SDS V2= (10%)(10mL)/99 = 1.01 SDS y aforar con H2O destilada  Trisma- HCL 1.5M pH 8.8 Disolver 18.

2 gr de trisma-base en 70 mL de H2O ajustar a pH HCl aforar a 100 mL , almacenar a 4C.  Persulfato de amonio (PSA) 0.1gr PSA----------- 1mL de H2O  Stock acrilamida/bisacrilamida Acrilamida---------29.2 g Bisacrilamida------0.8 g Disolver 70 mL H2O destilada  Acetona al 0.07 + mercaptoetanol 50mL de acetona+ 35 l de mercapto  Sln. desteido Metanol-------45mL Agua-----------45mL cido actico-10mL  TCA 10% (cido tricloroacetico) 70 l mercaptoetanol 10 g de TCA disolver y aforar a 100 mL de acetona fra.  Mercaptoetanol al 0.07% 70 l de mercapto y 99.93 mL de acetona fra  Acetato de amonio al 0.1M M= (0.1M)(77.08)(0.1)= 0.7708g , disolver y aforar con metanol 100mL

 Buffer de carga Tris HCl 0.5 M pH 6.8----- 1mL Agua --------------4.8mL SDS 10%----------2mL Glicerol-----------1mL Azul de bro.-----0.5 mL 0.025l)= 0.02 gr  Buffer tris 0.5 M pH 6.8 6.1 g --------- 70mL H2O y aforar a 100 mL  Buffer de homogenizacin Tris HCl pH 8.0------- 1.21 g EDTA-------------------0.18g SDS---------------------2g Sacarosa--------------18g 2-mercapto.---------280 l Pvp---------------------1g y Aforar a 100 Ml  Tris- HCl 1.5 M pH 8.8 m= (121.4gr)(1.5M)(0.1 lt) = 6.057gr  Tris- HCL 0.5M pH 6.8 m= (121.14gr)(0.5M)(0.1 lt)= 6.057gr  Stock R-250 1% en etanol .5 gr R-250 50 mL  4% - R-250 4% TCA- 16% H2O 10mL R-250, 40gr TCA Aforar a 250 mL de H2O

EXTRACCIN TOTAL

1- Pesar 0.5 gr de tejido y colocarlo en un tubo eppendorf de 2mL de TCA al 10% en acetona fra de 2-mercaptoetanol (-20C) mezclar con el vortex 1min. 2- Dejar incubar 2h -20C..Despus centrifugar a 14000 rpm por 20 min, lavar la partilla obtenida 2 veces con 1 mL de acetona con 0.07% de 2- mercaptoetanol centrifugar a 14000 rpm por 5 min o hasta que la pastilla se vea incolora. y Lavar la pastilla obtenida a vacio en el Hetto Drx GD-1 durante mximo 10 min.

3- Una vez limpia la pastilla se adiciona 0.5 buffer de homogenizacin ( tris HCl pH 8.0, EDTA 5 m, SDS 2% (p/v) sacarosa 18% (p/v) y 2- mercaptoetanol 40 m y un mismo volumen de fenol absoluto despus mezcla y se vortea durante 1min hasta lograr una suspensin adecuada a la pastilla. 4- La suspensin se centrifuga a 12000 rpm 5 min y la fase de fenol isopropanol que contiene la protena se transfiere a un tubo eppendorf. 5- Despus se adiciona 1mL de acetato de amonio 0.1M frio para precipitar las protenas y se dejo en reposo (toda la noche a 4C). 6- Las protenas precipitadas se recuperan por centrifugacin a 12000 rpm durante 5 min, eliminando el sobrenadante por lavado de la pastilla 2 veces con 1mL de acetona (votear) 14000 rpm (5 min). 7- Finalmente la pastilla se seca a temperatura ambiente usado una secadora (Hetto Drx GD1) durante 10- 15 min la pastilla se almacena a (4C).

y y

PARA OBTENER DE NUEVO LA PASTILLA SE DISUELVE EN 100L (dependiendo de la cantidad de pastilla que tengas) DE BUFFER DE HOMOGENIZACION + MERCATOETANO. DESPUES SE EXTRAEN 20 L DE MUESTRA Y SE LE COLOCA 20 L DEL BUFFER DE CARGA Y AS SE COLOCA EN LOS GELES PARA SU CORRIDA.

EXTRACCION DE LAS GLIADINAS Y GLUTENINAS EN GELES DE SDS 0.5 gr de harina GLIADINAS 1- ESTRAER CON UN 1mL de etanol al 70% 2- Poner 30 min en la estafa a 65C (Mov. Cada 10 min) 3- Centrifugar a 12000 rpm 1 min (SE PUEDE PARAR) PRECIPITADO DE GLUTENINAS 45678910111213141516171819202122Resuspender el precipitado en 1 mL de sol A Poner 30 min en la estufa a 65C ( Mov. Cada 10 min) Centrifugar a 10000 rpm 1 minuto Eliminar el sobrenadante con micropipeta Limpiar el precipitado con 500 mL de la solucin A Agitar las muestras en el vortex Centrifugar por 5 min a 10000 rpm Extraer el sobrenadante con micropipeta (SE PUEDE PARAR) Resuspender el precipitado en 0.1 l de solucin B adicionando de dithio- threitol al 1% ( 1 mL de solucin B + 0.01gr de DDT) ( SE PUEDE PARAR) Agitar en vortex brevemente Poner 30 min a 65C Centrifugar 5 minutos a 10000 rpm Aadir 100 l de solucin B adicionando 4- vinylpyridina al 1.4% ( 1mL de solucion B + 14 l de V.P) Poner 15 min a 65C Centrifugar 2 minutos a 10000 rpm (SE PUEDE PARAR) Tomar 100l de solucin C y aadir 100l del sobrenadante Agitar brevemente en vortex Poner 15 min a 65C Centrifugar 2 min a 10000 rpm

CANTIDAD DE GLUTENINAS SOBRENADANTE DE GLIADINAS 456789resuspender el sobrenadante Evaporar 24h a 65C Aadir 200 l de solucin C Agitar en el vortex Poner 15 min a 65C Centrifugar 10 min a 10000 rpm

SOLUCION A 50 mL de propanol 1 50 mL de agua O Etanol al 70% ( la temperatura cambia a 37C)

SOLUCION B 50 mL de propanol 1 800l de Tris- HCl pH 8 agua hasta 100 mL

SOLUCION C 0.2 gr de SDS (2%) 4mL de glicerol (40%) 2 mg de azul de bromofenol (0.02%) 800l Tris- HCl 1M agua hasta 10 min

EXTRACCION DE GLIADINAS Y GLUTENINAS, PARA PLACA DE ELISA 0.5 gr de harina GLIADINAS 1- ESTRAER CON UN 1mL de etanol al 70% 2- Poner 1hra en la estafa a 37C (Mov. Cada 10 min) 3- Centrifugar a 12000 rpm 5 min PRECIPITADO DE GLUTENINAS 456789101112131415161718Resuspender el precipitado en 1 mL de sol A Poner 1hra en la estufa a 65C ( Mov. Cada 10 min) Centrifugar a 10000 rpm 5 minuto Eliminar el sobrenadante con micropipeta Limpiar el precipitado con 500 mL de la solucin A Agitar las muestras en el vortex Centrifugar por 5 min a 12000 rpm Extraer el sobrenadante con micropipeta Resuspender el precipitado en 100 l de solucin B adicionando de dithio- threitol al 1% ( 5 mL de solucin B + 0.05gr de DDT) Agitar en vortex brevemente Poner 30 min a 65C Centrifugar 5 minutos a 10000 rpm Aadir 100 l de solucin B adicionando 4- vinylpyridina al 1.4% ( 5mL de solucion B + 70 l de V.P) Poner 15 min a 65C Centrifugar 2 minutos a 12000 rpm

EXTRACCIN DE SUERO DE PROTENAS DE CELIACOS Y NO CELIACO

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Se colocan 20l de suero en un tubo eppendorf Se aade 30 l de acetato de amonio 0.1M frio ( dejar toda la noche -20C ) Una vez transcurrido el tiempo de centrifuga 5 min a 10,000 rpm Se separa el sobrenadante y el pellets Se le aade entre 100, 200 o 400l de buffer de homogenizacin una vez solubilizada la pastilla, tanto el sobrenadante y el pellets que tiene el buffer se corre en geles de SDS-PAGEA al 10% cargar en el gel 5l (usar buffer de carga y calentar a 65C 30 min o 5 min a 90C)

GELES SDS- PAGE Gel separador (inferior) 7.5% 4.85mL 2.58mL 0.1mL 2.5Ml 50 l 5 l 10% 2.79mL 2.5mL 0.1mL 3.33mL 100 l 20 l 12% 3.3mL 2.5mL 0.1mL 4.0mL 100 l 20 l 15% 4.1mL 2.5mL 0.1mL 5mL 100 l 20 l 20% 5.5mL 2.5mL 0.1mL 6.6mL 100 l 20 l

Agua Tris-HCL 1.5 M pH 8.8 SDS 10% Stock Acri/ Bis PSA TEMED

Gel concentrador (superior)

Agua Tris-HCL 1.5 M pH 8.8 SDS 10% Stock Acri/ Bis PSA TEMED

7.5% 3.85 mL 1.25 mL 0.50 mL 6.50 mL 100 l 20 l

12% 6.1 mL 2.5 mL 0.1 mL 1.3 mL 100 l 20 l

TEC. De E.L.I.S.A.

1- Diluir gliadinas y gluteninas 1:10 Ejemplo Vf= 1,500 l (DEPENDE DE LOS POSILLOS QUE SE USARAN)/ 1:10= 150 l gli y glu PBS 1X = 1350 l 2- Lavar la placa 3 veces con tween y PBS 1X v/v (200l) Tween 1l en 100Ml de PBS 3- Bloqueo (BSA 1.5 % duluido en PBS 1X 50Ml) 1:30 A 37C ( SOLO AL BLANCO PBS 1X) 4- Lavar 3 veces 51:100 Vf= 1,000/1:100 1:100 Vf= 700/1:100

 SOLO UN SUERO PARA CUBRIR EL C- ( cualquiera que elijas)  7l suero + 993 PBS 1X  7l SUERO + 693 PBS 1X er Incubas 1 Ab (suero del paciente 1hra a 37C, esto se coloca en el 2do C- y en el primero va PBS 1X. 6- Lavar 3 veces 7- Incubar con el 2do Ab ( IgG antihuman-HRP) 1hra a 37C 1:1000 = 3:100/1:1000= 3.1 l de Ab 3096.9 de PBS 1X  Esto se le coloca al 1ro C- Y EL 2do C- SE LE COLOCA PBS 1X Lavar 3 veces Poner el sustrato a temperatura ambiente en todas las muestras TBM 100l durante 15 o 30 min. Parar la reaccin con acido sulfrico 1N 100l Leer la placa a 450nm en el espectro de ELISA

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2da DIMENSIN 1- En la base de la placa que no contiene la resistencia se le coloca la muestra mas buffer de homogenizacin y por enzima la tira de 7cm con el gel hacia abajo mas 0.7 mL de aceite mineral. SE DEJA DURANTE 12-18 HRS 4C. 2- Se saca la tira de la placa y se elimina el aceite mineral con buffer de corrida y con ayuda de un papel filtro se seca, pero solo por la parte de la tira que no contiene gel. 3- Colocar mechas (que estn con pequeos rectngulos de papel filtro watman # 1con una medida de 1cm X 0.5 cm) en la placa para isoelectroenfoque (IEF), 2 mechas por cada gel a correr. 4- Agregar 8l de agua nanopura a cada mecha la cual ya debe de estar en los nanocanales 5- Colocar las tiras hidratadas con el gel hacia abajo con mucho cuidado de no romper o daar la tira, en la placa IEF, tomando en cuenta la carga de la tira con la sealada. 6- Tapar la placa 7- Colocar la placa IEF en el equipo IEF cell, de acuerdo con su respectiva carga 8- Cargar el programa en el equipo de protein IEF cell. 9- Concluidas las 5 hrs, limpiar las tiras con papel filtro whatman # 1 previamente humedecido con H2o destilada por el lado del gel para quitar el exceso de aceite 10- Colocar en una caja limpia las tiras, con el plstico hacia abajo y agregarle 0.5 mL de buffer de equilibrio I y agitarlo durante 1min. 11- Tirar el primer buffer por el lado plano de la placa, tratando de quitar lo ms que se pueda. 12- Colocar 0.5mL de buffer de equilibrio II y agitarlo lentamente durante 10 min. Sacar las tiras y agregarlas al gel separador. 13- Al gel separador realizado se le agrega la agarosa con azul de bromofenol al tope y se le colocan las tiras, quedando el gel de la tira frente a ti y el platico hacia atrs. Quitar la placa y colocarla en la cmara. 14- Llenar la cmara con el buffer de corrida y correrla a 300v a 70 m.a. 15- Sacar los geles y teirlos con azul de comassie de 15 a 20 min con agitacin suave 16- Retirar el azul de comassie y colocarle la solucin de desteido por un tiempo aproximado de 15 a 20 min con agitacin suave.

GELES DE ELECTROFORESES DE TRIS-TRICINA

GEL SEPARADOR INFERIOR 10% 3.5 mL 5mL 4.9mL 1.58mL 100l 20 l 12% 15% 4.5mL 5.23mL 5mL 5mL 5.88mL 7.35mL 1.58 mL 1.58mL 100 l 100 l 20 l 20 l

Agua Tris-HCL/ SDS Stock acrilamida/bisacrilamida Glicerol 80% PSA TEMED

GEL CONCENTRADOR SPERIOR 10% 4.67mL 1.87mL 4.9mL 100l 20 l

Agua Tris-HCL/ SDS Stock acrilamida/bisacrilamida PSA TEMED

BUFFER CATADO 1X 100mM, 100mM tricina 0.1% SDS (dentro de la caja que forman los geles) Tris-base Tricina SDS 6.055g 8.96gr 0.5gr Vf= 500mL

BUFFER ANODO 10X (fuera de la caja que forman los dos geles) Tris-base 24.22g pH 8.9 con HCl Vf= 1lt

BUFFER Tris HCL/SDS 3.0 m Tris , 0.3 % SDS 60 mL H2O pH 8.45 con HCl, aforar con agua dd a 100 mL, filtrar la Tris-base 36.4g solucin y adicionar 0.3 gr SDS

BUFFER DE CARGA 2X Tricina 1mL 0.5M tris-HCl pH 6.8 0.4gr SDS 2mL Glicerol 0.02gr azul de bromofenol 0.31gr DTT (dependiendo del contenido de cisteinas. Vf=10mL

SOLUCION DE TEIDO 50mL cido actico, 225mL H2O dd y 225mL metanol (1:1), 1gr de azul de comassie R-250, agitar bien el vortex el H2O, metanol y azul de comassie y al final se le agrega el acido actico SOLUCION DE DESTEIDO 100mL cido actico, 450mL metanol y 450mL H2O dd (1:1) Vf= 1lt SOLUCION ACLARADORA 10mL sln. Desteido, 10mL glicerol, 2.5 mL acetona