HERRAMIENTAS EN BIOLOGIA MOLECULAR

GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR ADRIANA LUCIA PICO ROMERO

Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

AVANCES MOLECULARES

AVANCES MOLECULARES

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR

Proceso que semeja in vitro la replicacin del ADN y que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento de ADN, despus de realizar 30 o ms ciclos.

REPLICACION ADN
y mutaciones puntuales

PCR
Buffer Primers ADN molde dNTPs (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) ADN Polimerasa (Taq polimerasa) Cloruro de Magnesio (MgCl2)

PCR
1. DENATURACIN 90 a 95 c

CICLO

2. ANILLAMIENTO 55 a 65 c 3. EXTENSIN 72 c

PCR

PCR

ELECTROFORESIS

USOS DE LA PCR
Pruebas de identificacin (STRs) Deteccin de enfermedades hereditarias Mutagnesis dirigida Genotipificacin de mutaciones especificas (SNPs) Deteccin de enfermedad viral Clonacin de genes

USOS DE LA PCR
Microbiologa clnica: 1. Diagnostico etiolgico 2. Control de tratamiento antimicrobianos 3. Caracterizacin gentica de agentes infecciosos.

PRUEBAS DE IDENTIFICACIN
Autosmicos:
D3S1358, VWA, FGA, THO1, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, D8S1179, D21S11, D18S51, D16S539.

PCR
STRs

Cromosoma Y: DYS19, DYS385,

DYS389 I, DYS389 II, DYS391, DYS390, DYS392, DYS393.

DIAGNSTICO DE ENFERMEDAD GENTICA

ENZIMAS DE RESTRICCIN
Tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del ADN a partir de una secuencia que reconocen (palindrmica). Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula.

ENZIMAS DE RESTRICCION
Tipo I : a. Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan). b. Cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo.. c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

ENZIMAS DE RESTRICCION
Tipo II: a. Slo tienen actividad de restriccin. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. No necesitan ATP. slo requieren Mg++ como cofactor.

ENZIMAS DE RESTRICCION
Tipo III : a. Tienen actividad de restriccin y metilacin. b. Cortan de 5-8 bases antes o despes de la secuencia que reconocen c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

PCR MISMATCH

PCR EN TIEMPO REAL

El proceso de amplificacin y deteccin se producen de manera simultanea. Deteccin por fluorescencia o agentes intercalantes Cuantificacin en cada momento de la cantidad de ADN sintetizado

UTILIDAD DE RT-PCR RTDiagnostico de agentes infecciosos HIV, VHB, VHC, CMV Bordetella, Bartonella, Mycobacterium Tuberculosis (crecimiento lento) Aspergillus ssp. (micosis invasivas) Toxoplasma gondii

PCR nested
Dos amplificaciones con distintos pares de primers Incrementa la sensibilidad de deteccin.

RTRT- PCR (REVERSA)

Deteccin y amplificacin de ARN. Permite estudiar la expresin de determinados genes (su traduccin a protenas). 1. El ARNm se transcribe a ADN( transcriptasa reversa), 2. Por cada molcula de ARNm se sintetiza una molcula de cADN monocatenaria. 3. Mediante ADN polimerasa se convierte el cADN en ADN de doble cadena 4. A partir de aqu se aplica la tcnica de PCR clasica lo que permite una deteccin de la expresin de ARNm mucho ms sensible.

PCR multiplex
Permite amplificar varias secuencias de ADN en una misma reaccin. Marcaje fluorescente de los primers
DXS8378
10/11

DXS9898
12/15

DXS8377
45/47

HPRTB
14

GATA172D05
10

DXS7423
14/15

DXS6809
31/34

DXS7132
12

DXS101
24/26

DXS6789
21/22