60cm setelah dipadatkan serta memiliki permeabilitas K = 10-
7
cm/detik =3.6 x
10-4 cmljam.
b. Di atas tanah lempung yang dipadatkan. dipasang lapisan geomembran dengan
ketebalan 1.5 - 2.0 mm.
c. Memiliki saluran air !indian dan ditempatkan pada suatu bak penampung untuk
diolah sebagai limbah cair sebelum dibuang ke Iingkungan.
2. Pelaksanaan bioremediasi
a. Sludge minyak yang diolah maksimal mengandung minyak 20% dicampung
dengan tanah dan bulking agent sampai rata. Perbandingan antara materi
pencampur (tanah dan bulking agent) dan limbah sludge maksimal 3:1. Untuk
menjaga kelembaban maka dapat dicampur dengan air yang sudah
mengandung nurien pengauya bakteri.
b. Bakteri atau mikroorganisme dapat ditambahkan ke dalam air yang disebutkan
dalam huruf a) untuk mempercepat proses dan untuk menjamin terjadinya
pengurangan kandungan TPH.
c. Apabila menggunakan bakteri seperti yang disebutkan oada huruf b) sebaiknya
menggunakan bakteri local yang diisolasi dan Iokasi atau dari tempat lain di
Indonesia. Penggunaan bakeri impor hanya diizinkan apabila bakteri tersebut

LS-l
tidak tennasuk GMO (Genetically Modified Microorganism) dan wajib mendapat
persetujuan dan Departemen Pertanian.
d. Melakukan pengamatan terhadap penurunan kandungan minyak atau dalam
bentuk TPH.
e. Untuk meyakinkan terjadinya proses biodegradasi dapat dilakukan dengan
pengukuran terhadap pertumbuhan jumlah koloni bakteri dalam tanah dan
transfonnasi nitrogen.
f. Proses bioremediasi limbah sludge lebih baik dilakukan pada kondisi aerob,
oleh karena itu suplai oksigen perlu dijamin.
g. Kelembaban dan proses bioremediasi perlu dijaga. Kondisi yang terlalu basah
atau kering tidak menguntungkan proses bioremediasi.
h. Pengolahan secara bioremediasi dinyatakan layak apabila berhasil menurunkan
kadar minyak sebesar 70% dan total kandungan minyak sebelum proses dalam
waktu 4 bulan, dan menurunkan kandungan petroleum hidrokarbon dengan C S
9 sebesar 80% dan total kandungan C S 9 sebelum proses atau dengan telah
membuktikan telah t e ~ a d i penambahan jumlah mikroorganisma, akumulasi
intennediate product dan penambahan jumlah electron aseptor secara signifikan
dalam waktu 4 bulan. Hal ini bukanlah sebagai target bioremediasi tetapi hanya
sebagai indicator keberhasilan proses bioremediasi.
i. Menyiapkan laporan hasil monitoring untuk parameter TPH, hasil uji TCLP
log am berat dan BTX (Benzene, Toluen, Xylene).
3. Limbah Padar Sisa Bioremediasi
Limbah padat sisa bioremediasi dapat ditimbun ke dalam landfill. ditempatkan
secara pennanen dalam proses backfill dan/atau dimanfaatkan .
..
LS-2