TEMA 8 INTRODUCCION A LA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Introduccion a la microbiologia de alimentos: Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos.

Procesos patolgicos transmisibles por los alimentos: intoxicacin e infeccin. Regulaciones legales. Mtodos de preservacin de alimentos. Microorganismos en la produccin de alimentos. 1. Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos. - Alimento deteriorado: aquel daado por agentes microbianos, qumicos o fsicos de forma que es inaceptable para el consumo humano. - Aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado. - Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras; siendo bacterias y mohos lo ms importantes. - Las carnes son los alimentos ms fcilmente deteriorables. Durante el proceso de deterioro se va seleccionando una poblacin o tipo de micoorganismos predominante la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones iniciales. - Cada tipo de alimento se deteriora por accin de un tipo de microorganismo concreto cada asociacin es especifica. - De todos los microorganismos presentes en un alimento solo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento resultando seleccionados. Existen una serie de factores que dirigen esta seleccin. a. Factores intrnsecos (aw, pH , redox, nutrientes, estructuras, agentes antimicrobianos), composicin del alimento. b. Tratamientos tecnolgicos: modifican flora inicial. c. Factores extrnsecos: condiciones fsicas del ambiente. d. Factores implcitos: relaciones entre los micoorganismos establecidas como consecuencia de los factores a, b y c. Estos cuatro factores determinan lo que se denomina resistencia a la colonizacin de un alimento. 2. Procesos patolgicos transmisibles por los alimentos: Intoxicacin e Infeccin. - Hay una gran variedad de respuestas patolgicas a los alimentos (alergias, intoxicaciones, toxiinfecciones). - Diferencia entre intoxicaciones e infeccin. - Microorganismos de origen endgeno (zoonosis) o exgeno. - Para que se produzca la toxiinfeccin es necesario que el microorganismo haya producido: a. Suficiente nmero para colonizar el intestino. b. Suficiente nmero para intoxicar el intestino. c. Cantidades de toxina significativas.

- Las infecciones cumplen los postulados de Koch. - En las intoxicaciones hay que demostrar la presencia de toxnas. - La funcin del microbilogo de alimentos ha de ser principalmente la de prevencin y para ello hay que considerar: a. b. c. d. e. f. g. Las fuentes de contaminacin. Las rutas de infeccin. La resistencia de los patgenos a condiciones adversas. Las necesidades de crecimiento de los patgenos. Minimizar la contaminacin y el crecimiento de los microorganismos. Tcnicas de deteccin y aislamiento. Mtodo de muestreo proporcional al riesgo.

3. Regulaciones legales. - Definicin de cada tipo de alimento o producto alimentario. - Regulaciones sobre los lmites de tolerancia de microorganismos (no puede hablarse de asusencia total). 4. Mtodos de preservacin de alimentos. - Tratamiento trmico. - Radiacin ultravioleta: agentes oxidantes. - Radiaccin ionizante: rompen molculas. - Modulacin de la actividad de agua. - Modulacin del pH. - Potencial de oxido-reduccin. - Acidos orgnicos. - Sales de curado: interacciones complejas. - Gases conservantes. - Envasado. 5. Microorganismos en la produccin de alimentos. - Fermentaciones: lquidos, slidos: aumentan la estabilidad del alimento y mejorar sus cualidades organolpticas. Microbiologa de los alimentos Introduccin a la microbiologa de los alimentos. Los microorganismos como productores de alimentos. Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos. Microorganismos como agentes patgenos

transmitidos por alimentos. Factores que afectan el crecimiento bacteriano en alimentos. Crecimiento de microorganismos en medios naturales. Eliminacin de los microorganismos de los alimentos. Antagonismo lctico. 1.- Introduccin a la microbiologa de los alimentos La microbiologa de los alimentos es la parte de la microbiologa que trata de los procesos en los que los microorganismos influyen en las caractersticas de los productos de consumo alimenticio humano o animal. La microbiologa de alimentos, por consiguiente, engloba aspectos de ecologa microbiana y de biotecnologa para la produccin. Se pueden distinguir cuatro aspectos diferentes en la nicrobiologa de alimentos: Los microorganismos como productores de alimentos Desde los tiempos histricos ms remotos se han utilizado microorganimos para producir alimentos. Los procesos microbianos dan lugar a alteraciones en los mismos que les confieren ms resistencia al deterioro o unas caractersticas organolpticas (sabor, textura, etc.) ms deseables. La mayora de los procesos de fabricacin de alimentos en los que intervienen microorganismos se basan en la produccin de procesos fermentativos, principalmente de fermentacin lctica, de los materiales de partida. Esta fermentacin suele ser llevada a cabo por bacterias del grupo lctico. Como consecuencia de ella, se produce un descenso del pH, lo que reduce la capacidad de supervivencia de especies bacterianas indeseables (principalmente bacterias entricas), se acumulan en el alimento cidos orgnicos de cadena corta que, adems de su efecto antibacteriano, le confieren caractersticas de sabor agradable, y, en cuiertos casos, se acumulan compuestos antibacterianos que reducen la carga microbiana del alimento incrementando su vida media o impiden la germinacin de esporas de bacterias Gram-positivas posibles causantes de intoxicaciones alimentarias (por ejemplo: la nisina, bacteriocina producida por ciertas bacterias lcticas, es capaz de inhibir la germinacin de esporas de Clostridium botulinum reduciendo el riesgo de intoxicacin por la toxina de esta bacteria). Los alimentos fermentados comprenden productos lcteos, crnicos, vegetales fermentados, pan y similares y productos alcohlicos. Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos Se considera alimento deteriorado aquel daado por agentes microbianos, qumicos o fsicos de forma que es inaceptable para el consumo humano. El deterioro de alimentos es una causa de prdidas econmicas muy importante: aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado. Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras; siendo bacterias y mohos lo ms importantes. De todos los microorganismos presentes en un alimento slo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento por lo que resultando seleccionados con el tiempo de forma que la poblacin heterognea inicial presente en el alimento va quedando reducida a poblaciones ms homogneas y a, finalmente, un solo tipo de microorganismos que consiguen colonizar todo el alimento desplazando a los dems. Por consiguiente, durante el proceso de deterioro se va seleccionando una poblacin o tipo de micoorganismos predominante de forma que la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones iniciales. Existen una serie de factores que dirigen esta seleccin que determinan lo que se denomina resistencia a la colonizacin de un alimento. Estos factores son: Factores intrnsecos :

Constituyen los derivados de la composicin del alimento: actividad de agua (aw), pH, potencial redox, nutrientes, estructura del alimento, agentes antimicrobianos presentes, etc. Tratamientos tecnolgicos: Factores que modifican flora inicial como consecuencia del procesado del alimento. Factores extrnsecos Derivados de la condiciones fsicas del ambiente en el que se almacena el alimento. Factores implcitos Comprenden las relaciones entre los micoorganismos establecidas como consecuencia de los afactores a, b y c. Diferentes tipos de alimentos son difenretemente atacables por microorganismos. As cada tipo de alimento se deteriora por accin de un tipo de microorganismo concreto establecindose una asociacion es especifica entre el microorganismo alterante y el producto alterado: as, por ejemplo, las carnes son los alimentos ms fcilmente deteriorables debido a las favorables condiciones para el crecimiento de microorganismos derivadas de los factores anteriores. Los microorganismos como agentes patgenos transmitidos por alimentos Por otra parte, ciertos microorganismos patgenos son potencialmente transmisibles a travs de los alimentos. En estos casos, las patologas que se producen suelen ser de caracter gastrointestinal, aunque pueden dar lugar a cuadros ms extendidos en el organismo e, incluso, a septicemias. Las patologas asociadas a alimentos pueden aparecer como casos aislados, cuando el mal procesamiento del alimento se ha producido a nivel particular; pero suelen asociarse a brotes epidmicos ms o menos extendidos en el territorio; por ejemplo, el nmero de brotes epidmicos asociados a alimentos durante los ltimos aos en todo el territorio nacional ha oscilado entre 900 y 1000 brotes anuales. Las patologas asociadas a transmisin alimentaria pueden ser de dos tipos: infecciones alimentarias producidas por la ingestin de microorganismos o intoxicaciones alimentarias producidas como consecuencia de la ingestin de ytoxinas bacterianas producidas posr microorganismos presentes en los alimentos. En ciertos casos, pueden producirse alergias alimentarias causadas por la presencia de microorganismos. En cualquier caso, para que se produzca una toxiinfeccin es necesario que el microorganismo haya producido: a) Suficiente nmero para colonizar el intestino. b) Suficiente nmero para intoxicar el intestino. c) Cantidades de toxina significativas. Los tipos de microorganismos patgenos con importancia alimentaria comprenden bacterias, protozoos y virus, en el caso de las infecciones alimentarias, y bacterias y hongos (mohos) en el caso de las intoxicaciones. Para que una bacteria pueda causar una infeccin, adems de las condiciones anteriores es necesario que el microorganismo presente un rango de temperaturas de crecimiento compatible con la temperatura corporal de los organismos superiores (40C). Esto es la causa de que patgenos vegetales no sean patgenos animales y que la mayora de psicrfilos y psicrtrofos no sean de gran relevancia en patologa.

Por su parte, un virus ser patgeno nicamente en el caso de que las clulas animales presenten los receptores necesarios para que el virus pueda adsorberse a ellas. Esta es la razn por la que hay especificidad de reino entre virus animales, vegetales y bacterianos sin infecciones cruzadas entre reinos. La procedencia del microorganismo patgeno puede ser de dos tipos: microorganismos endgenos presentes en el interior del alimento, y microorganismos exgenos depositados en la superficie del alimento. Lospprimeros suelen estar asociados a alimentos animales ya que los patgenos de animales pueden serlo de humanos, mientras que los patgenos vegetales no pueden serlo ebido a las diferencias entre ambos tipos de microorganismos. Por ltimo, debido a la importancia en salud pblica de las toxiinfecciones alimentarias, la labor del microbiologo de alimentos se dirige, en muchos casos, al control destinado a evitar el consumo de productos elaborados en condiciones deficientes y que, por tanto, sean potencialmente peligrosos. Para ello, ha tenerse en cuenta, a la hora de realizar un anlisis microbiolgico de alimentos: a) Las fuentes de contaminacin del alimento. b) Las rutas de infeccin del patgeno. c) La resistencia de los patgenos a condiciones adversas. d) Las necesidades de crecimiento de los patgenos. e) Minimizar la contaminacin y el crecimiento de los microorganismos. f) Tcnicas de deteccin y aislamiento. g) Metodo de muestreo proporcional al riesgo. Todo lo anterior obliga a la regulacin legal de las caractersticas microbiolgicas de cada alimento, lo que comprende la definicin de cada alimento o producto alimentario y las regulaciones sobre la tolerancia del nmero de microorganismos permisibles. (los llamados valores de referencia). 2.- Factores que afectan al crecimiento bacteriano en los alimentos Cuando un microorganismo se encuentra en la superficie o en el interior de un alimento, actuan sobre l todos los factores fsicos o qumicos debidos a la composicin del alimento en s y a las condiciones en las que se encuentra. En este sentido, los factores que afectan al crecimiento bacteriano en los alimentos son parcialmente equivalesntes a los factores de resistencia a la colonizacin microbiana de un alimento. Especialmente relevantes, por ser susceptibles de manipulacin tecnolgica, son los siguientes: Tratamientos que manipulan la temperatura Refrigeracin Entendemos por refrigeracin la conservacin de alimentos a temperaturas inferiores a 10C y superiores al punto de congelacin del agua. La baja temperatura es, evidentemente, un factor limitante del crecimiento microbiano. Segn su comportamiento frente a la temperatura, los organismos pueden ser trmofilos, mesfilos y psicrotrofos. Al tratar la refrigeracin de alimentos, hay que considerar varios aspectos:

La refrigeracin es un factor de seleccin de poblaciones bacterianas A temperatura de refrigeracin (0 - 5 C) los organismos psicrfilos crecen ms rpidamente que los mesfilos y, por tanto, la baja temperatura per se supone un factor de seleccin de la flora del alimento de gran importancia. Este hecho, unido a que a temperaturas inferiores a la ptima los periodos de latencia se alargan mucho, especialmente en bacterias mesfilas, hace que la poblacin bacteriana esperable tras largos periodos de refrigeracin est constituida mayoritariamente por psicrfilos, y que, por consiguiente, los procesos que se produzcan a esta temperatura sean, predominantemente, de alteracin ms que de desarrollo de microorganismos patgenos. Choque de fro Cuando se enfra rpidamente un alimento muchas de las bacterias mesfilas que normalmente resistiran la temperatura de refrigeracin, mueren como consecuencia del choque de fro. Esto es ms frecuente en Gramnegativas que en Gram-positivas. El fro produce alteraciones metablicas en los microorganismos A baja temperatura las rutas metablicas de los microorganismos se ven alteradas, como consecuencia de su adaptacin al fro. Estos cambios metablicos pueden dar lugar a que se produzcan deterioros diferentes a los causados por los mismos microorganismos a diferentes temperaturas. En resumen, el deterioro de alimentos refrigerados se produce por microorganismos psicrofilos porque, aunque sus velocidades de crecimiento son lentas, los periodos de almacenamiento son muy prolongados. Los microorganismos patgenos son, en su mayora, mesfilos y no muestran crecimiento apreciable, ni formacin de toxinas, a temperaturas de refrigeracin correctas. Ahora bien, si la temperatura no es controlada rigurosamente puede producirse un desarrollo muy peligroso rpidamente. Refrigeracin Se entiende por congelacin la conservacin de alimentos a temperaturas inferiores al punto de congelacin del agua. Estas temperaturas pueden variar desde la que se obtiene en un congelador casero (en torno a -2 a -10C) y las conseguidas en sistemas de congelacin ms potentes que pueden llegar a -30 a -80C. La congelacin detiene el crecimiento de todos los microorganismos. Los superiores (hongos, levaduras, helmintos) son ms sensibles que las bacterias y mueren. A temperaturas ms bajas (-30 C) la supervivencia de las bacterias es mayor que en temperaturas de congelacin ms altas (-2 a -10 C), sin embargo estas temperaturas tambin deterioran el alimento ms que las ms bajas. La congelacin puede producir lesiones subletales en los microorganismos contaminantes de un alimento. Este aspecto hay que considerarlo al hacer control microbiolgico. Durante la congelacin la carga microbiana continua disminuyendo. Sin embargo, las actividades enzimticas de las bacterias pueden continuar dando lugar a ms deterioro. Tras la congelacin los microorganismos supervivientes pueden desarrollarse en un ambiente en el que la rotura de la integridad estructural del alimento como consecuencia de la congelacin puede producir un ambiente favorable para el deterioro microbiano. Altas temperaturas Las temperaturas superiores a las de crecimiento ptimo producen inevitablemente la muerte del microorganismo o le producen lesiones subletales. Las clulas lesionadas pueden permanecer viables; pero son incapaces de multiplicarse hasta que la lesin haya sido reparada.

Aunque se han observado excepciones, est perfectamente establecido que la cintica de termodestruccin bacteriana es logartmica y en ella se pueden determinar para cada microorganismo y alimento los valores de termodestruccin D y z que, en conjunto con la medida de los valores de carga microbiana inicial del alimento permiten disear el tratamiento adecuado para conseguir los niveles microbiolgicos tcnicamente aceptables. La velocidad de termodestruccin se ve afectada por factores intrnsecos (diferencia de resistencia entre esporas y clulas vegetativas, localizacin intra o extracelular de las bacterias patgenas), factores ambientales que influyen el crecimiento de los microorganismos (edad, temperatura, medio de cultivo) y factores ambientales que actan durante el tratamiento trmico (pH, aw, tipo de alimento, sales, etc.). Radiacion ultravioleta La radiacin ultravioleta produce una disminucin exponencial en el nmero de clulas vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiacin. Por tanto se pueden calcular valores anlogos a D para la irradiacin. Existe una falta de informacin precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiacin U.V.: diferentes cepas de una misma especie pueden tener una resistencia distinta. El mayor valor del tratamiento con radiaciones U.V. se encuentra en el saneamiento del aire, aunque tambin pueden aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos. Radiacion ionizante La radiacin ionizante es altamente letal, puede ajustarse su dosis para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetracin es uniforme. Es letal por destruccin de molculas vitales de los microorganismos, esto los consigue sin produccin de calor, por lo que los alimentos se conservan frescos. La mayora de los daos son a nivel ADN. La sensibilidad a la radiacin de los microorganismos difiere segn las especies e incluso segn las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre cepas de una mismas especie son generalmente lo suficientemente pequeas para no tenerlas en cuenta a efectos prcticos. Las bacterias Gram-negativas son generalmente ms sensibles a la irradiacin que las Gram-positivas y las esporas an ms resistentes. En general, la resistencia a la radiacin de los hongos es del mismo orden que la de las formas vegetativas bacterianas. Los virus son an ms resistente que las bacterias a la radiacin. Actividad de agua reducida. Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponibles, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metablicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (aw). La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentracin de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extraccin del agua o mediante la adicin de solutos. La deshidratacin es un mtodo de conservacin de los alimentos basado en la reduccin de la a w, durante el curado y el salazonado, as como en el almbar y otros alimentos azucarado son los solutos los que, al ser aadidos, descienden la a w. Un pequeo descenso de la aw es, a menudo, suficiente para evitar la alteracin del alimento, siempre que esta reduccin vaya acompaada por otros factores antimicrobianos. La mayora de las bacterias y hongos crece bien a aw entre 0,98 y 0,995; a valores aw ms bajos la velocidad de crecimiento y la masa celular disminuyen a la vez que la duracin de la fase de latencia aumenta hasta llegar al infinito (cesa el crecimiento). Algunos tipos de microorganismos son capaces de crecer en condiciones de alto contenido de sal (baja aw). Dependiendo de la capacidad de supervivencia a baja aw se denominan osmfilos, xerfilos y halfilos (segn va aumentando su requerimiento de sal). Sin embargo, la baja aw reduce tambin la tasa de mortalidad de las bacterias: una baja aw protege los microorganismos durante tratamientos trmicos.

pH Y LA ACIDEZ. - En general, la presencia de cidos en el alimento produce una drstica reduccin de la supervivencia de los microorganismos. Los cidos fuertes (inorgnicos) producen una rpida bajada del pH externo, aunque su presencia en la mayora de los alimentos es inaceptable. Los cidos orgnicos dbiles son ms efectivos que los inorgnicos en la aciclificacin del medio intracelular; se supone que esto ocurre porque es ms fcil su difusin a travs de la membrana celular en su forma no disorciada (lipoflica) y posteriormente se disocian en el interior de la clula inhibiendo el transporte celular y la actividad enzimtica. - La mayora de los microorganismos crecen a pH entre 5 y 8, en general de hongos y las levaduras son capaces de crecer a pH ms bajos que las bacterias. Puesto que la acidificacin del interior celular conduce a la prdida del transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar ms energa de mantenimiento y, a una velocidad variable segn las especies, se produce la muerte celular. 6.- POTENCIAL REDOX. - Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. El potencial redox indica las relaciones de oxgeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energa y sintetizar nuevas clulas sin recurrir al oxgeno molecular: los microorganismos aerobios requieren valores redox positivos y los anaerobios negativos. cada tipo de microorganismo slo puede vivir en un estrecho rango de valores redox 7.- ACIDOS ORGANICOS. - La actividad antimicrobiana de un cido orgnico o de su ster se debe a las molculas no disociadas de este compuesto, porque esta forma molecular es la ms soluble en las membranas celulares, por esto slo los cidos orgnicos lipoflicos tienen actividad antimicrobiana. - Estos compuesto inhiben el crecimiento de los microorganismos o los matan por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento del transporte de substratos y el transporte de electrones de la forforilacin oxiclativa. como consecuencia de esto las bacterias no pueden obtener energa y mueren. - La mayoras de los cidos orgnicos resultan poco eficaces como nhibidores del crecimiento bacteriano a los pH de 5.5 a 5.8, y son ms eficaces a altas concentraciones y pH ms bajos. (Cuando el estado disociado del cido es ms infrecuente). Su empleo ms frecuente es como micostticos. - De todos los cidos el ms efectivo es el actico. 8.- SALES DE CURADO Y SUBSTANCIAS ANALOGAS. - Las sales de curado son el cloruro sdico y los nitratos o nitritos de sodio y potasio; estos productos modifican el alimento base en el color, aromas, textura y sensibilidad al crecimiento microbiano. - A las concentraciones y bajo las condiciones corrientemente utilizadas, los agentes de curado no causan una destruccin microbiana rpida; ms bien retrasan o previenen el desarrollo de los microorganismos perjudiciales de los productos sin tratar por el calor y el de los termotolerantes no esporulados y evitan el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento trmico ms drstico aplicado a ciertos productos curados. - Se desconoce el mecanismos excto de la inhibicin de las bacterias por el nitrito que, aunque no previene la germinacin de las esporas, evita su desarrollo. 9.- GASES COMO CONSERVADORES.

- Diversos gases y vapores naturales o artificiales destruyen o inhiben los microorganismos. El nitrgeno y el oxgeno se usan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de los alimentos pero su fin primario no es la inhibicin de los microorganismos; diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con xito en la desinfeccin de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo, pero no se han aplicado a los alimentos. - El CO2 inhibe el crecimiento de microorganismos sobre los alimentos con eficiencia creciente cuanto ms desciende la temperatura. Este efecto se manifiesta tanto en bacterias como en hongos por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generacin durante la fase logartmica. Su mecanismos de inhibicin no se conoce con claridad, aunque se debe a la presencia del CO2 (y quiz a la formacin de cido carbnico) y no a la ausencia de oxgeno. Los mohos y las levaduras son alga ms resistentes al CO2 que las bacterias (las Gramnegativas ms sensibles que las Gram-positivas). - La actividad antimicrobiana del dixido de azufre est relacionada con la forma molecular no ionizadas: no se conoce un modo de accin, aunque este gas es muy reactivo y probablemente interacciona con muchos componente celulares. Su accin txica es selectiva: las bacterias son ms resistentes que los mohos y las levaduras, por la que este gas se emplea frecuentemente como antifngico. - El xido de etileno resulta muy txico para los microorganismos y su actividad est relacionada con su accin como agente alquilante. Los mohos y levaduras son ms sensibles que las bacterias y estas que las esporas.

PRINCIPIOS DE HIGIENE DE ALIMENTOS 1.- Objetivos del tema 2.- Principios de higiene de alimentos 2.1.- Los alimentos como vehculos de propagacin de enfermedades Los alimentos presentan siempre microorganismos en su superficie o en su interior. Estos microorganismos pueden ser, atendiendo a su origen, endgenos (ya presentes en el interior de las estructuras del alimento donde pueden provocar zoonosis, enfermedades animales no transmisibles al hombre y enfermedades vegetales no transmisibles al hombre) o exgenos (se incorporan al alimento durante su manipulacin y procesado); y, atendiendo a su relacin con el consumidor, pueden ser agentes patgenos o alterantes (saprfitos). Los agentes endgenos o son inocuos (patgenos de plantas) o son eliminados en mataderos (animales enfermos) o durante el procesado (pasteurizacin). En cualquier caso, los alimentos son una va importante de transmisin de microorganismos que pueden causar infecciones e intoxicaciones que, en general tienen un tiempo de incubacin corto (2-10 h.) y suelen cursar con sndromes gastrointestinales. Puesto que algunas de estas patologas tienen una DMI (dosis mnima infectiva) muy baja es muy necesaria la higiene de los alimentos y de los procesos de elaboracin. La incidencia real de las toxiinfecciones no est clara por que solo se declara un 10 % de estas enfermedades entre las que se encuentran salmonelosis, shigelosis o disentera bacilar, gastroenteritis por Escherichia coli enteropatgeno, enteritis causada por Yersinia enterocolitica, diarreas por Vibrio parahaemolyticus y por otros vibrios prximos al V. cholerae, enteritis causadas por Campylobacter, enteritis producidas por Bacillaceae, intoxicaciones alimentarias agudas como el botulismo (intoxicacin por Clostridium botulinum) y la intoxicacin estafiloccica, intoxicaciones alimentarias crnicas causadas por hongos, virosis transmitidas por alimentos como la hepatitis de tipo A, enfermedades causadas por protozoos y transmitidas por alimentos y enfermedades causadas por helmintos.

Aisladamente cada una de las patologas anteriores puede prevenirse mediante un tratamiento adecuado del alimento; sin embargo hay que extremar este cuidado cuando se trata de produccin de alimentos o comidas a gran escala puesto que en estas condiciones es ms factible una contaminacin que produce un elevado nmero de vctimas. 2.2.- Puntos crticos: anlisis y tratamiento En la elaboracin de un alimentos se pueden identificar una serie de pasos en los que puede producirse la contaminacin del alimento por microorganismos o en los que los microorganismos ya presentes en el alimento pueden multiplicarse con mayor facilidad. Estos pasos del proceso se denominan puntos crticos y sobre ellos hay que actual a la hora de mejorar las caractersticas microbiolgicas del alimento en cuestin. Un producto tiene buena calidad microbiolgica cuando sus cargas microbianas son reducidas y constantes (esto es, no presentan variaciones estacionales o de cualquier otro tipo de periodicidad que impiden que el producto sea homogneo a lo largo del tiempo). Para lograr un aumento de la calidad microbiolgica de un alimento lo que hay que hacer es determinar en la Industria cules son los crticos del proceso y evitarlos siguiendo un cdigo estricto de Buenas Prcticas de Elaboracin y Distribucin del alimento (BPE). La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiolgica y no en comprobar la calidad microbiolgica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relacin coste beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar). En el desarrollo de las BPE hay que hacer un anlisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patgeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnolgicos. Este riesgo depende de la DMI (Dosis Mnima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asimismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el nmero de raciones o partes consumidas por la poblacin en un determinado tiempo. La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la frmula l = log10(N0/Nc) donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo. Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiolgica del producto disminuyen y el anlisis microbiolgico es ms consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE.

3. Principios de control microbiolgico de los alimentos 3.1.- Funcin del control microbiolgico de los alimentos El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter preventivo sino que simplemente es una inspeccin que permite valorar la carga microbiana. La prevencin se logra como se indic anteriormente. Puesto que el control microbiolgico es un proceso analtico es necesario seguir una serie de criterios sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales. En este sentido, es necesario considerar (1) la distribucin desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de

toma de muestras para obtener resultados representativos; (2) que el nmero de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiolgica de los alimentos debe limitarse al mnimo necesario para as poder aumentar el nmero de anlisis y (3) que los criterios de anlisis aplicados han de ser especficos de cada alimento porque son diferentes los microorganismos patgenos y alterantes de cada tipo de alimento. 3.2.- Protocolo de toma de muestras Un protocolo de anlisis de alimentos correcto debe considerar: (1) la heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, (2) el proceso de transporte de las muestras del sitio de recoleccin al laboratorio evitando la multiplicacin de los microorganismos presentes o la inactivacin de algn microorganismo; (3) que es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora sta inocua, utilizando medios selectivos; (4) los tratamientos tecnolgicos pueden producir daos subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente a medios selectivos y es necesaria la utilizacin de medios de recuperacin y(5) que, en cualquier caso, es necesario realizar una evaluacin sistemtica de los medios de cultivo para prevenir la variabilidad debida a pequeos errores en la preparacin de los medios de cultivo. El planteamiento del muestreo del alimento es diferente si se trata de un muestreo nico (caso de una partida que llega por primera o nica vez al centro de control microbiolgico) del muestreo repetido. Cuando hay que hacer un muestreo de una partida nica de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboracin y conservacin del alimento. Ningn muestreo nico puede dar una garanta total de calidad microbiolgica del alimento y, como norma general, es conveniente analizar un nmero de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeo. En el caso de un muestreo repetido, un sistema basado en el anlisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligar al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor. 3.3.- Microorganismos ndice e indicadores Microorganismo ndice es aqul cuya presencia alertar de la posible presencia de un microorganismo patgeno relacionado ecolgicamente con l. (Ej.: E. coli ndice de S. typhi). Mientras que microorganismo indicador es aquel cuyo n?mero indica un tratamiento inadecuado o una contaminacin posterior del alimento analizado. Un microorganismo dado puede actuar como ndice e indicador simultneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patgeno, se siguen llevando a cabo anlisis de microorganismo determinados como marcadores por razones de economa, rapidez y sensibilidad. Los principales marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de Lancefield. 3.4.- Clculo de los valores microbiolgicos de referencia Se siguen varias etapas: 3.4.1.- Sondeos o estudios exploratorios. En primer lugar se seleccionan ms de 10 industrias y valorar sus BPE corrigindolas si es necesario. Cuando se han corregido errores se toman alrededor de 10 muestras por empresa y se valoran los criterios seleccionados y con los datos obtenidos se confeccionan curvas de distribucin, en las que se calcula el percentil 95% (Figura 1) ( ) que suele estar 1 2 rdenes de magnitud por debajo de los valores mximos aceptables (DMI o NMA nivel mnimo de alteracin). Si los valores de se aproximan a los DMI o a los NMA hay que revisar las tcnicas de elaboracin y distribucin de los alimentos antes de proceder a una nueva estimacin de los valores de referencia.

3.4.2.- Deduccin de los valores de referencia a partir de datos de sondeos. Normalmente se adopta un valor algo por encima del valor (el valor m en la Figura 1), cuando se trata de microorganismos no patgenos se suele aceptar una cierta tolerancia. en el valor. Se establece un valor M, nunca esperado si se cumplen las BPE. La diferencia entre M - m es la llamada Zona de alerta cuya amplitud se establece atendiendo a la variabilidad del mtodo de recuento, tipo de alimento, modo de preparacin y poblacin de riesgo. Este valor M ha de establecerse tericamente y la relacin M/m vera entre 3 y 103 dependiendo del tipo de alimento. 3.4.3.- Utilizacin de los valores de referencia Los valores de referencia se deben determinar para cada microorganismo (o grupo de microorganismos) y alimento particular. Estos valores son muy diferentes en funcin de las caractersticas qumicas de cada alimento y, por tanto, no pueden ser tomados como valores absolutos sino como erl reflejo del compromiso entre el coste del proceso de reduccin de la carga microbiana y el beneficio de la estabilizacin e inocuidad del alimento. En cualquier caso, los valores s que representan un lmite absoluto que permite consumir el alimento sin problemas sanitarios. Cuando se realiza el anlisis microbiolgico se pregunta si el alimento se prepar o no de acuerdo a las BPE, y esta pregunta se responde evaluando el nmero de microorganismos: si la prctica de preparacin fue la adecuada sus valores microbianos deben caer dentro del reango de la referencia, si lo exceden es que la prctica no fue buena.

Como norma general se aplica el siguiente cuadro de tolerancia para un anlisis de 10 muestras donde el valor de referencia es 10s y n es la carga microbiana Carga microbiana Nmero de muestras Muestra

n < 10s

10

Aceptada

n < 10s 10s < n < 10s+1

9 1

Aceptada

n < 10s

8 menos

Rechazada

n > 10s+1

una o ms

Rechazada

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS Tema 10 RESUMEN DE LAS PATOLOGIAS MAS IMPORTANTES TRANSMITIDAS A TRAVES DE LOS ALIMENTOS 9.- Enfermedades transmitidas por los alimentos. Origen de los microorganismos patgenos presentes en los alimentos. Generalidades sobre epidemiologa y etiologa de las enfermedades transmitidas por bacterias. Intoxicaciones alimentarias agudas: enfermedades producidas por la presencia en los alimentos de toxinas preformadas de origen bacteriano. Intoxicaciones alimentarias crnicas: micotoxicosis provocadas por mohos productores de toxinas activas por va oral. Infecciones cuya va de transmisin principal no son los alimentos. Virosis transmitidas por los alimentos. Enfermedades por protozoos transmitidas por los alimentos. Enfermedades producidas por helmintos. A. ORIGEN DE LOS MICROORGANISMOS PATOGENOS PRESENTES EN LOS ALIMENTOS:

Pueden ser endgenos (ya estan presentes en el interior de las estructuras del alimento donde pueden provocar zoonosis, enfermedades animales no transmitibles al hombre y enfermedades vegetales no transmitibles al hombre) o exgenos (se incorporan al alimento durante su manipulacin y procesado). Pueden ser agentes patgenos o alterantes (saprfitos). Los agentes endgenos o son incuos (patgenos de plantas) o son eliminados en mataderos (amimales enfermos) o durante el procesado (pasteurizacin). B. GENERALIDADES SOBRE LA ETIOLOGIA Y EPIDEMIOLOGIA DE LAS ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS: 1. Transmisin: Hay que diferenciar entre infecciones e intoxicaciones y entre infecciones con DMI (dosis mnima infectiva) o DI50 (dosis infectiva que produce la enfermedad en el 50 % de la poblacin) bajas o altas. En muchos casos no est totalmente claro si el proceso es intoxicativo o infectivo. La DMI vara entre las personas dependiendo de su estado general de salud y de la forma como se ingieren las bacterias (en ciertas condiciones las DMI pueden ser muy baja por lo que es muy necesaria la higiene). En general las enfermedades tienen un tiempo de incubacin corto (2-10 h.) y suelen cursar con sndromes gastrointestinales. 2. Morbilidad: Solo se declara un 10 % de las toxiinfecciones (aprox.) por lo que la incidencia real de estas enfermedades no est clara. 3. Factores que contribuyen a la produccin de casos y brotes de enfermedades de etiologa microbiana transmitidas por los alimentos. En general hay un doble fallo: (1) Contaminacin del alimento seguido de (2) abuso de temperatura que permite que los microorganismos proliferen. Los alimentos afectados con ms frecuencia son los animales (90 %) y las fuentes de contaminacin suelen estar en los establecimientos donde fueron servidos ms que en las plantas de procesado. 4. Manifestaciones clnicas ms frecuentes y complicaciones de las enfermedades transmitidas por alimentos: En general son enfermedades breves y de buen pronstico. cursan tras 2 - 10 h. de incubacin con sndrome gastroinestinal (dolor intestinal, diarrea, vmitos). En general no tienen complicaciones salvo en poblaciones de riesgo. C. INFECCIONES ALIMENTARIAS TRANSMITIDAS POR BACTERIAS: 1. Salmonelosis: Producidas por algunos serotipos. Su incidencia va en aumento asociada al incremento de animales portadores. Los diferentes serotipos requieren DMI diferentes, aunque hay un gran nmero de ellos que son patgenos. El origen de las salmonelas puede ser endgeno (animales portadores asintomticos) o exgeno; las prcticas ganaderas favorecen la infeccin a travs de los piensos que pueden generar portadores asintomticos y del manejo de los animales en el matadero (aves, cerdos, terneros). En cualquier caso, los nmeros inicales suele ser

pequeos y la contaminacin aparece si el alimento no es tratado correctamente desde el punto de vista trmico. Las medidas profilcticas se dirigen al control de animales portadores, procesamiento de alimentos (pasteurizacin) y reduccin de las posibilidades de contaminacin exgena. Puede ser invasiva o toxignica. 2. Shigelosis o disentera bacilar. Microorganismos productores de cuadros de disentera. Las shigelas son de origen humano y los animales no son reservarios de ellas, por lo que las contaminaciones se producen por va de la manipulacin humana del alimento. La DMI vara mucho dependiendo de si se ingiere la bacteria con alimentos slidos (alta) o lquidos como leche o agua (baja). Las medidas de prevencin se basan en reducir e higienizar la manipulacin humana y evitar el desarrollo del microorganismo con una correcta refrigeracin. Es invasiva. 3. Gastroenteritis por Escherichia coli enteropatgeno. La mayora de los serotipos de E. coli son incuos; pero hay algunos enteropatgenos (enterotoxignicos no invasivos productores de una enterotoxina termolbil de alto peso molecular, TS; y enteroinvasivos que penetran en la mucosa intestinal) productores de enfermedades en nios y adultos y en animales. Para los adultos las vas de contagio son alimentos y agua. No est clara la patogenicidad de las cepas enteropatgenas de animales para el hombre y se supone que la principal va de contaminacin es la exgena. Las medidas profilcticas se dirigen a la eliminacin de animales enfermos, control de la contaminacin por manipulacin humana y refrigeracin adecuada para evitar el crecimiento de las bacterias presentes. 4. Enteritis por Yersinia enterocolitica: Yersimia enterocolitca en una bacteria psicrotrofa que probablemente causa zoonosis y puede transmitirse a travs de alimentos animales infectados. Produce una enfermedad con posibles complicaciones reumatoides. Las medidas profilcticas son similares a las de Salmonella aunque en este caso no sirve la conservacin a baja temperaturas por el carcter psicrotrofo. 5. Diarreas por Vibrio parahaemolyticus y por otros vibrios prximos al V. cholerae. V. parahaemolyticus es un bacilo Gram-negativo presente en las aguas marinas, halotolerante. Produce al ingerirlo una gastroenteritis febril en la que las heces aparecen teidas de sangre. Se ingiere con productos marinos crudos o no bien tratados. Otras especies prximas aparecen en salmueras y salazones. La profilaxis se centra en su eliminacin por coccin, prevencin de la recontaminacin y prevencin de su multiplicacin mediante refrigeracin o congelacin. 6. Enteritis por Campylobacter. Bacteria presente en el intestino de ganado vacuno, perros, aves y ovejas. Causa una infeccin entrica con vmitos, dolor agudo y diarrea explosiva. Es un organismo microaerfilo. Se puede transmitir a travs de los mismo alimentos que Salmonella o Yersimia (carne cruda de cerdo o ave, leche cruda). Produce una infeccin invasiva del epitelio intestinal. La profilaxis se centra en eliminar la bacteria del alimento, prevenir la recontaminacin y conservar adecuadamente. 7. Gastroenteritis producidas por otras bacterias entricas.

La patogenicidad de muchas enterobacterias se debe a la presencia de plsmidos transmisibles a otras bacterias del grupo que no son habitualemtne patgenas. Las formas de propagacin, ditribucin y proliaxis frente a stas son las generales para las enterobacterias. 8. Gastroenteritis bacterianas transmitidas por alimentos de etiologa dudosa. Los alimentos, con excepcin de los fermentados y madurados, que tienen altos recuentos de microorganismos han de considerarse en pricipio, peligrosos, aunque no se detecte en ellos ningn microrganismo patgeno. 9. Enteritis producidas por Bacillaceae Producidas por Clostridum perfringens o por Bacillus cereus. Se requieren altos nmeros de bacterias (105 bact gr-1) y pueden producirse en alimentos tratados trmicamente e, incluso, protegidos frente a la recontaminacin. En C. perfringens los alimentos vehculo son carnes fras o recalentadas y platos a base de carne; en B. cereus arroz y pastas. Patolgicamente ambas enteritis son diferentes: la de perfringens se produce porque se ingieren muchas bacterias que al esporular reformadas (se trata de una intoxicacin), mientras que en B. cereus se trata de una intoxicacin por una toxina preformada. Las esporas de C. perfringens son ubcuas y pueden producir problemas en todo tipo de alimentos, sobre todo carnes, piezas grandes y alimentos precocinados. Las prevencin pasa por enfriar rpidamente el alimento cocinado que no vaya a ser consumido para evitar el desarrollo de las formas vegetativas de la bacteria. D INTOXICACIONES ALIMENTARIAS AGUDAS: enfermedades producidas por la presencia en los alimentos de toxinas preformadas de origen bacteriano. 1. Botulismo: intoxicacin por Clostsiclium botulinum. C. botulinum produce una intoxicacin mediante bajas dosis de una neurotoxina muy potente que produce al esporular. Es una bacteria anaerobia que puede crecer en conservas de alimentos de pH relativamente alto (>4.5) que no se han tratado trmicamente de forma adecuada. Se ha detectado un tipo de bofulismo infantil producido por la ingestin de esporas que germinan y vuelven a esporular en el intestino produciendo de nuevo la toxina. Profilaxis: tratamiento trmico adecuado de las conservas usando tratamiento 12 D u otros agentes coadyuvantes (sal, nitratos) para alimentos con pH > 4.5. La toxina botulnica es termolbil y se destruye si se calienta la conserva. 2. Intoxicacin estafiloccica. Producida por la ingestin de alimentos en los que ha crecido una cepa patgena de Staphylococus aureus productora de enterotoxina termorresistente. La principal reserva de S. aureus es la piel, y cavidad buconasal de operarios que pueden contaminar los alimentos cuyo contenido en agua es bajo (productos de pastelera, jamon curado...) porque a mayor aw otra flora sobrecrece a S. aureus. La enfermedad es muy rpida con vmitos y dolor aguado, suele durar menos de 30 horas. Las medidas profitcticas van encaminadas a dismisnuir la contaminacin y el desarrollo de las bacterias mediante tratamientos trmicos adecuados; la destruccin de las toxinas es muy difcil dada su termorresistencia. 3. Intoxicacin por Bacillus cereus.

B. cereus como C. perfingeus, una bacteria ubcua y su ingestin en bajas cantidades es incua. Produce dos tipos de sndromes: intoxicacin diarrica (asociada a una toxina termosensible similar a la de C. perfingens que se produce durante el crecimiento exponencial y que est asociada a alimentos como sopas de ave, carne, salsas, pudding...) y una forma emtica (asociada a una toxina termorresisitente similar a la de S. aureus y asociada a arroz, y otros alimentos ricos en almidn cocinados). Profilaxis: dada la termorresistencia de las esporas hay que procurar enfriar muy rpidamente los alimentos cocinados ricos en almidn, y conservarlos a baja temperatura, para evitar el crecimiento de las formas vegetativas. 4. Sndromes causados por bacterias productoras de aminas vasopresoras. Muchas bacterias son capaces de decarboxilar activamente aminocidos produciendo aminas vasopresoras causantes de manchas rojas en la piel, mareos y, a veces, dificultades respiratorias. La relaccin dosis - efecto varia mucho de unos individuos a otros. 5. Papel de otras bacterias toxignicas. Quiz algunos estreptococos del grupo D pueden producir algunas toxinas cuando estn en grandes concentraciones (casos exticos y poco relevantes para nosostros). E. INTOXICACIONES ALIMENTARIAS CRONICAS: micotoxicosis provocadas por mohos productores de toxinas activas por va oral. Muchos mohos son productores de substancias proticas de bajo peso molecular y accin txica conocidas como micotoxinas. Elevadas ingestiones de micotoxinas pueden producir cuadros agudos facilmente detectables; pero estos casos son raros, es ms frecuente la intoxicacin por bajas dosis de micotoxinas que pueden producir intoxicaciones crnicas con efectos oncognicos o inhabilitantes en diferentes rganos (hgado, rion, cerebro). Las micotoxinas pueden ingerirse por contaminacin con mohos de alimentos de baja actividad de agua (queso, mermelada, alimentos curados, cereales) o por piensos, en el caso de animales con intoxicaciones crnicas pueden transmitir las toxinas a travs de sus productos (huevos, leche). Debido al bajo peso molecular las micotoxinas suelen ser muy termorresistentes y pueden difundir grandes distancias en los alimentos por lo que tratamientos trmicos suelen ser inefectivos y la simple eliminacin del moho no evita la micotoxina. Existe una gran preocupacin por la actividad toxignica de los mohos considerados beneficiosos presentes en algunos alimentos (queso, embutidos). Las profilaxis se centran en evitar la contaminacin por hongos de los alimentos y piensos (quesos, pan, harinas, cereales, frutas y mermeladas) no solo por razones estticas sino tambin sanitarias. E. INFECCIONES CUYA VIA DE TRANSMISION PRINCIPAL NO SON LOS ALIMENTOS: 1. Bases epidemiolgicas. Hay enfermedades transmitidas por alimentos que no presentan el cuadro de gastroenteritis tpico. En este caso es necesaria la ingestin de un nmero muy reducido de micoorganismos (bacteria, virus o gusano). En el caso de bacterias, cuando estas se ingieren en agua o entre comidas pueden provocar los sndromes con mmeros mucho menores debido a que pasan rpidamente por el estmago y el cido gstrico no puede producir en ellas efecto.

2. Enfermedadades del aparato respiratorio transmitidas por los alimentos. Tanto la difteria, producida por Corynebacterium diphteriae, como la faringitis, producida por Staphylococus pyogenes, pueden ser transmitidas por los alimentos. Ambos microorganismos son termosensibles y un tratamiento trmico adecuado y medidas higinicas para evitar la posterior contaminacin del alimento son suficientes para evitarlo 3. Otras enfermedades transmitidas por los alimentos. Histricamente la leche de vacas mastticas ha sido una va de contagio de tuberculosis producida por Mycobacterium bovis, sin embargo las prcticas de pasteurizacin habituales han eliminado esta va de contagio. Ms relevantes son las bacterias del gnero Brucella. B. melitensis provoca la fiebre de malta y se transmite por la leche de cabra u oveja, B. abortus se transmite por la leche de vaca. Ambos tipos de bacterias pueden destruirse con los tratamientos trmicos habituales de la leche o de la nata o crema. En este sentido es especialmente relevante la utilizacin de leche pasteurizada en la producccin de quesos de cabra u oveja para evitar la transmisin de la brucelosis. 4. Enfermedades entricas bacterianas transmitidas principalmente por el agua: Como se ha comentado, algunos microorganismos tienen DMI muy bajas cuando se ingieren con agua y el estmago est vacio. Salmonella y Shigella pueden producir toxiinfecciones de esta forma. Asimismo Vibrio cholerae se transmite a travs del agua. Por consiguiente es necesario hacer tratamientos de higienizacin del agua para llegar a valores de nmero de microorganismos muy bajos, y utilizar aguas de alta calidad bacteriolgica para cualquier proceso relacionado con los alimentos. F. VIROSIS TRANSMITIDAS POR LOS ALIMENTOS. El nmero de unidades infectivas que puede producir la enfermedad es muy bajo. Normalmente no suelen aislarse en los laboratorios de microbiologa de alimentos porque su manipulacin es tcnicamente compleja. 1.- Hepatitis tipo A Este virus se transmite a travs del agua contaminada con materia fecal y de alimentos muy manipulados en condiciones de higiene deficientes (ensaladas de patatas, frutas contaminadas, zumos contaminados) y productos marinos presentes en zonas costeras contaminadas. El virus es termorresistente por lo que la proflaxis ha de centrarse en la higiene del operario, agua y productos. 2. Otras virosis entricas humanas. Su incidencia real no est muy clara, se han asociado a veces al consumo de productos marinos costeros como mejillones o percebes, presentes en aguas contaminadas y no tratadas adecuadamente desde el punto de vista trmico. 3. Virosis de origen animal. En general los virus que producen enfermedades en los animales no son patgenos para el hombre, ni siquiera los oncognicos productores de tumores. En cualquier caso, estos virus se inactivan por tratamiento trmico. 1.- PICORNAVIRUS: grupo complejo de virus con ARN de doble cadena (aunque no se si todos la tienen o slo algunos). A este grupo pertenece una serie de virus interesantes como el de la Hepatitis a (transmisible por alimentos),. el virus de la polio, el del resfriado, el de la fiebre aftosa (Foot and Mouth Desease) y una serie de virus denominados enterovirtus o echovirus que viven principalmente en el intestino y que pueden causar efectos

citopticos aunque en ocasiones las enfermedades que producen no son evidentes. Es interessante tambin tener en cuenta los denominados reovirus causantes de patologas tanto a nivel de tracto respiratorio (resfriados) como a nivel intestinal (diarreas); [quiz estos virus sean responsables de los procesos diarricos asociados a ciertos resfriados u otros procesos febriles, <esto es opinin ma>] . (ref. H.J. Eggers, 1995. Picornaviruses: A Historical View. ASM News 61: 121-124). G. ENFERMEDADES ALIMENTOS. POR PROTOZOOS TRANSMITIDAS A TRAVES DE LOS

Los protozoos parsitos tienen como hbitat habitual el intestino humano de donde salen a travs de las heces para, a veces, ser transportados por otros portadores secundarios. En algunas ocasiones pueden atravesar la barrera intestinal y producir infestaciones masivas. Normalmente adoptan formas de resistencia denominados quistes. Su deteccin en animales es con frecuencia difcil y por tanto la medida profilctica ms segura es el tratamiento trmico adecuado puesto que son organismos termosensibles. Las patologas ms relevantes son la disentera amebiana (producida por Entamoeba histolytica, transmitida a travs del agua, frutas y verduras), giardiasis (producida por Giardia lamblia y transmitida a travs del agua en zonas endmicas), toxoplamosis (Toxoplasma gondii transmitido a travs de la carne cruda, zoomosis de animales de compaa) y la cristosporidiosis (Cryptosporidium parvum, transmitido a travs de la carne cruda). H. ENFERMEDADES POR HELMINTOS. Los helmintos tienen ciclos biolgicos ms complicados que los de los protozoos; pero como ellos forman quistes que, al ser ingeridos, producen la infestacin del hombre. Otra va de entrada son las aguas contaminadas con huevos de los gusanos. Las enfermedades ms importantes producidas por helmintos son: Teniasis (producidas por Tenia solium de origen porcino o T. saginata de origen vacuno, que forma en los animales unos quistes denominados cistercercos), Difolobotriasis (producida por Diphyllobothrium latum, parsito de peces), la Hidatidosis o Equinococosis (producida por Echinococcus granulosus, enfermedad muy grave por los quistes que causa el gusano; al hombre suele transmitirse por los perros, aunque otras carnes o aguas contaminadas pueden ser su vehculo), la triquinosis (producida por Trichinella spiralis que forma quiste intramusculares en cerdos de granja); la anisakiasis (producida por Anisakis marina transportada por peces como el arenque); Capilariasis (producida por Capillaria philipina y transmitida por el consumo de carnes o pescados crudos, en una enfermedad que no se ha descrito en nuestra zona geogrfica) y Ascaridiosis (producida por Ascaris lumbricoides transmitida por contacto persona-persona cuando la higiene no es correcta y hay contaminacin fecal. En general las enfermedades producida por helmintos se deben al consumo de alimentos contaminados endgenamente (animales infestados) o exgenamente (contaminacin fecal en aguas u hortalizas) que se consumen crudos o insuficientemente lavdados y cocinados. Las medidas profilctica, a parte de las higinicas, pasan por la congelacin y tratamiento trmico adecuado de las carnes infestadas para inactivar las larvas enquistadas. En muchos casos, el veterinario puede detectar la enfermedad por estudio de las canales (cisticercosis y triquinosis). CONCLUSION: Aisladamente cada una de las patologas anteriores puede prevenirse mediante un tratamiento adecuado del alimento; sin embargo hay que extremar este cuidado cuando se trata de produccin de alimentos o comidas a gran escala puesto que en estas condiciones es ms factible una contaminacin que produce un elevado nmero de vctimas.

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS Tema 9 FACTORES QUE AFECTAN A LA SUPERVIVENCIA DE LOS MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos: Temperatura: Refrigeracin, Congelacin, Altas temperaturas. Radiacin ultravioleta. Radiacin ionizante. Actividad de agua reducida. El pH y la acidez. Potencial redox. Acidos orgnicos. Sales de curado y substancias anlogas. Los gases como conservantes. 1.- TEMPERATURA.. - Segn su comportamiento frente a la temperatura, los organismos pueden ser trmofilos, mesfilos y psicrotrofos. (Tabla 1) 1.1.- Refrigeracin. - A temperaturas inferiores a la ptima, la velocidad de crecimiento de los microorganismos disminuye y los periodos de latencia se alargan mucho. - A una temperatura de refrigeracin (0 - 5 C) los organismos psicrfilos crecen ms rpidamente que los mesfilos. Po tanto, la baja temperatura supone un factor de seleccin de la flora del alimento de gran importancia. - Cuando se enfra rpidamente un alimento muchas de las bacterias mesfilas que normalmente resistiran la temperatura de refrigeracin, mueren como consecuencia del choque de fro. Esto es ms frecuente en Gramnegativas que en Gram-positivas. - A baja temperatura las rutas metablicas de los microorganismos se ven alteradas, como consecuencia de su adaptacin al fro. Estos cambios metablicos pueden dar lugar a que se produzcan deterioros diferentes, causados por los mismos microorganismos a diferentes temperaturas. - El deterioro de alimentos refrigerados se produce por microorganismos psicrofilos porque, aunque sus velocidades de crecimiento son lentas, los periodos de almacenamiento son muy prolongados. - Los microorganismos patgenos son, en su mayora, mesfilos y no muestran crecimiento apreciable, ni formacin de toxinas, a temperaturas de refrigeracin correctas. Ahora bien, si la temperatura no es controlada rigurosamente puede producirse un desarrollo muy peligroso rpidamente. 1.2.- Congelacin. - La congelacin detiene el crecimiento de todos los microorganismos. Los superiores (hongos, levaduras, helmintos) son ms sensibles que las bacterias y mueren. - A temperaturas ms bajas (-30 C) la supervivencia de las bacterias es mayor que en temperaturas de congelacin ms altas (-2 a -10 C), sin embargo estas temperaturas tambin deterioran el alimento ms que las ms bajas. - La congelacin puede producir lesiones subletales en los microorganismos contaminantes de un alimento. Este aspecto hay que considerarlo al hacer control microbiolgico.

- Durante la congelacin la carga microbiana continua disminuyendo. Sin embargo, las actividades enzimticas de las bacterias pueden continuar dando lugar a ms deterioro. - Tras la congelacin los microorganismos supervivientes pueden desarrollarse en un ambiente en el que la rotura de la integridad estructural del alimento como consecuencia de la congelacin puede producir un ambiente favorable para el deterioro microbiano. 1.3.- Altas temperaturas. - Las temperaturas superiores a las de crecimiento ptimo producen inevitablemente la muerte del microorganismo o le producen lesiones subletales. Las clulas lesionadas pueden permanecer viables; pero son incapaces de multiplicarse hasta que la lesin haya sido reparada. - Aunque se han observado excepciones, est perfectamente establecido que la cintica de termodestruccin bacteriana es logartmica. - Se pueden determinar para cada microorganismo y alimento los valores de termodestruccin D y z. - La velocidad de termodestruccin se ve afectada por factores intrnsecos (diferencia de resistencia entre esporas y clulas vegetativas), factores ambientales que influyen el crecimiento de los microorganismos (edad, temperatura, medio de cultivo) y factores ambientales que actan durante el tratamiento trmico (pH, aw tipo de alimento, sales, etc.). 2.- RADIACION ULTRAVIOLETA. - La radiacin ultravioleta produce una disminucin exponencial en el nmero de clulas vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiacin. Por tanto se pueden calcular los valores D para la irradiacin. - Existe una falta de informacin precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiacin U.V.: diferentes cepas de una misma especie pueden tener una resistencia distinta. - El mayor valor del tratamiento con radiaciones U.V. se encuentra en el saneamiento del aire, aunque tambin pueden aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos. 3.-RADIACION IONIZANTE. - La radiacin ionizante es altamente letal, puede ajustarse su dosis para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetracin es uniforme. - Es letal por destruccin de molculas vitales de los microorganismos, esto los consigue sin produccin de calor, por lo que los alimentos se conservan frescos. La mayora de los daos son a nivel ADN. - La sensibilidad a la radiacin de los microorganismos difiere segn las especies e incluso segn las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre cepas de una mismas especie son generalmente lo suficientemente pequeas para no tenerlas en cuenta a efectos prcticos. - Las bacterias Gram-negativas son generalmente ms sensibles a la irradiacin que las Gram-positivas y las esporas an ms resistentes. - En general, la resistencia a la radiacin de los hongos es del mismo orden que la de las formas vegetativas bacterianas.

- Los virus son an ms resistente que las bacterias a la radiacin.

4.- ACTIVIDAD DE AGUA REDUCIDA. - Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponibles, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metablicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (aw). La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentracin de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extraccin del agua o mediante la adicin de solutos. - La deshidratacin es un mtodo de conservacin de los alimentos basado en la reduccin de la aw, durante el curado y el salazonado, as como en el almbar y otros alimentos azucarado son los solutos los que, al ser aadidos, descienden la aw. -Un pequeo descenso de la aw es, a menudo, suficiente para evitar la alteracin del alimento, siempre que esta reduccin vaya acompaada por otros factores antimicrobianos. - La mayora de las bacterias y hongos crece bien a aw entre 0,98 y 0,995; a valores aw ms bajos la velocidad de crecimiento y la masa celular disminuyen a la vez que la duracin de la fase de latencia aumenta hasta llegar al infinito (cesa el crecimiento). - Algunos tipos de microorganismos son capaces de crecer en condiciones de alto contenido de sal (Baja aw). Dependiendo de la capacidad de supervivencia a baja aw se denominan osmfilos, xerfilos y halfilos (segn va aumentando su requerimiento de sal). - La baja aw reduce tambin la tasa de mortalidad de las bacterias: una baja aw protege los microorganismos durante tratamientos trmicos. 5.- pH Y LA ACIDEZ. - En general, la presencia de cidos en el alimento produce una drstica reduccin de la supervivencia de los microorganismos. Los cidos fuertes (inorgnicos) producen una rpida bajada del pH externo, aunque su presencia en la mayora de los alimentos es inaceptable. Los cidos orgnicos dbiles son ms efectivos que los inorgnicos en la aciclificacin del medio intracelular; se supone que esto ocurre porque es ms fcil su difusin a travs de la membrana celular en su forma no disorciada (lipoflica) y posteriormente se disocian en el interior de la clula inhibiendo el transporte celular y la actividad enzimtica. - La mayora de los microorganismos crecen a pH entre 5 y 8, en general de hongos y las levaduras son capaces de crecer a pH ms bajos que las bacterias. Puesto que la acidificacin del interior celular conduce a la prdida del transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar ms energa de mantenimiento y, a una velocidad variable segn las especies, se produce la muerte celular. 6.- POTENCIAL REDOX. - Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. El potencial redox indica las relaciones de oxgeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energa y sintetizar nuevas clulas sin

recurrir al oxgeno molecular: los microorganismos aerobios requieren valores redox positivos y los anaerobios negativos. cada tipo de microorganismo slo puede vivir en un estrecho rango de valores redox. 7.- ACIDOS ORGANICOS. - La actividad antimicrobiana de un cido orgnico o de su ster se debe a las molculas no disociadas de este compuesto, porque esta forma molecular es la ms soluble en las membranas celulares, por esto slo los cidos orgnicos lipoflicos tienen actividad antimicrobiana. - Estos compuesto inhiben el crecimiento de los microorganismos o los matan por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento del transporte de substratos y el transporte de electrones de la forforilacin oxiclativa. como consecuencia de esto las bacterias no pueden obtener energa y mueren. - La mayoras de los cidos orgnicos resultan poco eficaces como nhibidores del crecimiento bacteriano a los pH de 5.5 a 5.8, y son ms eficaces a altas concentraciones y pH ms bajos. (Cuando el estado disociado del cido es ms infrecuente). Su empleo ms frecuente es como micostticos. - De todos los cidos el ms efectivo es el actico. 8.- SALES DE CURADO Y SUBSTANCIAS ANALOGAS. - Las sales de curado son el cloruro sdico y los nitratos o nitritos de sodio y potasio; estos productos modifican el alimento base en el color, aromas, textura y sensibilidad al crecimiento microbiano. - A las concentraciones y bajo las condiciones corrientemente utilizadas, los agentes de curado no causan una destruccin microbiana rpida; ms bien retrasan o previenen el desarrollo de los microorganismos perjudiciales de los productos sin tratar por el calor y el de los termotolerantes no esporulados y evitan el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento trmico ms drstico aplicado a ciertos productos curados. - Se desconoce el mecanismos excto de la inhibicin de las bacterias por el nitrito que, aunque no previene la germinacin de las esporas, evita su desarrollo. 9.- GASES COMO CONSERVADORES. - Diversos gases y vapores naturales o artificiales destruyen o inhiben los microorganismos. El nitrgeno y el oxgeno se usan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de los alimentos pero su fin primario no es la inhibicin de los microorganismos; diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con xito en la desinfeccin de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo, pero no se han aplicado a los alimentos. - El CO2 inhibe el crecimiento de microorganismos sobre los alimentos con eficiencia creciente cuanto ms desciende la temperatura. Este efecto se manifiesta tanto en bacterias como en hongos por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generacin durante la fase logartmica. Su mecanismos de inhibicin no se conoce con claridad, aunque se debe a la presencia del CO2 (y quiz a la formacin de cido carbnico) y no a la ausencia de oxgeno. Los mohos y las levaduras son alga ms resistentes al CO2 que las bacterias (las Gramnegativas ms sensibles que las Gram-positivas). - La actividad antimicrobiana del dixido de azufre est relacionada con la forma molecular no ionizadas: no se conoce un modo de accin, aunque este gas es muy reactivo y probablemente interacciona con muchos componente celulares. Su accin txica es selectiva: las bacterias son ms resistentes que los mohos y las levaduras, por la que este gas se emplea frecuentemente como antifngico.

- El xido de etileno resulta muy txico para los microorganismos y su actividad est relacionada con su accin como agente alquilante. Los mohos y levaduras son ms sensibles que las bacterias y estas que las esporas.

METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos. Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales: Principios ecolgicos, Fundamentos de los procedimientos analticos (heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, transporte de muestras, confianza en los procedimientos, dao o lesin subletal, evaluacin sistemtica de los medios de cultivo): Necesidad de valores de referencia. Muestreo: muestra nica, toma de muestras representativas. Utilizacin de microorganismos como marcadores (ndices e indicadores). 1. Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos. El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter preventivo sino que simplemente es una inspeccin que permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede lograr un aumento de la calidad microbiolgica mediante el anlisis microbiolgico sino que lo que hay que hacer es determinar en la Industria cules son los puntos de riesgo de contaminacin o multiplicacin microbiana (los llamados Puntos Crticos del proceso) y evitarlos siguiendo un cdigo estricto de Buenas Prcticas de Elaboracin y Distribuccin del alimento (BPE). La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiolgica y no en comprobar la calidad microbiolgica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relacin coste beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar). En el dasarrollo de las BPE hay que hacer un anlisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patgeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnolgicos. Este riesgo depede de de la DMI (Dosis Mnima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asmismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el nmero de raciones o partes consumidas por la poblacin en un determinado tiempo. La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la frmula l = log10(N0/Nc) donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo. Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiolgica del producto disminuyen y el anlisis microbiolgico es ms consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE. 2. Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales. A.- Principios ecolgicos: Es necesario considerar la distribucin desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos. El nmero de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiolgica de los alimentos debe limitarse al mnimo necesario para as poder aumentar el nmero de anlisis. Los criterios de anlisis aplicados han de ser especficos de cada alimento poque son diferentes los microorganismos patgenos y alterantes de cada tipo de alimento. B.- Fundamentos de los procedimientos analticos:

B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos: El factor ms importante en el anlisis es el muestreo, que incluye: (a) Evaluacin de la muestra necesaria para evitar la distorsin producida por los microorganismo que se encuentran en diferentes partes de las superficies, por ejemplo de las canales o de las mquinas, sistemas de alimentos heterogneos (ensaladas, platos congelados, etc.); (b) Determinacin del modo ptimo de remocin del micoorganismo de la muestra o lugar de muestreo y (c) La evitacin de la contaminacin ambiental durante la toma o transporte de muestras. B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de las muestras se produzca: (a) Multiplicacin de los microorganismos presentes y (b) Inactivacin de algn microorganismo. En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas del entorne de 0 C por un tiempo no superior a las 24 horas, excepto en el caso de grmenes termotrofos.
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B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10de la flora normal del alimento, flora sta inocua. Es necesario utilizar medios selectivos para detectar estos microorganismos presentes en proporciones tan bajas. Como norma general conviene probar experimentalmente los medios usados para determinar su selectividad y su productividad; as como no debe usarse un medio diseado para un producto en otro producto diferente porque las condiciones ecolgicas pueden ser diferentes dando lugar a una distorisin de los resultados.

B.4.- Dao o lesin subletal: Tratamientos tecnolgicos pueden producir daos subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente a medios selctivos. Son necesarios medios de recupe-racin en los que hay que considerar: (a) El tipo de microorganismo a recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carcter y la intensidad del dao infligido, (c) El tipo de alimento en el que est el microorganismo y (d) El medio selectivo final. Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a seguir. De una forma general, hay dos tipos de tratamiento de recuperacin: recuperacin en lquido (2 h. 25 en agua peptona) o en slido (>6 h. en agua LB o similar, incubando luego 4 - 6 h. a 25 C) seguido del tratamiento selectivo (siembra en medio selectivo o recubrimiento con agar blando selectivo). B.5.- Evaluacin siotemtica de los medios de cultivo: Dada la variabilidad debida a pequeos errores en la preparacin de los medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es necesario hacer controles peridicos que permitan comprobar tanto que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de clulas aisladas (colonias aisladas) como que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los medios de cultivo se denomina ecomtrico. C. Necesidad de valores de referencia. Es necesario comparar los resultados con valores microbiolgicos de referencia. Estos valores de referencia no son formulaciones tericas de la carga microbiana aceptable, sino los valores obtenidos cuando la produccin del alimento se ha ajustado a las BPE (Buenas Prcticas de Elaboracin). La Microbiologa de alimentos puede evaluar el riesgo asociado a estos valores de referencia y cuantificar los valores asociados a un alimento concreto para medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de las BPE). 3. Muestreo. El muestreo consiste en separa una serie de muestras representativas del lote para someterlas al anlisis microbiolgico. A. Muestreo nico

Cuando hay que hacer un muestreo de una partida nica de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboracin y conservacin del alimento. Esto es especialmente importante en partidas de alimentos importados, sobre todo los enlatados. Ningn muestreo nico puede dar una garanta total de calidad microbiolgica del alimento; si se analizan 30 muestras de una partida suficientemente grande y no aparece ninguna en malas condiciones microbiolgicas, an hay una probabilidad razonable de que el 10% del lote sea microbiolgicamente defectuoso. Como norma general, si se trata de un lote desconocido es conveniente analizar un nmero de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeo. Aunque estos valores hay que adecuarlos a las condiciones reales. Cuando se analiza una muestra nica el mejor criterio de seguimiento son las especificaciones del fabricante. Las muestras nicas estn siempre sometidas a una gran probabilidad de falsos negativos. B. Analisis repetido. Se pueden definir dos tipos de riesgomicrobiolgico: (a) el riesgo del consumidor: probabilidad de aceptacin de lotes substndard y (b) el riesgo del fabricante: probabilidad de rechazo de lotes substndard. Un sistema de muestras basado en el anlisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligar al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor. C Planes de muestreo de tres categoras. Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma microbiolgica establecida conforme a los valores microbiolgicos de referencia. Clase: aceptable, grado intermedio, inaceptable. [En aquellos casos en que el obtener valores ms altos que los de referencia no hace inaceptable el alimento]. D. Toma de muestras representativas. Una vez decidido el nmero de muestras que hay que tomar, han de seleccionarse stas de forma estadsticamente representativa utilizando tablas de nmero al azar. Dentro de cada unidad hay que tomar muestras representativas de todos los constituyentes del alimento, para ello se debe homogeniezar la muestra usando batidoras o stomacher. 4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores (indices e indicadores). A. Introduccin histrica, terminologa y bases de su utilizacin. Historicamente, desde hace un siglo se estudia la deteccin de, primero, E. coli y posteriormente, el grupo coliaerogenes (enterobacteriaceas) como ndice de contaminacin final en lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi. B. Terminologa Microorganismo ndice: aqul cuya presencia aletar de la posible presencia de un microorganismo patgeno relacionado ecolgicamente con l. (Ej.: E. col ndice de S. typhi). Microorganismo indicador: aquel cuyo mumero indica un tratamiento inadecuado o una contaminacin posterior del alimento analizado.

Un microorganismo dado puede actuar como ndice e indicador simultaneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patgeno, se siguen llevando a cabo anlisis de microorganismo determinados como marcadores por razones de economa, rapidez y sensibilidad. Los princiaples marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de Lancefield. MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Tema 12 METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. II. ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES Recuento de microorganismos viables totales. Mtodos fsicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos qumicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos inmunolgicos. Exmen de superficies. Recuentos de mohos y levaduras. 1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras lquidas u homogeneizadas). - Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento. - Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubacin (mesfilos, psicrfilos) los microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales. - Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del proceso. - Hay cuatro tcnicas biolgicas bsicas tcnicas de recuento de viables:. 1.- Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count). 2.- Determinacin del nmero ms probable. 3.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables. 4.- Contaje microscpico directo. 1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente ms diludas de la muestra.

2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie especficamente los cidos nucleicos). 3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct Epifluorescence Filter Technique (tcnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teir las clulas bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las clulas somticas). La deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son ms fcilmente dtectables. 4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio. 5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin. 6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento. 7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto. 8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos). 9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios. 10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias. ---------------- X ---------------- Adems de las tcnicas de recuento basadas en la formacin de colonias observable (tcnicas biolgicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en tcnicas qumicas, fsicas e inmunolgicas.

2. Mtodos fsicos para la detencin de microorganismos. A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El mtodo se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como funcin del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 - 107 clulas por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogneo sin escalones. B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeos cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio

de cultivo con una composicin definida de azcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas mediante los termogramas de su metabolizacin de los azcares presentes en el medio. C) Citometria de flujo: Mtodo basado en hacer pasar una a una las clulas de una suspensin por un sistema de deteccin; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parmetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersin de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

3. Mtodos qumicos de deteccin de microorganismos. A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicacin. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina. B) Lisado de Limulus: Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del lipopolisacrido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no-viables. Es muy rpido. C) Sondas de cidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern. D) PCR: Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en cuestin. E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida. F) Radiometria: Medida de la transformacin de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente. G) Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos. 4. Mtodos inmunolgicos. Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas mviles de Salmonella y otras bacterias) A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molcula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El mtodo tambin se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicacin ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez. B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la deteccin de Salmonella, el antisuero no se aade al alimento sino que se efecta un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de seleccin para evitar falsos positivos. C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cmaras de agar blando. Una de las cmaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias mviles de este gnero atraviesan la cmara selectiva

y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo especfico por lo que se forma una banda de aglutinacin cuando entre Salmonella. D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioistopo de un antgeno determinado (toxina producida por una bactera patgena) y su posterior deteccin por anticuerpos especficos fijados sobre un soporte slido. E) ELISA: El mtodo es similar al radioinmunoensayo: el antgeno se fija en un soporte slido, se trata con el antisuero correspondiente y la interaccin se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestin o a un segundo anticuerpo de revelado. El mtodo se ha usado para deteccin de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli. F) Difusin en gel: Mtodo de Ouchterlony para deteccin de antgenos. 5. Examen de superficies. - Mtodos dirigidos a detectar y medir los nmeros de microorganismos presentes en superficies contaminadas. - Algunas veces es necesario aadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie. - El mtodo ms clsico de obtencin de muestra es el uso de torundas de algodn o de alginato clcico. Las muestras se recogen en seco o en hmedo y se depositan sobre medios de cultivo lquido (generales o de enriquecimiento). - En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar. 6. Recuento de mohos y levaduras. Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22C o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario aadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es ms rpido que el de los mohos. MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS Tema 13 Mtodos generales de anlisis microbiolgico de los alimentos. III Deteccin de microorganismos ndices e indicadores. Deteccin de enterobacterias: principios, aspectos prcticos, metodologa. Deteccin de Escherichia coli y coliformes: principios, metodologa. Estreptococos del grupo D de Lancefield: principios, metodologa. Estreptococos del grupo Mitis-Salivarius. Deteccin de Bacillaceae. DETECCION DE ENTEROBACTERIACEAS Principios generales: El empleo de las enterobacterias (coliformes y no coliformes) como microorganismos indicadores se basa en que estas bacterias son destruidas por los tratamientos de pasteurizacin, trmicos o clorado de las aguas con gran facilidad. Por esto, la presencia de altos valores de enterobactericeas en los

alimentos es sntoma de fallos en el proceso de elaboracin o de conservacin que pueden acarrear riesgos para el consumidor. Su empleo como indicadores es preferible al simple anlisis de coliformes (bacterias lactosa positivas) porque la frecuencia de estos ltimos puede ser menor, su determinacin incierta (caso de cepas de Escherichia coli fermentadoras lentas o caso de cepas no fermentadoras en Enterobacter) y a la menor sensibilidad de las pruebas para coliformes. Para cada alimento se puede determinar un factor denominado e : e = (ufc/gr de enterobacterias)/(ufc/gr de grupo de inters) donde ufc/gr indica el nmero de unidades formadoras de colonias (bacterias viables) de cada uno de los dos grupos. De esta forma se puede calcular el e ca (coli-aerogenes) y el e s (Salmonella). Este valor es variable entre 1 y 106 dependiendo del tipo de microorganismo y del alimento en cuestin. Aspectos prcticos: El desarrollo de mtodos especficos para la deteccin de enterobactericeas totales puede ser una buena estrategia en funcin de la relacin coste/beneficio. Esta deteccin puede ser la nica que se lleve a cabo en regiones con pocos recursos analticos. Siempre que sea posible hay que completar el estudio con el anlisis especfico de enteropatgenos y hay que valorar los riesgos de la presencia de "falsos positivos" (altos valores de enterobactericeas sin presencia de enteropatgenos, lo que apoya su utilizacin como indicadores en vez de como ndices) y de "falsos negativos" ( presencia de Salmonella spp. cuando los valores de enterobactericeas son bajos). Este ltimo riesgo puede calcularse en funcin del valor de e s determinado para cada alimento. Cuando los recuentos de enterobactericeas son altos y el valor de e s tambin lo es (>104 el clculo del riesgo es inmediato. Los problemas surgen cuando los valores de e s son bajos, ms an si los valores de enterobactericeas tambin lo son. En estos casos es necesario hacer recuentos adicionales de patgenos intestinales porque el riesgo de su presencia puede ser mayor e inaceptable. En la mayora de los casos estudiados se ha comprobado que el recuento de enterobactericeas supone una garanta suficiente para el consumidor.; en cualquier caso, los resultados son ms fiables que cuando se utilizan como indicadores slo los recuentos de coliformes porque stos ltimos suelen ser ms bajos y, por lo tanto, ms sujetos a error. Metodologa: Los mtodos generales son el uso del Agar con Cristal Violeta, Rojo Neutro, Bilis y Glucosa como medio selectivo y, como medio de enriquecimiento, Caldo tamponado con Cristal Violeta, Bilis y Glucosa. En estos medios, la Bilis supone el agente selectivo principal ayudado por el colorante Cristal Violeta; el rojo neutro es indicador de pH para detectar la fermentacin. Hay que tener en cuenta la posible presencia de organismos daados por la situacin biolgica del alimento (baja aw, bajo pH), por las condiciones desfavorables de almacenamiento (caso de microorganismos no esporulantes, fro, congelacin) o por el tratamiento por calor. Hay que distinguir tres niveles de identificacin: 1 Fase de presuncin o probabilidad (deteccin de microorganismos que crecen en Agar-Cristal-Violeta-Rojo-Neutro-Bilis-Glucosa o microorganismos productores de gas en caldo con Verde Brillante); 2 Fase de confirmacin (deteccin de microorganismos con respuesta positiva en medio de MacConkey); y 3, Fase de determinacin (pruebas finales de fermentacin de la glucosa y prueba de la oxidasa). DETECCION DE Escherichia coli Y DE COLIFORMES

Principios generales: Del origen fecal de esta bacteria se concluye que su presencia en un alimento indica que ste ha tenido contacto con, y por tanto est contaminado por, materia de origen fecal. La supervivencia de estas bacterias en medios no entricos es limitada por lo que su presencia indica una contaminacin reciente. Por estas razones, E. coli es el microorganismo ndice ideal para la deteccin de contaminaciones recientes. La identificacin del grupo coli-aerogenes se hace mediante la deteccin de microorganismos capaces de fermentar lactosa a 42 en presencia de un 2% de bilis y de cristal violeta. En alimentos tratados tambin conviene comprobar la presencia de coli-aerogenes mediante la produccin de gas en verde brillante con 2% de lactosa, aunque esto no indica claramente contaminacin fecal debido a los mltiples orgenes de las bacterias de este grupo. No es recomendable el uso del concepto de coliformes fecales definido por las que crecen en presencia de sales biliares a 40-42 porque el grupo no est definido taxonmicamente y las diferencias experimentales en los procesos de deteccin son muy crticas. Metodologa: El mtodo es sencillo: incubacin en medio de MacConkey a 44C en anaerobiosis. Anlisis de las colonias positivas para deteccin de la produccin de gas en medio con lactosa y de indol en medio con triptfano, ambas determinaciones a 44C. Cuando los nmeros de bacterias del grupo son del orden de 1 cfu/ml 1 cfu/10 gr de material el mtodo empleado es el descrito. Si el nmero es inferior se realiza un anlisis del nmero ms probable y un enriquecimiento con caldo lactosado con verde brillante analizndose posteriormente los tubos positivos en medio de MacConkey. Las bacterias de este grupo pueden entrar en un proceso de autoesterilizacin debida a la produccin de cidos en sus procesos de fermentacin, cidos que terminan por matarlas. Por ello es necesario utilizar medios tamponados. En muchos casos es necesario hacer un tratamiento de recuperacin de los microorganismos daados en los procesos de preparacin del alimento. E. coli es un buen ndice mientras que las coliformes en general slo son buenos ndices si los nmeros son inaceptablemente altos. Esto es debido a que el origen de E. coli es nicamente intestinal, mientras que las coliformes pueden tener muchos otros orgenes. La deteccin de E. coli es muy importante en el anlisis de aquellos alimentos compuestos en los que el tratamiento de cada una de las partes haya sido diferente. ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO D DE LANCEFIELD Principios: Los estreptococos del grupo D de Lancefield son microorganismos Gram-positivos de origen entrico. El grupo est formado por enterococos (Streptococcus faecalis y S. faecium) y por S. bovis y S. equinus. Todos los estreptococos de este grupo se encuentran en las heces. Son microorganismos muy resistentes a los tratamientos trmicos, de congelacin o de desecacin, y a tratamientos con detergentes y desinfectantes. Su supervivencia en ambientes libres es muy alta. Por todo ello no pueden usarse como ndicadores de contaminacin fecal reciente, aunque son tiles en el anlisis de alimentos tratados trmicamente y que tienen una baja actividad de agua. Tambin son tiles para determinar la eficacia de los sistemas de desinfeccin y de limpieza. Los estreptococos del grupo D de Lancefield pueden usarse como ndices de patgenos entricos muy resistentes, como puede ser el virus de la hepatitis A.

Metodologa: su deteccin se basa en su metabolismo fermentativo: carecen de cadena respiratoria y, por lo tanto, son insensibles a la azida sdica. Los medios de cultivo se basan en el empleo de inhibidores de la flora acompaante (azida sdica o sales biliares en altas concentraciones); como agente indicador se utiliza la esculina. Los alimentos de origen animal o vegetal obtenidos por fermentacin pueden tener unos contenidos muy altos en estreptococos del grupo D que estn presentes como flora natural. En cualquier caso, nmeros excesivamente altos de estos microorganismos pueden causar problemas toxicolgicos porque son productores de aminas vasopresoras. ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO Mitis-Salivarius Estos microorganismos corresponden al grupo de indicadores de contaminacin por contenido del tracto bucofarngeo. Es importante su determinacin en aquellos alimentos preparados para colectividades (empresas de catering, grandes restaurantes). El mtodo de deteccin se basa en el empleo de agar nutritivo tamponado que contenga telurito, sacarosa, azul tripn y cristal violeta. La incubacin se realiza a 37C. En este medio de cultivo las bacterias de este grupo forman colonias de color azul plido o azul, y las de otros estreptococos de color azul oscuro o negro. DETECCION DE Bacillaceae Prueba para evaluar la contaminacin post-tratamiento: En un alimento tratado trmicamente de forma adecuada las nicas bacterias que pueden, en la prctica, estar presentes son las que hayan sobrevivido el tratamiento en forma de esporas. Por esto, el recuento de viables ha de ser el mismo cuando se hace de forma estndar que cuando se hace sometiendo previamente la muestra a un tratamiento equivalente al de esterilizacin (80c, 1 min). Cuando se realiza la medida de esta manera y se observan diferencias stas son debidas a contaminacin post-tratamiento ya que el tratamiento a 80C durante 1 min. elimina todas las formas vegetativas sin daar las esporas ms termosensibles, y activa, simultneamente, la germinacin de las esporas presentes en el alimento. Esporas de termorresistencia elevada: hay esporas que son muy termorresistentes y que pueden sobrevivir en conservas appertizadas. Para detectarlas se realiza una dilucin de la muestra en un caldo de infusin de cerebro y corazn y se la somete a un tratamiento de 120C durante cuatro minutos. Las colonias supervivientes se recuentan tras una incubacin a 50C. Volver TEMA 13 ltima actualizacin 960515 Valores microbiolgicos de referencia para los alimentos Principios. Estudios exploratorios. Anlisis de puntos crticos. Deduccin de los valores de referencia. Fundamentos ecolgicos de la eleccin de criterios microbiolgicos y de la fijacin de valores de referencias: alimentos proteicos, alimentos de pH cido, alimentos emulsionados, alimentos con actividad de agua reducida, alimentos precederos pasterizados pero no envasados, alimentos congelados, semiconservas envasadas, alimentos tratados trmicamente. Concordancia entre los valores y los mtodos. 1.- Principios. El anlisis microbiolgico de los alimentos tiene dos finalidades:

(1) la comprobacin de la calidad de las prcticas de elaboracin del alimento (2) la comprobacin de la calidad aceptable de los alimentos en el mercado internacional. Los valores de referencia son aqullos que indican los lmites mximos de microorganismos presentes en los alimentos elaborados de acuerdo a las buenas prcticas de elaboracin (BPE). Para decidir el nmero y los criterios que se usen como valores de referencia ha de seguirse una serie de principios: (1) El nmero de criterios a valorar ha de limitarse de modo estricto para poder incrementar el nmero de muestras analizadas por un laboratorio. (2) Los criterios han de escogerse atendiendo a consideraciones ecolgicas: han de referirse a microorganismos que interfieren con la salubridad del alimento (microorganismos ndices) o que indiquen falta de seguridad o perjudiquen su inocuidad (microorganismos indicadores). (3) Los criterios han de formularse con sumo cuidado en trminos cuantitativos (considerando los errores de la medida y la distribucin de los microorganismos en el alimento). (4) Los microorganismos han de denominarse de forma taxonmicamente correcta. (5) Los mtodos han de ensayarse, de describirse con todo detalle para que puedan repetirse en diferentes laboratorios con resultados coherentes entre s. (6) Los valores de referencia numricos han de deducirse de muestras obtenidas despus de tratamiento siguiendo las BPE.

2.- Procedimiento de determinacin de los valores de referencia. 2.1.- Sondeos o estudios exploratorios. En primer lugar seleccionar ms de 10 industrias y valorar sus BPE corrigindolas si es necesario. Cuando se han corregido errores se toman alrededor de 10 muestras por empresa y se valoran los criterios seleccionados y con los datos obtenidos se confeccionan curvas de distribucin (Fig. 1), en las que se calcula el percentil 95% ( ) que suele estar 1 2 rdenes de magnitud por debajo de los valores mximos aceptables (DMI o NMA nivel mnimo de alteracin). Si los valores de se aproximan a los DMI o a los NMA hay que revisar las tcnicas de elaboracin y distribucin de los alimentos antes de proceder a una nueva estimacin de los valores de referencia. 2.2.- Deduccin de los valores de referencia a partir de datos de sondeos. Normalmente se adopta un valor algo por encima del valor (el valor m en la Figura 1), cuando se trata de microorganismos no patgenos se suele aceptar una cierta tolerancia. en el valor. Se establece un valor M, nunca esperado si se cumplen las BPE. La diferencia entre M - m es la llamada Zona de alerta cuya amplitud se establece atendiendo a la variabilidad del mtodo de recuento, tipo de alimento, modo de preparacin y poblacin de riesgo. Este valor M ha de establecerse tericamente y la relacin M/m vera entre 3 y 103 dependiendo del tipo de alimento.

En el caso de microorganismos patgenos se acepta la medida de muestras agrupadas (x muestras de y gramos o una muestra de xy gramos) en las que los valores de patgenos se ajusten a los criterios de referencia aunque, en grandes cantidades dealimento, puedan aparecer algunos microorganismos patgenos.

3.- Fundamentos ecolgicos de la eleccin de criterios microbiolgicos y de la fijacin de valores de referencia. 4.1.- Generalidades. Los criterios microbiolgicos han de establecerse despus de un cuidadoso estudio ecolgico de la asociacin de microorganismos con cada alimento particular. En los criterios para microorganismos no patgenos la tolerancia que se acepta es: si el valor de referencia es 10S no se aceptan ms de 2 muestras de 10 que tengan entre 10S y 10S+1 y ninguna que supere el nivel de 10S+2. En los ejemplos siguientes se indican ms criterios de los estrictamente necesarios, esto es debido a regulaciones locales y a exigencias de los consumidores; en cualquier caso, lo ms conveniente es hacer una sleccin adecuada de los criterios atendiendo a consideraciones ecolgicas. Los productos que presenten pequeas deficiencias pueden destinarse al reprocesamiento, eliminacin de las partes afectadas o alimentacin animal. 4.2.- Alimentos proteicos. a) Leche, crema, queso y helados: La leche cruda es un alimento peligroso (Tabla 1) en que deben realizarse recuentos de aerobios totales y Gramnegativos y sobre todo cuando se destina a la produccin de alimentos para poblacin de riesgo. La leche pasteurizada tiene una alta calidad microbiologca y los valores de enterobacterias y aerobios estn ampliamente aceptados (Tabla 2), en ciertos casos es necesario hacer un recuento de Gram-positivo psicrotrofos (Bacillus) para valorar la posibilidad de deterioro debido a proteasas y lecitinasas. Queso: en aquellas zonas donde se prepara a partir de leche cruda de oveja o cabra es especialmente importante valorar la presencia de Brucella; y en los quesos salazonados, de S. aureus que se selecciona en el proceso. El queso elaborado a partir de leche pasteurizada es ms seguro y el criterio es valorar enterobacterias y S. auerus. Helados: presentan un problema particular por su alta posibilidad de contaminacin con microorganismos de origen entrico (tabla 3) debido a la alta manipulacin de la materia prima. b) Carne fresca: En zonas en que el tratamiento trmico de las canales no es adecuado pueden haber una proliferacin en profundidad de C. perfringens de origen intestinal. Si el tratamiento es adecuado la flora ms importante es la Gran-negativa no fermentadora (Pseudomonas, por ejemplo) que hay que determinar en superficie. En carnes es especialmente importante prevenir la transmisin de las zoonosis mediante la observacin ante morten y post-mortem de los animales; aunque la eliminacin de las enfermedades se fundamenta en la prevencin en el ganado y en el tratamiento trmico de los alimentos. En carnes deshuesadas es importante valorar enterobacterias para determinar las condiciones higinicas del proceso.

Las carnes picadas, debido a su procesamiento, tienen ttulos bacterianos mayores. No deben consumirse crudas, y los valores de referencia rondan 105 aerobios/gr. La carne de pollo no se consume nunca cruda y por tanto la contaminacin es posterior a la preparacin. El criterio es el anlisis de enterobacterias en superficie para valorar los riesgos posteriores. c) Alimentos de origen marino: Las diferencias en el pH de la carne y del pescado y marisco hacen que stos sean ms susceptibles al deterioro microbiolgico. El pescado de alta mar est notablemente limpio de microorganismos, no as el de zonas costeras para el que se han descrito valores de referencia (tabla 4). En el caso de los moluscos la situacin es ms delicada porque a veces se consumen crudos. Se han descrito lmites de enterobacterias y E. coli, as como para las aguas en las que se cultivan. (Es importante la transmisibilidad de hepatitis A, a travs de los moloscos). Es importante el control de aminas vasopresoras. d) Huevos y derivados: Los huevos enteros no tienen carga microbiolgica (salvo excepciones y en los casos de huevos de pata o de oca) y por tanto no tiene sentido establecer criterios. En el caso de los productos es importante el momento de la rotura y separacin de la cscara que, si se hace de forma higinicamente correcta permite recuentos totales del orden de 106 cfu/ml y E. coli inferior a 102/ml. e) Hortalizas y verduras y tubrculos: Las asociaciones microbianas son similares a las de los alimentos crnicos aunque aqu toman ms importancia los microorganismos capaces de hidrolizar carbohidratos de alto pero molecular (Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia y Corynebacterium) que, junto a los mohos son causantes de podredumbres (tabla 5). En estos alimentos no son de utilidad los recuentos microbiolgicos y slo las propias alteraciones macroscpicas constituyen criterios vlidos de la prdida de calidad. En el caso de hortalizas es importante considerar la posible contaminacin con microorganismos derivados del estircol o del agua de riego. Por consiguiente es importante lavar las hortalizas para arrastrar microorganismos, huevos y virus y usar como valores de referencia 10 E. coli/gr y 10 estreptococos grupo D/gr con valores de los microorganismos psicotrofos del orden de 105 cfu/ml (para los que se consumen crudos).

4.3.- Alimentos de pH cido. En ellos slo pueden crecer acidotolerantes: mohos, levaduras, bacterias lcticas y acetobacterias. a) Frutas, zumos y refrescos: Las frutas se conservan en atmsferas especiales y los zumos y refrescos se suplementan con conservante que unidos a la baja temperatura de conservacin por razones organolpticas hace que el recuento sea innecesario.

b) Alimentos a los que se aade vinagre: (encurtidos) En general el control microbiolgicas es innecesario siempre que los valores pH sean suficientemente bajos: el control del pH permite valorar las BPE. 4.4.- Alimentos emulsionados. Los alimentos de este tipo deben su estabilidad al efecto combinado de la dispersin de la fase ocuosa junto a su proteccin con valores subinhibidores de a w pH. a) Mantequilla: Los riesgos sanitarios son prcticamente nulos cuando se ha elaborado a partir de leche pasteurizada. En cualquier caso, la valoracin de microorganismos lipolticos puede permitir evaluar el riesgo de enranciamiento. b) Margarina: La discusin es similar al caso de la mantequilla. Aqu se adiciona conservante. El mayor riesgo est en la fase acuosa contaminante. El criterio ms sencillo es la medida del pH de esta fase acuosa, y si hay alteraciones en el mismo el recuento de microorganismos lipolticos. 4.5.- Alimentos con actividad de agua reducida. a) Alimentos con humedad intermedia:( aw= 0,7-0,85) (son salazones, leche condensada, mermeladas). Las asociaciones de microorganismos que se forman dependen del valor concreto de a w y del pH del alimento. En estos casos los controles del alimento recin preparado son de poca utilidad y las muestras han de someterse a incubaciones cclicas para detectar luego los microorganismos. b) Alimentos completamente estabilizados: (aw <0,6). Estos alimentos estn perfectamente protegidos frente al deterioro microbiano; pero los microorganismos no esporulantes pueden conservarse en un estado de baja actividad metablica por lo que es necesario un control microbiolgico de los mismos. Este control es mucho ms importante cuando el alimento va a usarse en poblaciones de riesgo. Tambin es importante valorar la calidad microbiolgica del agua empleada en la rehidratacin del alimento. 4.6.- Alimentos perecederos pasterizados no envasados. a) Productos de pastelera: La contaminacin con E. coli es indicativa de las condiciones de conservacin que siempre ha de hacerse en fro por la cualidad perecedera de su interior. b) Empanadas de carne: La corteza y la presencia de conservantes protege el interior, aunque en ocasiones se han roto estas barreras y se han producido contaminaciones. Deben vigilarse enterobacterias, S. aureus y C. pefringens. c) Pan:

El mayor problema es el enmohecimiento que es facilmente detectable por lo que en condiciones normales no es necesario un control microbiolgico especial. 4.7.- Alimentos congelados. Durante la congelacin no hay desarrollo microbiano, el problema surge durante la descongelacin que puede no desarrollarse conforme a las BPE. El criterio suele ser el control de la calidad del producto fresco antes de congelarse. Cuando el alimento se cocina inmediatamente antes de procederse a la congelacin, los valores de referencia suelen ser similares a los de la leche pasterizada. 4.8.- Semiconservas envasadas. Son aquellos productos que conservados en refrigeracin tienen una duracin de varias semanas pero que a temperatura ambiente se alteran en pocos das. a) Alimentos perecederos: Embutidos: (Tabla 6) en los que se da una gran variedad de valores de referencia aunque pueden sealarse, en conjunto, los de la tabla. Productos crnicos en lonchas envasados al vaco: en que la alteracin se efecta por bacterias lcticas y el criterio es incubar a temperatura de refrigeracin el producto y valorar entonces S. aureus y enterobacterias. b) Alimentos de gran tamao enlatados: Las asociaciones presentes en estos microorganismos son bacterias psicrotrofas resistentes al calor (Streptococos de grupo D y ciertos bacilos). No es til detectar microorganismos en el producto recin preparado, es necesario hacen ensayos de incubacin a una temperatura que permite el desarrollo mximo de los organismos psicrotrofos sin matarlos (16 C). En la tabla 7 se muestran los valores de referencia para estas semiconservas. c) Semiconservas de pescado: Las condiciones de anlisis son similares a las del apartado anterior. En aquellas semiconservas que contienen vinagre, la medida del pH suele ser suficiente criterio (si el pH es diferente del de referencia se destaca el producto). Para alimentos con pH superior a 4.5 hay que analizar enterobacterias, S. aureus y Clostridium. d) Otros productos bastante estables: Para quesos y ambutidos se deben realizar pruebas de incubacin para detectar Bacillus y Clostriclium. El incremento no debe ser superior a 3 veces. En pescados ahumados las estabilidad es buena y en ellos debe controlarse Clostridium botulinum de tipo E. 4.9.- Alimentos trtados trmicamente y envasados en recipientes hermticos. a) Conservas appertizadas: Las conservas son muy estables y no presentan riesgos, excepto en el caso de C. botulinum cuando el tratamiento no es el adecuado y en los casos de contaminacin postprocesado debido a defectos en el envase. El mejor criterio es el control de los mecanismos de produccin porque las contaminaciones son demsiado espordicas para ser detectables por un muestreo.

Se puede valorar el poder de conservacin de la appertizacin incubando envases durante largo tiempo a altas temperaturas (30 C) y valorando las alteraciones organolpticas. b) Alimentos totalmente estriles: Estos no deben contener ningn tipo de microorganismo. El anlisis se centra en el estudio de la presencia de esporas termoresistentes. El anlisis se hace incubando a alta teperatura una serie de envases y detectando abombamientos, cambios organolpticos, si no es el caso, se siembra una muestra del contenido y se incuba en anaerobiosis a alta temperatura. 5.- Concordancia entre valores y mtodos: Los mtodos de anlisis deben ser normalizados para que los resultados del mismo sean constantes y reproducibles entre laboratorios. Hay una serie de organizaciones responsables de la elaboracin y normalizacin de los mtodos de anlisis y los valores de referencia. En Espaa el cdigo alimentario y una serie de normas publicadas en el BOE y que desarrollan definiciones, mtodos y valores de referencia, constituyen la normativa vigente para la decisin sobre calidad microbiolgica del alimento. Volver MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS Tema 15 PRINCIPIOS BASICOS DE DETERIORO MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS Principios bsicos de deterioro de los alimentos. Estudio del deterioro de los alimentos causado por los microorganismos: estudio de la flora presente en los alimentos, los parmetros ecolgicos que la afectan y el resultado en forma de productos de calidad microbiolgica no deseable. 1.- INTRODUCCION. La alteracin de los alimentos consiste en todos aquellos cambios de origen bitico o abitico que hacen que el alimento no sea adecuado para el consumo. El deterioro causado por microorganismos es resultado de las relaciones ecolgicas entre el alimento y el microorganismo. Para poder predecirlo y controlarlo hay que conocer la caractersticas del alimento como medio soporte del crecimiento de microorganismos y los microorganismos que colonizan habitualmente dicho alimento. 2.- DETERIORO DE VEGETALES. 2.1.- Composicin de los vegetales. (Tablas 14.1 y 14.2) El contenido medio de agua es el 88%, y de nutrientes: 8,6% de carbohidratos, 1,9% protenas y 0,3% de grasa. Desde el punto de vista nutritivo los vegetales pueden permitir el crecimiento de levaduras, hongos y bacterias y, por tanto, ser alterados por estos microorganismos.

Puesto que hay un alto contenido en agua y un bajo contenido en carbohidratos, la mayora del agua est en forma libre, por lo que el crecimiento de bacterias est muy favorecido. El pH de los vegetales tambin es compatible con el de muchas bacterias y, por tanto, stas pueden crecer fcilmente. Los vegetales tienen unos valores de oxidacin/reduccin altos por lo que el crecimiento de microorganismos aerobios est favorecido. 2.2.- Agentes bacterianos. Los mayores causantes de deterioro son las bacterias del gnero Erwinia y algunas Pseudomonas que producen pectinasas capaces de romper la capa exterior de los vegetales y colonizar as los tejidos internos. Tanto en el caso de bacterias como en el de hongos, el deterioro puede iniciarse incluso antes de la recoleccin y se ve favorecido por cualquier circunstancia que altere la integridad fsica del vegetal (porque as se permite la entrada de los microorganismos al interior). 3.- DETERIORO DE FRUTAS. (Tabla 14.3) Las frutas tienen en torno al 85% de agua y en torno a un 13% de hidratos de carbono, por lo que la cantidad de agua disponible es claramente inferior a la de los vegetales, y los porcentajes medios de protenas y grasas son 0,9 y 0,5% respectivamente. El contenido en otros nutrientes como vitaminas y coenzimas es similar al de los vegetales; por tanto, en principio, sobre las frutas tambin pueden crecer mohos, levaduras y bacterias. Sin embargo el pH de frutas es demasiado bajo, en general, para que pueda haber crecimiento bacteriano y elimina estos microorganismos del deterioro incipiente de frutas, que es llevado a cabo por hongos y levaduras. 4.- DETERIORO DE CARNES Y PESCADOS FRESCOS Y PROCESADOS. (14.4 y 14.5) Las carnes son los alimentos ms alterables debido en su caractersticas de composicin: alto contenido en protenas y grasas y en cofactores que favorecen el crecimiento bacteriano. Prcticamente todos los tipos de bacterias son capaces de crecer y deteriorar productos crnicos; adems, la flora inicial del producto, ms si est procesado, puede ser muy variada. En cuanto al pH, el de la carne es compatible con la mayora de los microorganismos y su potencial de O/R permite el crecimiento tanto de anaerobios, en profundidad, como de aerobios, en la superficie, del alimento. El principal efecto selectivo es el debido al almacenamiento a bajas temperaturas en cmaras frigorficas que selecciona psicrotrofos. 4.1.- Deterioro de carnes de vaca, cerdo y similares. Al sacrificarse el animal se producen una serie de cambios fisiolgicos que dan inicio a la produccin de la carne comestible: parada circulatoria, fin del reciclaje muscular del ATP , inicio de la glicolisis y bajada del pH, descontrol del crecimiento de microorganismos e inicio de la desnaturalizacin de protenas. Este proceso tarda entre 24 h y 36 h. a la temperatura habitual de almacenamiento (2-5 C)

Durante el proceso de descenso de temperatura se inicia el deterioro interno debido, sobre todo a C. perfringens y enterobacterias; cuando la temperatura es baja el deterioro es predominante debido a la flora superficial. En las canales tambin se puede producir deterioro superficial debido a hongos y a levaduras; sin embargo, en carnes procesadas, picadas, el deterioro es debido solo a bacterias del grupo de Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella. La temperatura de incubacin es la razn de que el nmero de tipos de microorganismos responsables de la alteracin de carnes sea muy reducido. En el caso de filetes o piezas cortadas conservadas a baja temperatura, el deterioro puede producirse por bacterias u hongos dependiendo de la humedad ambiental (bacterias a alta humedad). El crecimiento de bacterias (sobre todo Pseudonomas) puede detectarse primero por la aparicin de colonias discretas, luego mal olor y luego un capa de limo que cubre la pieza y que se produce por la coalescencia de las colonias. Cuando hay un crecimiento abundante de bacterias no se produce crecimiento de los mohos porque aqullas consumen el oxgeno necesario para que crezcan estos. 4.2.- Deterioro de carnes envasadas y otros productos. La situacin es distinta cuando la carne se almacena al vaco en refrigerador: en este caso el deterioro es causado por bacterias lcticas o por algn tipo especial de bacilo (Bacillus thermosphacta) en la mayora de los casos. La presencia exclusiva de bacterias lcticas o de enterobacterias depende del pH del producto (bajos pH bacterias lcticas) y de la eficiencia de la barrera al oxigeno del envase. La presencia de nitritos tambin dirige el tipo de bacteria alterante porque inhibe ms los bacilos que las bacterias Gran-Negativas. En el caso de embutidos, cada uno de los componentes puede proporcionar microorganismos alterantes. En general estos productos se deterioran ms por bacterias y levaduras que por hongos. El deterioro de estos productos puede producirse de tres formas distintas: Produccin de Limo, Agriado y Cambio de Color. La formacin de limo tiene lugar en la superficie y se debe predominantemente a las bacterias lcticas; el agriado ocurre bajo la superficie y es consecuencia de la actividad de las bacterias lcticas sobre productos que contengan lactosa. La formacin de color verde se debe a la produccin de perxidos o de H2S por algunas bacterias y tiene lugar en el interior de las piezas. El enverdecimiento producido por perxidso es debido a bacterias lcticas, y el producto verde no es peligrosos desde el punto de vista toxicolgico. El enverdecimiento debido a H2S se produce por una reaccin con la hemoglobina causada por Pseudomonas o algunas bacterias lcticas. En el caso de bacon y productos curados, el tratamiento lo hace bastante insensibles a las bacterias y el principal proceso de desarrollo es debido a hongos. 5.- OTROS PRODUCTOS. 5.1.- Huevos.

Su interior es estril y estn bien protegidos: cscara, membranas interna y substancias antimicrobianas de la clara. En condiciones normales las bacterias no entran en contacto con la yema, a no ser que el largo tiempo de almacenamiento y las condiciones de humedad permitan un desplazamiento de la yema. En este caso, las bacterias entricas y Psudomonales presentes en la cscara pueden contaminar la yema. 5.2.- Cereales. Su bajo contenido en agua hace que solo ciertos tipos de Bacillus y hongos sean capaces de producir deterioro. 5.3.- Lcteos. El deterioro de leche no pasteurizada se produce rpidamente debido a su alta carga microbiana. En la pasteurizada el deterioro se debe a estreptococo termorresistentes. En el caso de mantequilla el deterioro se puede producir como putrefaccin debido a Pseudomonas putrefaciens o por enranciamiento debido a actividades lipolticas de algunas bacterias de tipo Pseudomonas o bacterias lcticas; aunque el deterioro ms frecuente de la mantequilla es el producido por hongos.