Tinciones Tejido Conectivo Tricrmica de Gomori

Se trata de una solucin actica estabilizada que contiene Chromotrope 2R, Azul de Anilina y Acido Fosfotngstico. Listo para usar. No requiere dilucin. Colorante Histolgico. Tie citoplasma y fibras musculares de rojo, mientras que el colgeno toma un color azulado.

Tricrmica de Masson
Soluciones colorantes destinadas a la tincin segn tcnica de Masson y sus modificaciones (Lillie). Los colorantes se presentan listos para usar. No requieren diluciones. Para su empleo pueden combinarse de acuerdo a las necesidades del usuario para lograr la tincin deseada. A diferencia de otros productos comerciales que poseen slo 2 colorantes, Biopur dispone de los 4 colorantes desarrollados para la tcnica. La ventaja principal de poder realizar estas combinaciones radica en la posibilidad de teir con colores diferentes de acuerdo a los tipos de tejidos en estudio. Se dispone de soluciones de: Fucsina Acida - Punz de Xilidina Fucsina Acida - Escarlata de Biebrich Azul de Anilina Fast Green FCF

Verde de Metilo - Pironina

Se trata de una solucin de Verde de Metilo asociada con Pironina G segn Tarf-Kurnick. Colorante Histolgico. Empleado para la investigacin histolgica del cido nucleico contenido en los tejidos, as como para demostrar la presencia de clulas de la serie linftica y clulas plasmticas. Tambin es til en la identificacin de clulas plasmticas y RNA en secciones de tejidos y preparaciones citolgicas.

Carbohidratos PAS
Se trata de un kit compuesto por soluciones de: Acido Peridico al 1% (Conservar en Refrigerador 2-10C) Reactivo de Schiff Biopur (Conservar en Refrigerador 2-10C) Para la demostracin histoqumica de componentes celulares que contienen Glicoles, tales como Carbohidratos, Glicoprotenas, etc. Permite la observacin de Membranas Basales y algunas Mucinas

Mucicarmn
Se trata de un kit que contiene soluciones de: Mucicarmn Concentrada Biopur Actica de Tartrazina Biopur Colorante Histolgico. Usado en la identificacin de sitios de tumores primarios, ayudando a la distincin de clulas escamosas indiferenciadas mucina-negativas de los adenocarcinomas mucina-positivos. La cpsula de los criptococos (hongos) se tie de rosa oscuro. La tartrazina tie el citoplasma de amarillo.

Rojo Congo
Se trata de un kit que contiene soluciones de: Rojo Congo (Alcohlica Clorurada) (Stock) Alcohlica al 80%, clorurada (Stock) Hidrxido de Sodio 0.25 M Colorante Histolgico (Bennhold-Puchtler). Destinado a la determinacin de protena amiloide en secciones de tejidos con el empleo de microscopios de luz comn o polarizada.

Bacterias Gram
Se trata de un kit para la coloracin de bacterias con la tincin segn Gram Se dispone de soluciones de: Violeta Cristal Solucin Concentrada de Iodo Decolorante Safranina La tincin de Gram fue desarrollada en el ao 1884 por Christian Gram. La tincin hoy en da es aplicada para la clasificacin como paso inicial en la identificacin de las bacterias. Tambin, como consecuencia de la tincin, las bacterias muestran su forma, tamao, etc., lo que ayuda significativamente al diagnstico.

Ziehl
Se trata de un kit compuesto por colorantes y decolorante. Se dispone de soluciones de: Fucsina Bsica Decolorante Azul de Metileno Mtodo tradicional para la deteccin del bacilo tuberculoso. Para empleo con esputo, concentrado o por extensin directa, lquido cefalorraqudeo u otros fluidos corporales, incluyendo orina cateterizada y material homogeneizado de tejidos.

Tinciones Nucleares
Se trata de soluciones de Hematoxilina a diferentes concentraciones y con aplicaciones especficas. Hematoxilina Biopur est basada en la frmula de Gill #1 conteniendo 2g/L de Hematoxilina. Se trata de una solucin acuosa preparada por va qumica en fro, evitando de esta manera la perjudicial ebullicin. No precipita. No requiere filtrado para su empleo. Posee cido actico en su frmula, permitiendo su empleo inmediato, sin necesidad de aditivo alguno. Por esto, no requiere el agregado de cidos ni de mordientes. Lista para usar. Hematoxilina Biopur encuentra aplicacin en tcnicas citolgicas fundamentalmente. Hematoxilina "Activada" Biopur est basada en la frmula de Gill #2 conteniendo 4g/L de Hematoxilina. Se trata de una solucin acuosa preparada por va qumica en fro, evitando de esta manera la perjudicial ebullicin. No precipita. No requiere filtrado para su empleo. Posee cido actico en su frmula, permitiendo su empleo inmediato, sin necesidad de aditivo alguno. Por esto, no requiere el agregado de cidos ni de mordientes. Lista para usar. Hematoxilina Activada Biopur encuentra aplicacin en tcnicas histolgicas fundamentalmente. Hematoxilina Frrica de Weigert Biopur se compone de 2 soluciones para la preparacin de la misma. Una Solucin de Hematoxilina Alcohlica y una Solucin de Cloruro Frrico. Hematoxilina Frrica de Weigert Biopur encuentra aplicacin especfica en coloraciones especiales que requieren hematoxilina (Mucicarmn, Tricrmica de Masson, Tricrmica de Gomori)

Clsicas May Grunwald - Giemsa

Se trata de productos que se complementan para la tcnica de tincin segn May-Grnwald y Giemsa. Los colorantes segn May-Grnwald y Giemsa son combinaciones de azul y azures de metileno asociados con eosina. Estabilizador es un buffer fosfatos pH 6.5 regulador del pH del agua a ser utilizada en tinciones hematolgicas. Estabilizador Biopur asegura la tincin salmn de los hemates, descartndose los accidentes de las tonalidades rojo fucsia, que dificultan la tincin de los leucocitos, y de las azuladas, que entorpecen la metacromasia.

Wright
Se trata de una solucin May-Grnwald-Giemsa compuesta. Tincin panptica diferencial en un solo paso.

Tincin 15
Se trata de un kit de tincin diferencial rpida compuesto por 3 soluciones: Fijador Solucin 1 (Xantnicos) Solucin 2 (Tiaznicos) Coloracin de extendidos. Tincin diferencial rpida (15 segundos) Puncin aspirativa Tejidos Biopsias por congelacin Muestras hematolgicas Recuento leucocitario diferencial

Shorr
En contraste con la tincin de Papanicolaou, la tincin de Shorr se usa solamente en citodiagnstico hormonal en el cual es superior. Permite lograr la diferenciacin neta de las clulas del epitelio vaginal. Tincin nuclear intensa y coloracin citoplasmtica homognea.

Coloracin Hematoxilina & Eosina Hematoxilina

Si bien tanto Hematoxilina Biopur como Hematoxilina Activada Biopur pueden ser usadas para la tcnica de coloracin Hematoxilina-Eosina, recomendamos el uso de Hematoxilina Activada Biopur dada su doble concentracin que permite lograr resultados en tiempos menores.

Eosina
Se trata de una solucin de eosina. Colorante cido. Utilizado como colorante de contraste de la hematoxilina en la tincin Hematoxilina-Eosina.

Coloracin de Papanicolaou
Se trata de una tcnica citolgica compuesta por 3 soluciones: Hematoxilina Biopur OG Biopur EA Biopur

Hematoxilina Biopur
Colorante nuclear. Las caractersticas y recomendaciones para el uso de Hematoxilina Biopur fueron expuestas en la seccin anterior. Rogamos referirse a la misma para informacin adicional.

OG Biopur
Se trata de una solucin alcohlica de cido fosfotngstico y Orange G. El cido fosfotngstico acidifica la solucin y aumenta la unin del Orange G a zonas citoplasmticas densas.

EA Biopur
Se trata de una solucin alcohlica, fotoestable que elimina los problemas causados por las tradicionales e inestables frmulas numeradas EA-36/50/65/etc. No requiere filtracin. Listo para usar. Tie selectivamente el citoplasma de clulas que tuvieron actividad metablica poco antes de la recoleccin de la muestra. Tie de rosa a rojo las clulas escamosas superficiales, cilios, nucleolo y eritrocitos.

La mayora de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teirlos para observar sus caractersticas morfolgicas. Las tinciones generales estn basadas en el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas molculas presentes en los tejidos gracias a afinidades qumicas. Se utilizan normalmente para teir a las clulas y componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio ptico y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las ms utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato. Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son molculas que poseen tres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromtico de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromforo, y otro que posibilita la unin a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molcula se denomina cromgeno. Segn la naturaleza qumica del cromforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinnicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, derviados del xanteno y derivados de las talocianinas. Segn la naturaleza qumica del radical auxocromo los colorantes se clasifican en: Bsicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte cida es incolora. Tienen apetencia por sustancias cidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glucosaminoglucanos. As, ponen de manifiesto el ncleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, as como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes cidos. Ejemplos de colorantes bsicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina cidos: son sales con el anin coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias bsicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y tambin el colgeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes cidos son la fucsina cida, verde rpido, naranja G o la eosina. Neutros: poseen una porcin cida y otra bsica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teir tanto las partes bsicas como las cidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno. Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad qumica sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudn se disuelve en los lpidos y por tanto teir a las gotas de lpidos, especialmente en los adipocitos. En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera especfica y para ello usamos colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tincin denominada azn contiene azocarmn y anilina-naranja-cido actico que tie los ncleos de rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teido de azul. Otra tincin combinada es el tricrmio de Mallory que tie el colgeno de verde, las clulas musculares de rojo. Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solucin se dice que ha ocurrido un fenmeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorcin de la luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vulve prpura cuando se une a ciertos grnulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color que en solucin se denomina ortocromasia.

Tincin general. Una de las tinciones ms comnmente usada en histologa es la hematoxilinaeosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante bsico y otro cido para teir de diferente color a las estructuras cidas y bsicas de la clula. Antes de proceder a la tincin, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.
Tincin de semifinos. Cuando se procesa material para microscopa electrnica es necesario, a veces, hacerse una idea de qu zona del tejido vamos a cortar. Tngase en cuenta que el rea de una seccin para observar con el microscopio electrnico es muy pequea. Adems, el proceso de osmificacin que ha de llevarse a cabo previamente a la inclusin acarrea el oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta an ms la orientacin de la muestra. Por ello es frecuente hacer secciones de 0.5 a 1 m de grosor con el ultramicrotomo, para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener reas ms ms grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtencin de las secciones ultrafinas. El colorante usado para teir secciones semifinas es normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido. Contraste de ultrafinos. El contraste no es estrictamente una tincin, puesto que no aporta color a la muestra, pero s es un proceso para poder observar los componentes ultraestructurales de la clula, por ese motivo lo incluimos en este apartado. Aunque las secciones para microscopa electrnica se pueden observar directamente con el microscopio electrnico se suelen tratar previamente con metales pesados en un proceso denominado contraste, obteniendo as una imagen ptima de la ultraestructura celular. Tngase en cuenta que en la microscopa electrnica lo importante no es aadir sustancias coloreadas sino molculas que puedan interferir con el camino de los electrones emitidos por el microscopio y que atraviesan la muestra. Los electrones que atraviesan la muestra inciden sobre una pantalla fosforescente que emitir destellos de luz cuando reciban el impacto de un electrn y permite observar las caractersticas del tejido. Los metales pesados unidos al tejido impedirn que pasen los electrones y por tanto se ver una zona negra en la pantalla fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la clula donde no estn estos metales provocaran reas luminosas en dicha pantalla. Por ello todas las imgenes originales de microscopa electrnica son en blanco y negro, aunque se puedan colorear posteriormente con un ordenador.

Los tejidos animales son en su gran mayora incoloros, excepto aquellos que poseen algn tipo de pigmento como la sangre o la melanina de la epidermis. En las plantas, sin embargo, existe una mayor variedad de pigmentos naturales que permiten su observacin directa con el microscopio ptico, a lo que tambin ayuda la presencia de las paredes celulares, las cuales facilitan la delimitacin celular y la discriminacin entre diferentes tejidos. Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir cmo teir los tejidos para poder desentraar sus caractersticas morfolgicas. Se observ que algunos pigmentos como el carmn o la eosina, disueltos en agua, se unan a determinados componentes de las clulas. La expansin de la industria textil y su necesidad de colorear las telas provoc un rpido desarrollo de los tintes o pigmentos en el siglo XIX. Muchas de estas sustancias fueron usadas como colorantes en la histologa de los animales y de las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzndose un enorme desarrollo y perfeccionamiento de nuevas tcnicas y molculas sintticas que se usan segn las necesidades del investigador. Con la llegada de la biologa molecular se han puesto en marcha otras tcnicas mucho ms sofisticadas para observar elementos celulares, entre las que se pueden destacar aquellas que usan anticuerpos, inmunocitoqumicas, las que usan sondas de ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o ms sofisticadas an como las que mediante el diseo de animales transgnicos permiten identificar y observar a las clulas que expresan un determinado gen, incluso en el organismos vivo, gracias a la fluorescencia de la protena verde fluorescente (GFP). No vamos a describir con detalle las tcnicas ms complejas, al menos no en estas pginas bsicas, sino las ms comunes, las que se suelen emplear en un laboratorio para el estudio general de los tejidos. Dividiremos el conjunto de tcnicas histolgicas en cuatro categoras.

a) Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas que se unen a componentes tisulares por afinidad qumica. b) Histoqumica. Son aquellas tcnicas de tincin que implican la modificacin qumica de algunas molculas tisulares para posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes. En este apartado incluiremos tambin a los mtodos de tincin basados en la capacidad cataltica de algunas enzimas presentes en los tejidos que queremos estudiar. c) Lectinas. Las lectinas son dominios de protenas, como las selectinas, que son capaces de reconocer glcidos que forman parte de polisacridos. Tienen una gran especificidad y se usan para determinar el tipo de glcido que aparece en las glucoprotenas de la membrana plasmtica o de la matriz extracelular de los diferentes tejidos. d) Inmunocitoqumica. Son tcnicas histolgicas muy potentes basadas en la alta especificidad de unin de los anticuerpos a los antgenos contra los que se produjeron. Estos antgenos pueden ser cualquier molcula tisular que, purificada en inyectada en un animal, sea capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos anticuerpos aadidos a una seccin de tejido reconocern y se unirn especficamente a dicha molcula. e) Hibridacin. Son tcnicas basadas en la unin complementaria de las bases de cidos nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo, y de la guanina con al citosina). Esto hace que dos cadenas complementarias de cidos nucleicos se unan entre s de forma muy especfica, es decir, hibriden. Siguiendo este principio se pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de ADN o ARN con una secuencia de bases determinada que llevan una molcula unida para poder detectarlas. La secuencia de bases de la sonda es complementaria a otra que est presente en la clula, normalmente en forma de ARNm. Con ello podemos observar qu clulas expresan un determinado gen.

TECNICA DE CORTE.
- La obtencin de rebanadas (cortes) de cuerpos slidos, tiene por objeto el observar secciones translucidas de sus estructuras inernas. Los cortes demasiado gruesos permiten observar mas estructuras, pero con menos definicin pues se superponen unas a otras. Los cortes finos prmiten ver menos estructura, pero con mas definicin y finura. - Para obtener cortes del cuerpo solido, se necesita que este posea un grado de dureza minimo, y proporcional a la finura de la rebanada que deseemos obtener: mas duro = mas fino. - Como la mayora de los tejidos corporales son blandos, es necesario endurecerlos mediante las siguientes estrategias:

1- Fijacin en glutaraldehido: Ideal para cortes gruesos a mano alzada, mediante

el microtomo de mano y navaja barbera (0,5- 3 mm de grosor), o mediante vibratomo.(0,5- 1 mm de grosor). 2- Congelacin en microtomo: -2 a -5 C. Ideal para hacer preparaciones rpidas, p.e. peroperatorias en antequirgfano.(50-100 micras de grosor) 3- Congelacin en criostato: -15 a -30 C. Ideal para cortes finos en histoqumica.(5-20 micras de grosor) 4- Inclusin en Parafina: Ideal para trabajo de cortes en serie y de alta estabilidad. Rutina de laboratorio.(5-20 micras). Los cortes se realizan en un aparato llamado microtomo de parafina (imagen derecha), La la pieza, en amarillo, se coloca en un brazo que se desliza verticalmente sobre una cuchilla, en azul, recubierta por un antirroll (antienrrollamiento) en azul mas claro. 5- Inclusin en celoidina: Ideal para grandes piezas: p.e. Pulmon entero. Cerebro entero, etc.(100-200 micras) 6- Inclusin en resinas epoxi: araldit, vestopal, etc Ideal para microscopa electernica (20-40 nm) y corte de objetos extremadamente duros: hueso y diente. Se corta en el ultramicrotomo.mediante cuchillas de vidrio odiamante..

Las catersticas tisulares y celulares microscpicas internas se observan con microscopios pticos o electrnicos de transmisin (excepto si queremos ver superficies, para lo que usamos el microscopio electrnico de barrido). Con estos aparatos slo se pueden observar grosores muy pequeos de tejido por problemas de difusin y penetracin de la luz en el caso de los microscopios pticos y de penetracin de los electrones en el caso del microscopio electrnico de transmisin. Por tanto tenemos que hacer secciones de los tejidos que queremos estudiar, que pueden ir desde un grosor de unos cuantos nanometros hasta centenares de micras. Algunos tejidos como los vegetales, por sus caractersticas celulares, permiten su observacin en secciones de cientos de micras. Como hemos mencionado en los captulos anteriores, podemos decir que cuanto ms delgada queramos hacer una seccin de tejido ms endurecido ha de estar dicho tejido. La dureza de los tejidos depende de sus caractersticas (por ejemplo, las paredes celulares hacen a los vegetales tejidos duros), de la fijacin que hayamos realizado y sobre todo del material en que hayamos incluido dicho tejido. Una manera ms directa de endurecer el tejido es mediante congelacin. Los aparatos mecnicos para hacer secciones de un grosor de micrmetros se denominan microtomos y existen diferentes tipos segn el grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, el medio de inclusin en el que se encuentre el tejido o si se ha endurecido por congelacin o por inclusin. Los microtomos ms usados son: Microtomo para parafina: Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 m de grosor, para observar con el microscopio ptico. Vibratomo: Corta material no incluido, aunque s fijado o duro, en secciones de 30 a centenares de m de grosor, para observar con el microscopio ptico. Microtomo de congelacin: Con l se consiguen secciones de 30 a unas 100 m de material congelado para su observacin con el microscopio ptico.

Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 m, para observar con el microscopio ptico. Ultramicrotomo: Con l se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones del orden de nanometros de grosor, para observar con el microscopio electrnico de transmisin. Ultracriotomo: Su uso no est muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanometro de material que no se debe incluir, para observar con el microscopio electrnico de transmisin. Los aparatos de corte ms usados tradicionalmente para estudiar las caractersticas generales de los tejidos y de las clulas son el microtomo para material incluido en parafina para observaciones con el microscopio ptico y el ultramicrotomo para observaciones con el microscopio electrnico de transmisin. El criostato se usa tambin frecuentemente en microscopa ptica por el ahorro de tiempo que supone ya que no necesita incluir el tejido, incluso se puede cortar material no fijado.