Reao em cadeia da polimerase

Origem: Wikipdia, a enciclopdia livre.

Termociclador, Aparelho utilizado para realizar uma PCR

Reaco em cadeia da polimerase (em ingls Polymerase Chain Reaction - PCR) um mtodo de amplificao (de criao de mltiplas cpias) de DNA (cido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactria) ou leveduras. Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR uma das tcnicas mais comuns utilizadas em laboratrios de pesquisas mdicas e biolgicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnstico de doenas hereditrias, identificao de fingerprint gentico (usado em testes de paterninade e na medicina forense), deteco de diagnstico de doenas infecciosas e criao de organismos transgnicos.

[editar]Histria
O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis,em 1983, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribudo o Prmio Nobel da Qumica pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & PerkinElmer Corporation patenteou este processo. O mtodo PCR usado habitualmente nos laboratrios de investigao mdica e biolgica para uma variedade de tarefas, como a deteco de doenas hereditrias, que a identificao de "impresses digitais" genticas, a construo de rvores filogenticas (rvores de relao entre espcies), a clonagem de genes (ver adiante), testes de paternidade, exames para deteco de agentes patognicos e etc.

[editar]Aplicaes
A PCR encontra sua principal aplicao em situaes onde a quantidade de DNA disponvel reduzida. Em teoria, possvel amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicaes da PCR na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaos de cabelo que contenham bulbo, gotas de sangue ou saliva, pedaos de plo ou at mesmo a minscula quantidade de DNA deixada em uma impresso digital) so amplificadas para serem analisadas pelo mtodo de fingerprinting. O PCR tambm rotineiramente utilizado em procedimentos cientficos de Biologia Molecular como amplificao para gerar mutagnese, deteco de mutaes ou preparao de fragmentos de DNA para clonagem (insero em plasmdeo, por exemplo) como tambm pode ser utilizado para identificao de patgenos que esto presentes em amostras como por a exemplo identificao de agentes como Cndida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vrus do papiloma humano e seus gentipos, HIV Vrus da Hepatite

B. etc A PCR tambm utilizada na paleontologia para o sequenciamento gnico de animais prhistricos.

[editar]Procedimentos

Oito tubos de PCR, cada tubo contendo 100l.

A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) um mtodo muito sensvel de anlise e por isso realizado com muito cuidado para evitar contaminaes que possam inviabilizar ou tornar errneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material gentico da clula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestgios de crimes) sem danific-lo. Normalmente o material extrado o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que um desdobramento da PCR e possui outras aplicaes.

Resultado da PCR aps ser realizada uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.

Depois de extrado o DNA, a este adicionada uma mistura (tambm conhecida como pr-mix) que contm os dNTPs (desoxirribonucleotdeos trifosfatos), que so as bases nitrogenadas ligadas com um trs fosfato, os primers (tambm chamados de oligonucleotdeos ou iniciadores) e a enzimaDNA

polimerase em uma soluo tampo. Toda esta mistura colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pr-estabelecidos com tempos exatos especficos para cada reao (fragmento a ser amplificado). Na primeira etapa do ciclo a temperatura elevada de 94 a 96 C por pouco tempo para que haja a separao da dupla cadeia de DNA (Desnaturao). Na segunda etapa, a temperatura reduzida entre 50 a 60 C dependendo da quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Na ltima etapa do ciclo a temperatura elevada a 72 C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molcula (extenso), em seguida um novo ciclo iniciado. Normalmente so realizados de 25 a 40 ciclos para cada reao na qual a taxa de replicao exponencial 2ciclos O resultado analisado atravs de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois interpretado com a ajuda de um profissional competente.

[editar]Variaes [editar]Nested

da tcnica basica de PCR

PCR

Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da tcnica. Suas reaes requerem dois pares de primers, um par mais externo para a 1a reao (round) e outro interno ao produto do 1a reao. A 1a reao necessita de um maior tempo de extenso devido ao maior tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alquota da 1a reao, que servir de molde na mistura (mix) da 1a reao. O produto da 1a reao normalmente no notado em corrida em gel de agarose, por outro lado o produto da 2a reao gerado em grande quantidade, sim, por isso pode ser visualizado na corrida eletrofortica ou utilizado para sequenciamento.

[editar]Hot

Start

A reao de PCR ativada quando a temperatura atinge 940C. Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contm um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 940C. DNA polimerases que no possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejados (inespecficos) em temperatura ambiente.

[editar]Galeria

de imagens

Clonagem de um gene utilizando-se umplasmdeo.

PCR - Amplificao de DNA in vitro Bsico

Publicado em 24/11/2005

Fundamentos da Tcnica de PCR

Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao servio da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califrnia, recebeu o prmio Nobel da Qumica pelo desenvolvimento de um mtodo que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta tcnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a reas como o diagnstico de doenas, medicina forense entre muitas outras para alm da Investigao em Biologia. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction - reaco em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicao de DNA que ocorre in vivo . Durante o PCR so usadas elevadas temperaturas de forma a separar as molculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo ento a ligao de oligonucletidos iniciadores (primers), tambm em cadeia simples e geralmente constitudos por 15 a 30 nucletidos, obtidos por sntese qumica. Para amplificar uma determinada regio so necessrios dois iniciadores complementares das sequncias que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuao da DNA polimerase durante a sntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar (figura 1).

Para realizar PCR so necessrias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampo salino contendo a polimerase, oligonucletidos iniciadores, os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura submetida a vrios ciclos de amplificao que consistem em: Desnaturao do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96C), de modo a separar as duas cadeias

Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associao, a mistura de reaco arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar)

Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72C)

O processo envolvendo estes trs passos, pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura 2). Em teoria, se for possvel levar a cabo 25 ciclos de amplificao seguidos, a concentrao de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prtica, devido a alguma ineficincia no processo de amplificao, esse aumento fique por um milho de vezes.

Como na tcnica de PCR se encontram envolvidos vrios ciclos de amplificao, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contnua e automatizada, os vrios ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizvel, as DNA polimerases utilizadas devero ser termoestveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termoflicaThermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reaco. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado aps electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparao com padres lineares de DNA.