ISSN 1517-1965

Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

Circular Tcnica
Corumb, MS Maio, 2006

63

A quantidade de produtos qumicos que liberado no meio ambiente como emisses de rotina de laboratrios enorme e apresenta um grande risco sade da sociedade. No entanto, as vantagens que esses produtos podem trazer para a indstria qumica moderna e as pesquisas cientficas de um modo geral so indiscutveis. Nesse contexto, uma poltica que venha a ter como objetivo evitar a gerao de resduos na fonte, com a aplicao de tecnologias que utilizem menores quantidades de matria-prima e recursos naturais em geral, imprescindvel (Alberguini, 2005). Aes de programas de gerenciamento de resduos devem estar norteadas para a minimizao ou mesmo eliminao de alguns resduos produzidos nos laboratrios. Uma das estratgias recomendadas para se adequar a esta nova realidade substituir ou diminuir a quantidade de reagentes, ou ainda, modificar procedimentos (Simeone, 2005). Com o objetivo de diminuir a quantidade de resduos gerados e, conseqentemente, custos este trabalho prope uma adequao do mtodo de Kjeldahl a partir da reduo na quantidade de cada reagente utilizado durante o processo para a determinao do nitrognio total. Foram realizados ensaios com amostras de trs espcies de forrageiras da regio do Pantanal (Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e Luziola subintegra) e uma amostra padro de referncia do Programa Colaborativo Interlaboratorial coordenado pela Embrapa Meio Ambiente. Anlises estatsticas foram realizadas para averiguar a preciso da nova metodologia proposta.

Princpio

A determinao do nitrognio total (NT) proposta por Kjeldahl em 1883, ainda muito usada por ser uma tcnica confivel, com rotinas bem estabelecidas e ao longo do tempo permaneceu praticamente a mesma com poucas modificaes (Vogel, 1992). Esta tcnica possibilita a determinao indireta de protenas em vrias amostras biolgicas, assim como o nitrognio em plantas para a avaliao do estado nutricional (Yasuhara e Nokihara, 2001; Nogueira e Souza, 2005).

Autores
Fbio Galvani Qumico, Dr. em Cincias e Engenharia de Materiais Embrapa Pantanal CP 109, Corumb, MS. CEP 79320-900. fgalvani@cpap.embrapa.br Eliney Gaertner Bilogo Embrapa Pantanal CP 109, Corumb, MS. CEP 79320-900. eliney@cpap.embrapa.br

O mtodo baseado na decomposio da matria orgnica atravs da digesto da amostra a 400oC com cido sulfrico concentrado, em presena de sulfato de cobre como catalisador que acelera a oxidao da matria orgnica. O nitrognio presente na soluo cida resultante determinado por destilao por arraste de vapor, seguida de titulao com cido diludo (Nogueira e Souza, 2005). As reaes qumicas que se passam durante o processo da determinao dos compostos nitrogenados podem ser assim resumidas (Silva, 1990):

Digesto
Durante a digesto (Figura 1A) ocorrem as seguintes reaes:
M a t r ia O r g n ic a H 2S O
4

H 2S O
4

SO

2 +

CO

2 +

H 2O

NH2

NH2 O

H 2O

[ H +]

OH

NH3

O R C
+

H 2O

NH2 2 NH3
+

NH3

OH

H 2S O

(N H 4)2S O

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Figura 1. (A) Digesto de uma amostra para a determinao de nitrognio total. (B) Mudana de colorao da soluo durante o processo da digesto. O carbono contido na matria orgnica oxidado e o dixido de carbono (CO2) se desprende. Durante o processo da digesto a soluo passa de uma colorao escura (preto) para um verde claro (Figura 1B). Alm dos agrupamentos proticos, existe o nitrognio sob a forma de amina, amida e nitrila, que transformado em amnia (NH3) a qual reage com o H2SO4, formando o sulfato de amnio ((NH4)2SO4) conforme mostrado nas reaes durante a digesto, e esse ao esfriar forma cristais.

Destilao
Aps a digesto inicia-se o processo de destilao (Figura 2A) que pode ser feita por aquecimento direto ou por arraste de vapor. O sulfato de amnio tratado com hidrxido de sdio (NaOH), em excesso, ocorrendo a liberao de amnia, conforme as reaes:

(NH4)2SO4

2 NaOH

2 NH4OH

Na2SO4

NH4OH

NH3

H2O

Ao se adicionar o hidrxido de sdio, deve-se utilizar algumas gotas de soluo indicadora, no destilador, para garantir um ligeiro excesso de base. A amnia que desprende na reao coletada num frasco contendo cido brico (H3BO3) com o indicador, previamente adaptado ao conjunto da destilao. Considera-se terminado o processo, quando toda a amnia j se desprendeu. A soluo contendo cido brico com o indicador que no incio apresentava colorao rsea adquire a cor azulada (Figura 2B) medida que vai se formando o borato de amnio (NH4H2BO3), conforme a reao: H3BO3 + NH3 NH4H2BO3

Figura 2.(A) Processo de destilao.(B) Formao do borato de amnio.

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Titulao
A ltima etapa do processo corresponde a titulao (Figura 3A). O borato de amnio titulado com uma soluo padro de cido clordrico (HCl) de ttulo conhecido at a viragem do indicador (Figura 3B), conforme a reao: NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4CL

Figura 3. (A) Titulao para a determinao da dosagem de nitrognio. (B) Viragem na titulao para a determinao da dosagem de nitrognio total. O nitrognio total (NT) determinado pela seguinte equao: NT = (Va Vb) x F x 0,1 x 0,014 x 100 P1 Onde: NT teor de nitrognio total na amostra, em percentagem; Va volume da soluo de cido clordrico gasto na titulao da amostra, em mililitros; Vb volume da soluo de cido clordrico gasto na titulao do branco, em mililitros; F fator de correo para o cido clordrico 0,01 mol/L; P1 massa da amostra (em gramas). Na determinao da protena bruta, multiplica-se o valor do nitrognio total encontrado pelo mtodo de Kjeldahl por um fator que converte o nitrognio em protena. Convencionalmente, em amostras de alimentos para animais: plantas forrageiras, raes concentradas, entre outros materiais, a protena bruta (PB) expressa pelo fator 6,25, considerando que a maioria das protenas contm nas suas molculas aproximadamente 16% de nitrognio. A expresso abaixo utilizada para determinar a protena bruta: PB = NT x FN Onde: PB teor de protena bruta na amostra, em percentagem; FN 6,25. Expressa-se o resultado corrigido, tendo-se como base de correo a matria seca a 105oC. Deve se fazer testes em branco com o objetivo de eliminar a interferncia e contaminao dos reagentes.

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Parte Experimental
Materiais e Equipamentos
Bloco digestor; Capela para exausto de gases; Destilador de nitrognio; Bureta automtica; Agitador magntico; Erlenmeyer de 50 mL; Balana analtica - preciso ( 0,0001g); Tubo de ensaio com borda reforada (25x250 mm); Frascos dosadores de reagente; Esptula; Papel impermevel.

Reagentes e Solues
cido sulfrico (H2SO4 d=1,84), p.a., concentrado; Hidrxido de sdio (NaOH) a 40% (m/v); Sulfato de sdio (Na2SO4); Sulfato de cobre pentaidratado (CuSO4.5H2O); cido clordrico (HCl) 0,01 mol/L; Soluo alcolica de verde de bromocresol, a 0,1% (m/v); Soluo alcolica de vermelho de metila a 0,1% (m/v); Soluo alcolica de vermelho de metila a 0,04% (m/v); Soluo de cido brico, a 2% (m/v).

Mistura Catalisadora
Pesar 1000 g de sulfato de sdio anidro, pesar 50 g de sulfato de cobre pentaidratado. Em um recipiente misturar os reagentes e em seguida acondicionar em frasco com tampa. Segundo a metodologia descrita no Manual de Laboratrios: Solo, gua, Nutrio Animal e Alimentos (Nogueira e Souza, 2005), 2,5 g de selnio em p so adicionados na mistura catalisadora. Neste trabalho optou-se por no usar o selnio como catalisador com o intuito de minimizar a gerao de resduos durante o processo.

Soluo receptora indicadora

Misturar 1000 mL de soluo de cido brico a 2%, 6 mL de soluo alcolica de vermelho de metila a 0,1% e 15 mL de soluo alcolica de verde de bromocresol.

Procedimento
Foram realizadas cinco baterias de testes com 30 amostras por bateria. As amostras analisadas foram de trs espcies de forrageiras (Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e Luziola subintegra), que geralmente apresentam nveis diferenciados da concentrao de nitrognio total e protena bruta, alm de uma amostra padro de referncia (Volumoso AR4) do Programa Colaborativo Interlaboratorial (PCI) ano 7 de 2004 coordenado pela Embrapa Meio Ambiente. A determinao do nitrognio total e protena bruta foram realizadas pelo processo de digesto Kjeldahl conforme metodologia atual adotada pela Embrapa e descrita no Manual de Laboratrios: Solo, gua, Nutrio Animal e Alimentos (Nogueira e Souza, 2005), porm a quantidade de amostra e de cada reagente utilizado para o estudo da adequao da metodologia foram reduzidos conforme apresentado na Tabela 1. Determinouse a matria seca de cada amostra a 105oC para fazer a correo e expressar os resultados de protena bruta.

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Tabela 1. Quantidade de amostra e reagentes utilizados nos processos para a determinao do nitrognio total segundo: MA metodologia atual (Nogueira e Souza, 2005) e MP - mtodo proposto neste estudo. Componente Amostra Mistura catalisadora cido sulfrico concentrado gua destilada (aps a digesto) Soluo receptadora indicadora Hidrxido de sdio a 40% cido clordrico MA 0,1-0,2 g 2g 5 mL 20 mL 10 mL 15 mL 0,1mol/L MP 0,03-0,04 g 0,4-0,45 g 0,65 mL 2 mL 1,25 mL 6,20 mL 0,01 mol/L

Aps a obteno dos resultados pelas duas metodologias, foi realizada uma anlise estatstica para averiguar a preciso da metodologia proposta, comparando-se os dados de protena bruta da amostra de referncia (Volumoso AR4) fornecidos pelo PCI com os obtidos pela metodologia proposta. Realizou-se tambm um levantamento da descrio estatstica dos resultados de nitrognio total e protena bruta das demais amostras.

Resultados e Discusses
Na Tabela 2 encontram-se os resultados de matria seca das amostras estudadas que serviro como base para o clculo corrigido dos valores de protena bruta. Tabela 2. Matria seca a 105oC das amostras estudadas. Amostra Volumoso AR4 Andropogon bicornis Reimarochloa sp. Luziola subintegra Matria Seca (%) 93,32 92,22 92,57 91,57

Na Tabela 3 encontram-se os resultados de nitrognio total e protena bruta das amostras analisadas. Os valores de protena bruta esto corrigidos com base nos resultados de matria seca a 105oC de cada material.

Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta Tabela 3. Resultados de nitrognio total e protena bruta das amostras estudadas.
Volumoso Nmero da amostra AR4 (MA) NT (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1,32 1,32 1,38 1,33 1,37 1,39 1,37 1,33 1,34 1,37 1,33 1,33 1,34 1,35 1,32 1,38 1,34 1,33 1,32 1,45 1,36 1,35 1,36 1,37 1,28 1,30 1,34 1,33 1,31 PB (%) 8,84 8,84 9,29 8,90 9,17 9,32 9,19 8,87 8,95 9,16 8,88 8,91 8,96 9,06 8,87 9,25 8,96 8,93 8,83 9,72 9,12 9,01 9,14 9,17 8,58 8,71 8,95 8,90 8,76 Volumoso AR4 (MP) NT (%) 1,42 1,42 1,42 1,45 1,43 1,39 1,42 1,41 1,41 1,44 1,41 1,39 1,44 1,42 1,39 1,44 1,45 1,39 1,38 1,44 1,37 1,41 1,36 1,45 1,41 1,42 1,40 1,46 1,43 1,44 PB (%) 9,54 9,54 9,52 9,70 9,60 9,29 9,50 9,46 9,42 9,67 9,45 9,32 9,66 9,49 9,33 9,66 9,74 9,31 9,63 9,68 9,18 9,45 9,14 9,71 9,41 9,49 9,38 9,75 9,56 9,63 Andropogon bicornis NT (%) 0,35 0,34 0,32 0,37 0,37 0,36 0,37 0,33 0,37 0,37 0,36 0,36 0,36 0,36 0,35 0,36 0,36 0,37 0,35 0,35 0,35 0,37 0,35 0,36 0,36 0,34 0,41 0,33 0,36 0,34 PB (%) 2,35 2,33 2,15 2,51 2,49 2,44 2,48 2,26 2,51 2,53 2,46 2,46 2,45 2,47 2,36 2,45 2,45 2,48 2,39 2,35 2,39 2,50 2,38 2,46 2,44 2,33 2,75 2,27 2,45 2,33 Reimarochloa sp. Luziola subintegra NT (%) 1,76 1,78 1,81 1,78 1,72 1,74 1,74 1,77 1,78 1,73 1,81 1,86 1,86 1,90 1,90 1,88 1,86 1,93 1,87 1,84 1,74 1,81 1,82 1,85 1,84 1,82 1,88 1,80 1,83 1,83 PB (%) 12,03 12,12 12,35 12,13 11,72 11,91 11,91 12,09 12,15 11,81 12,37 12,72 12,69 12,99 12,96 12,80 12,72 13,17 12,75 12,57 11,89 12,38 12,44 12,64 12,58 12,39 12,85 12,27 12,50 12,44

NT (%) 1,11 1,10 1,11 1,12 1,12 1,13 1,11 1,07 1,11 1,10 1,11 1,11 1,10 1,10 1,13 1,11 1,10 1,13 1,15 1,14 1,06 1,09 1,05 1,13 1,05 1,08 1,06 1,08 1,07 1,06

PB (%) 7,47 7,43 7,47 7,53 7,54 7,62 7,47 7,24 7,48 7,42 7,50 7,49 7,46 7,46 7,63 7,47 7,46 7,66 7,77 7,70 7,18 7,28 7,11 7,66 7,07 7,30 7,17 7,29 7,24 7,18

* No determinado, pois se perdeu a amostra durante a anlise.

A preciso de uma metodologia representa a disperso de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, sob condies definidas. A preciso avaliada pelo desvio padro (s) e/ou coeficiente de variao (CV) das medidas obtidas, que utiliza um nmero significativo de medies, normalmente maior que 20 (Ribani, 2004), onde o coeficiente de variao no deve ultrapassar 15% (Valentini, 2002). Comparando-se os dados estatsticos de protena bruta da amostra de referncia (Volumoso AR4) com os obtidos pela metodologia atual empregada pela Embrapa e a metodologia proposta (Tabela 4) pode-se avaliar a preciso da nova metodologia. Tanto o desvio padro quanto o coeficiente de variao, determinados pela metodologia em estudo so menores que os fornecidos pela metodologia atual da Embrapa e pelo PCI. Portanto as alteraes nas quantidades dos reagentes proposta pela metodologia em estudo no influenciaram significativamente nos resultados de protena bruta e apresentaram preciso compatvel com a metodologia atualmente utilizada.

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Tabela 4. Anlise estatstica de protena bruta (PB) para amostras de referncia do volumoso AR4 do Programa Colaborativo Interlaboratorial (PCI) ano 7 de 2004, amostras submetidas a metodologia atual (MA) empregada na Embrapa e amostras submetidas a metodologia proposta (MP).

Parmetro Mdia (M) Desvio padro (s) Coeficiente de variao (CV %) Nmero de determinaes (N)

PCI ano 7 de 2004 9,54 0,65 6,86 183

MA 9,01 0,23 2,51 29

MP 9,51 0,17 1,72 30

Foram realizados testes com diferentes espcies forrageiras (Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e Luziola subintegra) utilizando a metodologia proposta. Estas espcies geralmente apresentam nveis diferenciados da concentrao de nitrognio total e protena bruta. As avaliaes estatsticas para os resultados de nitrognio total e protena bruta encontram-se nas Tabelas 5 e 6 respectivamente.

Tabela 5. Anlise estatstica para o nitrognio total das espcies: Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e Luziola subintegra determinadas com a metodologia proposta. Nitrognio Total Andropogon bicornis 0,360 0,003 0,017 0,0003 0,090 0,320 0,410 4,680 30 Reimarochloa sp. Luziola subintegra

Mdia (M) Erro padro Desvio padro (s) Varincia da amostra Intervalo Mnimo Mximo Coeficiente de variao (CV %) Nmero de determinaes (N)

1,100 0,005 0,027 0,0007 0,100 1,050 1,150 2,490 30

1,820 0,010 0,056 0,0031 0,210 1,720 1,930 3,070 30

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Tabela 6. Anlise estatstica para a protena bruta das espcies: Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e Luzioloa subintegra determinadas com a metodologia proposta. Protena Bruta Mdia (M) Erro padro Desvio padro (s) Varincia da amostra Intervalo Mnimo Mximo Coeficiente de variao (CV %) Nmero de determinaes (N) Andropogon bicornis 2,42 0,02 0,11 0,01 0,60 2,15 2,75 4,40 30 Reimarochloa sp. 7,43 0,03 0,18 0,03 0,70 7,07 7,77 2,46 30 Luziola subintegra 12,41 0,07 0,38 0,14 1,45 11,72 13,17 3,06 30

Os parmetros estatsticos de nitrognio total e protena bruta das espcies forrageiras indicaram um baixo grau de disperso dos resultados e auxiliaram na confirmao da preciso da metodologia proposta.

Concluses
A nova metodologia proposta possibilitou atingir os objetivos especficos do trabalho: diminuir a quantidade de resduos gerados, o consumo de reagentes e os custos para a determinao de nitrognio total e protena bruta pelo mtodo Kjeldhal. Alm disso, foi verificado que as alteraes nas quantidades dos reagentes proposta neste mtodo no influenciaram significativamente nos resultados e na preciso do mesmo. Diante destes resultados, esta metodologia passou a ser adotada como anlise padro pela Embrapa Pantanal para a determinao de nitrognio total e protena bruta de tecidos, produtos e subprodutos de origem animal e vegetal.

Agradecimentos
s pesquisadoras Dra. Sandra Aparecida Santos e Dra. Sandra Mara Arajo Crispim por permitirem utilizar as espcies forrageiras de seus respectivos projetos de pesquisa neste estudo. equipe de apoio tcnico: Reynaldo Sidney Brando Pereira e Rosilene Gutierrez pelo auxlio no registro das fotografias e Miguel Ageu de Faria Gonalves pelo auxlio no registro das fotos e na realizao das anlises.

Referncias Bibliogrficas
ALBERGUINI, L. B. A. Gerenciamento e tratamento de resduos qumicos. In: Encontro Nacional sobre Metodologias de Laboratrios da Embrapa, 10. So Carlos, 2005. Resumos...So Carlos: Embrapa Pecuria Sudeste, 2005. NOGUEIRA, A. R. A.; SOUZA, G. B. Manual de Laboratrios: Solo, gua, Nutrio Vegetal, Nutrio Animal e Alimentos. So Carlos: Embrapa Pecuria Sudeste, 2005. 313p. RIBANI, M. Validao em mtodos cromatogrficos e eletroforticos. Qumica Nova, v. 27, n. 5, p. 771-780, 2004. SILVA, D. J. Anlise de alimentos (mtodos qumicos e biolgicos). 2 ed. Viosa: UFV, 1990. 165p.

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SIMEONE, M. L. Implementao de um programa de gerenciamento de resduos em laboratrios. In: MET Encontro Nacional sobre Metodologias de Laboratrios da Embrapa, 10. So Carlos, 2005. ResumosSo Carlos: Embrapa Pecuria Sudeste, 2005. YASUHARA, T.; NOKIHARA, K. High-throughput analysis of total nitrogen content that replaces the classic Kjeldahl method. Journal of agricultural and food chemistry, v. 49, p. 4581-4583, 2001. VALENTINI, S. A. Atributos da validao da metodologia analtica do Captopril num programa de garantia de qualidade. 75p. 2002. Dissertao (Mestrado) - Programa de Ps-Graduao em Engenharia de Produo, Universidade Federal de Santa Catarina, 2002. Disponvel em: <http://teses.eps.ufsc.br/defesa/pdf/8241.pdf> .Acesso em: 22 fev. 2006. VOGEL, A. I. Anlise Qumica Quantitativa. Traduo: Horcio Macedo. 5 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S. A., 1992. 712p.

Exemplares desta edio podem ser adquiridos na: Embrapa Pantanal Endereo: Rua 21 de Setembro, 1880 Caixa Postal 109 CEP 79320-900 Corumb, MS Fone: 67-32332430 Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento Fax: 67-32331011 Email: sac@cpap.embrapa.br 1 edio 1 impresso (2006): formato digital

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