DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS BIOTECNOLGICOS

28/06/10 A 02/07/10

Braslia DF

SUMRIO

I. Expresso de protenas em sistema heterlogos: vantagens e desvantagens dos diferentes mtodos utilizados. II. Expresso de Biofrmacos: importncia para o mercado brasileiro. III. Expresso de protenas em bactrias. IV. Expresso de protenas em leveduras. V. Expresso de protenas em plantas. VI. Expresso de protenas em biorreatores.
VII. Tcnicas de purificao de protenas: uma viso geral.

VIII.Testes de atividade Biolgica.

IX. Prticas de expresso de biofrmacos (interferon- ) em sistema

heterlogo bacteriano.

Curso: Desenvolvimento de produtos Biotecnolgicos Data: 28/06 a 02/07 Programao: Expresso de protenas em sistemas heterlogos: vantagens e desvantagens dos diferentes mtodos utilizados. Produo de biofrmacos: importncia para o mercado brasileiro. Expresso de protenas em bactrias. Expresso de protenas em leveduras. Expresso de protenas em plantas. Expresso de protenas em biorreatores. Tcnicas de purificao de protenas: uma viso geral. Testes de Atividade Biolgica.

Calendrio Horrio 08:30 09:00 Segunda (28/06)

- Distribuio dos papers e apostilas

Tera (29/06)
Prtica 2: Inoculao das clulas para expresso Palestra 4: Expresso de protenas em leveduras (rico) Prtica 3: Adio de indutor nas clulas inoculadas Almoo

Quarta (30/06)
Prtica 5: Correr gis

Quinta (01/07)
Prtica 7: Anlise dos gis Palestra 8: Testes de Atividade Biolgica (Fernanda) Apresenta o de seminrios 1, 2 Almoo

Sexta (02/07)
-

Abertura do curso:

09:30 10:00 10:30

11:00 11:30 12:00

Palestra 1: Expresso de protenas em sistemas heterlogos (Patrcia) Intervalo Palestra 2: Produo de biofrmacos (Ftima)

Palestra 5: Expresso de protenas em plantas (Rafael) Prtica 6: corar gis

Apresenta o de seminrios 7, 8, 9 e 10

12:30 13:00 13:30

Almoo Palestra 6:

Almoo Encerramen

Almoo

Prtica 4:

14:00 14:30 15:00 15:30 16:00 16:30

17:00 17:30 18:00

Palestra 3: Expresso de protenas em bactrias (Rafael) Prtica 1: Introduo aos procediment os de expresso Inoculao do princulo

Colher amostras de hora em hora; centrifuga oe armazename nto do material expresso; preparao dos gis de poliacrilamid a

Expresso de protenas em biorreatores (Patrcia) Intervalo Palestra 7: Tcnicas de purificao de protenas (rico)

to curso Apresenta o de seminrios 3, 4, 5 e 6 -

EXPRESSO DE PROTENAS EM SISTEMAS HETERLOGOS I. INTRODUO A descoberta de promotores e repressores especficos do genoma de E. coli, de uma variedade de vrus de E. coli e de clulas eucariticas permitiu a manipulao da expresso de protenas e a clonagem de genes sob o controle de um dado promotor, cuja expresso pode ser indutvel ou contnua. O primeiro, e mais comumente usado, sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli baseado no operon lac (Figura 38). Neste sistema, o DNA de interesse clonado em fago (no caso de biblioteca de cDNA de expresso) ou plasmdeo contendo o lacI (repressor), lacP (promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito para mRNA da -galactosidase). A induo da transcrio obtida pela adio de um anlogo de lactose sinttico e no degradvel (isopropiltio- -Dgalactosdeo, IPTG), o qual se associa ao repressor e inibe-o, deixando o promotor livre para a interao com a RNA polimerase e consequente transcrio do gene.

II. EXPRESSO DE BIOFRMACOS EM SISTEMA PROCARIOTO O sistema mais comumente usado para expresso de protenas heterlogas o que utiliza E. coli como clula hospedeira. Este sistema amplamente difundido devido facilidade e baixo custo de se cultivar E. coli, e pela reprodutibilidade e abundncia de protena que produz. Alm disso, modificaes nos vetores e linhagens de E. coli so frequentemente feitas no sentido de aumentar a eficincia e versatilidade do sistema original.

um vetor para expresso em E. coli deve apresentar as seguintes caractersticas: -

origem de replicao marcador para seleo: gene que confere resistncia a antibiticos como ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina. Ex. o gene da -lactamase que confere resistncia a ampicilina.

um promotor para transcrio: como os vetores de expresso so normalmente projetados no sentido de produzir protena em abundncia, o DNA codificante para uma dada protena deve ser colocado sob o comando de um promotor forte (exemplos: lacZ, tac (trp+lacZ), -pR, -pL, p 10 do bacterifago T7) e regulvel, isto , contendo um repressor para manter os nves basais de expresso do gene insignificantes at a induo, o que se faz geralmente por adio de IPTG, no caso por ex. do repressor lacI, ou choque trmico, no caso do repressor cIts857.

sinal de terminao da transcrio sequncias para controle da traduo, como por ex., um stio de ligao ao ribossomo para a iniciao da traduo (Shine-Dalgarno) e um ATG iniciador. Um sinal de terminao da traduo (cdon de terminao) tambm deve estar presente no vetor ou no inserto a ser clonado, ou deve ser adicionado.

um MSC para facilitar a insero do gene de interesse na orientao correta.

III. EXPRESSO DE BIOFRMACOS EM SISTEMAS EUCARIOTOS Ao se escolher um sistema de expresso, deve-se sempre considerar a aplicao final da protena a ser expressa. Embora o sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli seja bastante difundido, no caso de protenas eucariticas complexas tornase, as vezes, necessrio lanar-se mo de sistemas de expresso em clulas eucariticas para se produzir protenas na sua forma nativa, pois estes sistemas permitem modificaes ps-traducionais essenciais para a funo de determinadas protenas, como, por exemplo, glicosilao.

3.1. Expresso em clulas de mamferos Os vetores de expresso em mamferos contm sequncias que facilitam a propagao em bactria (origem de replicao e um marcador para seleo), bem como seqncias especficas para se obter expresso em clulas eucariticas.

Assim, um vetor para expresso em clulas de mamferos deve apresentar as seguintes caractersticas: origem de replicao para clulas eucariticas: por exemplo, a do vrus SV40 promotor: como, por exemplo, do SV40 ou do citomegalovrus (CMV). Existem tambm vetores com promotores induzveis como, por exemplo, o da tetraciclina e o responsivo ecdisona. sinais para o trmino da transcrio e para a poliadenilao do transcrito marcador para seleo: como por exemplo, o gene que codifica a aminoglicosdeo fosfotransferase, conferindo resistncia geneticina (um anlogo de neomicina). sequncia para ligao ao ribossomo (sequncia de Kozak) Os sistemas de expresso em clulas de mamferos podem ser divididos em dois tipos: a) aqueles envolvendo expresso transitria da protena em questo (1-4 dias aps a introduo do DNA); b) aqueles envolvendo a expresso estvel e que requerem, portanto, a integrao do gene no DNA cromossmico.

3.2. Expresso em fungos Fungos so eucariotos unicelulares potencialmente capazes de realizar todas as modificaes ps-traducionais observadas em clulas de mamferos. A facilidade de cultivo em larga escala uma caracterstica adicional que torna a expresso heterloga de protenas neste sistema particularmente atrativo e com perspectivas para uso, por exemplo, no desenvolvimento de vacinas orais atravs da imobilizao de antgenos na superfcie deste microrganismo. 3.3. Expresso em clulas de inseto utilizando baculovrus um dos sistemas de expresso em clulas eucariticas mais poderoso e verstil. O genoma do Baculovrus muito grande para permitir a insero direta de genes heterlogos; por isso, estes so clonados em vetores de transferncia, os quais contm sequncias flanqueadoras que so homlogas (5 e 3 ao inserto desejado) ao genoma do Baculovrus. Procede-se, ento, co-transfeco do vetor de transferncia contendo o gene de interesse clonado e do DNA linearizado do vrus Autographa californica (AcNPV) em clulas do inseto Spodoptera frugiperda (Sf). Nestas clulas ocorre recombinao homloga, com transferncia do gene heterlogo do vetor para o DNA do AcNPV. A infeco das clulas Sf com o DNA do vrus resulta na parada total

da expresso das protenas do hospedeiro, permitindo alta produo do mRNA e da protena recombinantes. Uma variedade de vetores de transferncia foram construdos para utilizao neste sistema. Cada vetor contem :
-

uma origem de replicao de E.coli um marcador de resistncia ampicilina o promotor da polihedrina ou da p10 (protenas do baculovrus): promotores fortes. um MSC para permitir insero do gene de interesse sequncias flanqueadoras pertencentes ao genoma do vrus para facilitar a recombinao homloga Vantagens deste sistema de expresso:

Modificaes ps-traducionais Obteno de protenas solveis e funcionalmente ativas Altssimos nveis de expresso Capacidade para grandes insertos Expresso simultnea de vrios genes: vrios plasmdeos com promotores mltiplos encontram-se disponveis comercialmente, permitindo a expresso de duas ou mais protenas numa nica clula infectada.

Facilidade de purificao: vetores apresentando tags de 6xHis e GST permitem a purificao por afinidade das protenas recombinantes. Facilidade de monitoramento da expresso: vetores Biocolors permitem a obteno da protena de interesse em fuso com GFP (green), BFP (blue) ou YFP (yellow), permitindo o monitoramento da expresso sem a necessidade da utilizao de anticorpos.

EXPRESSO DE PROTENAS EM BACTRIA

I. INTRODUO

Nos ltimos anos, a indstria de biotecnologia tem expandido sua atividade enormemente. Dentre essas, se destaca a produo de protenas recombinantes para diversas finalidades como aplicao teraputica. Para isso, diversos sistemas tm sido utilizados. Entretanto, a abordagem industrial visa obter essas molculas em quantidades da ordem de kg a toneladas. Teoricamente vrios organismos poderiam ser utilizados para esse fim, como clulas de mamferos, leveduras, bactrias, dentre outros. Contudo, a maioria das protenas so produzidas em clulas de mamferos ou Escherichia coli. Entretanto, o desenvolvimento de novos sistemas tem aumentado a possibilidade dessas aplicaes, dependendo das caractersticas da protena de interesse e objetivos da produo heterloga. A maioria das protenas recombinantes caracterizadas estruturalmente e depositadas no PDB (Protein Data Base) no ano de 2003 foram produzidas utilizandose E. coli como sistema heterlogo de expresso.

II. EXPRESSO DE PROTENA RECOMBINANTE EM ESCHERICHIA COLI

Aps a revoluo biotecnolgica com o advento de tcnicas avanadas de biologia molecular, a bactria E. coli foi utilizada como importante ferramenta para propagao de genes exgenos. A E. coli uma bactria Gram-negativa encontrada no trato intestinal de mamferos com caractersticas particularmente favorveis para uso em biotecnologia. A caracterstica marcante que favoreceu a utilizao de E. coli em aplicaes biotecnolgicas, seu fcil cultivo in vitro, tanto em termos de necessidade nutricional, temperatura de crescimento da bactria e altas densidades populacionais atingidas rapidamente. Como outras bactrias, E. coli possui DNA extra cromossomal com capacidade de replicao autnoma. Existe uma infinidade de plasmdeos bacterianos caracterizados e disponveis comercialmente. Para a produo de protenas recombinantes em E. coli, alguns fatores intrnsecos a protena de interesse devem ser observados. Genes provenientes de organismos eucariticos, as vezes, necessitam de processamentos ps-traducionais especficos que no so realizados por organismos procariticos, ex. glicosilao, formao de alto nmero de pontes de dissulfeto, processamento proteoltico em lisossomos. Mesmo com esses limitantes, muitas protenas eucariticas j foram produzidas em E. coli, ex. insulina humana. Vrios elementos so essenciais para o desenvolvimento de um sistema de produo de protenas recombinantes. No caso de E. coli, normalmente um plasmdeo contendo uma origem de replicao, o gene codificador sob controle de um promotor e terminador especficos, possuindo um gene marcador seletivo possibilitam a produo da protena de interesse. O nmero de cpias plasmidiais presente em clulas geneticamente modificadas de E. coli determinado pela origem de replicao. As mais utilizadas em E. coli so ColE1 derivado do plasmdeo pBR322 (15-20 cpias) ou da famlia pUC (500-700 cpias) ou p15A derivado do pACYC184 (10-12 cpias). Esses plasmdeos so replicados estavelmente quando combinados com agentes seletivos, favorecendo o uso desses replicons. A combinao dessas origens de replicao favorece a co-expresso de

genes de interesse sendo usados como tcnica para favorecimento de processamentos especficos. Com relao a mtodos de seleo dos clones bacterianos transformados, os principais genes marcadores de resistncia utilizados em plasmdeos para expresso em E. coli codificam enzimas que degradam antibiticos como ampicilina, tetraciclina, clorafenicol ou canamicina. A expresso do gene de interesse se dar de forma eficiente pela combinao de um forte promotor a um forte repressor, garantindo que a apenas aps a induo do gene ocorra a produo da protena recombinante, isso garante que genes txicos ou genes que provoquem estresse celular sejam adequadamente expressos. A induo da expresso do gene pode ocorrer termicamente (mudana de temperatura de crescimento) ou quimicamente com a adio de um acar por exemplo. Isopropilbetatiogalactosdeo (IPTG) o anlogo de lactose mais utilizado na induo de expresso de gene sob controle do promotor Lac. Entretanto, vrios outros promotores so disponveis, como responsivo a alterao de pH, concentrao de oxignio, osmolaridade, dentre outros. A sequncia terminadora da expresso gnica contribui com a estabilizao do plasmdeo previnindo a trancrio iniciada a partir de regies indesejadas como origem de replicao e outros promotores presentes no plasmdeo. E. coli finaliza a traduo preferencialmente no STOP CODON UAA e a insero de consecutivos cdons de parada ou seu prolongamento (UAAU) aumenta a eficincia desse processo de terminao. Alguns sistemas de expresso esto disponveis para a produo de protenas recombinantes em E. coli. Dentre eles, o sistema pET baseado no promotor T7 (Novagen) um dos mais utilizados, ainda h os sistemas baseados no promotor PL/repressos cI (Invitrogen, pLEX), promotor Trc (Amershan Biosciences, pTrc), promotor Tac (Amershan Biosciences, pGEX) o hbrido lac/T5 (Qiagen, pQE) e o marcantemente diferente baseado no promotor araBAD (Invitrogen, pBAD). Clulas de E. coli so excelentes sistemas para produo de protenas recombinantes, entretanto, os fortes promotores usados para produo em massa da biomolcula desejada trazem problemas devido a alta concentrao de protenas presentes no interior da clula. Um dos principais a formao de agregados amorfos

de protena, corpos de incluso. Isso ocorre pela interao entre molculas recm sintetizadas que ainda no assumiram a conformao nativa. Isso minimizado por ajustes em variveis como temperatura, taxa de expresso, metabolismo do hospedeiro, expresso com sistemas de fuso de protena e co-expresso de chaperonas. Vrias protenas j foram produzidas em E. coli. Como exemplo, as cadeias A e B de insulina foram produzidas em larga escala alcanando 600 e 800 mg de protena por litro de meio de cultura. Ainda, INF tambm foi produzido eficientemente em E. coli. Nesse sistema, foi produzido 2 g/l de hormnio de crescimento humano. Centenas de protenas de diversas origens j foram expressas em E. coli, tanto para caracterizaes biolgicas como aplicaes farmacuticas.

EXPRESSO DE PROTENAS EM LEVEDURAS

I. INTRODUO A engenharia gentica tem propiciado ao longo dos anos, o estudo das mais diferentes protenas, o que antes do desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante era muito difcil, pois a maior parte das protenas de origem eucaritica est presente em baixssimas quantidades nas clulas. Somente as protenas em grandes quantidades podiam ser purificadas para anlise da sua atividade, seu seqenciamento e at mesmo a produo de anticorpos. Atualmente, grandes quantidades de protenas podem ser produzidas pela tecnologia do DNA recombinante em clulas geneticamente modificadas. Tais clulas se multiplicam em fermentadores e expressam a referida protena heterloga, que pode ser extrada e purificada.

II. O USO DE LEVEDURAS PARA EXPRESSO HETERLOGA DE PROTENAS

As leveduras e os fungos filamentosos representam um dos mais importantes sistemas de expresso eucaritica atualmente disponveis. Isto se deve ao fato destes organismos serem facilmente manipulados geneticamente permitindo a introduo de vrias cpias de genes heterlogos de forma estvel, o que aumenta os nveis de expresso. Ainda, os processos fermentativos de leveduras so amplamente dominados,

o que permite o fcil scale up de produo para nveis comerciais. Estes microorganismos tm elevadas taxas de crescimento e so capazes de realizar vrias modificaes ps traducionais, como por exemplo, glicosilao. Dentre os fungos mais empregados destacam-se as leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Dependendo da aplicao, cada sistema fngico tem suas vantagens e limitaes.

2.1 - Saccharomyces cerevisiae

A levedura Saccharomyces cerevisiae considerada o microorganismo eucaritico mais bem conhecido e isto se deve a vrias caractersticas importantes. Sua gentica bem dominada e seu genoma foi totalmente seqenciado, fato este que representou uma das maiores conquistas da Biologia no sculo XX. Estas caractersticas, associadas a vrias outras, permitiram ao longo do tempo que este sistema se tornasse um dos mais poderosos sistemas de expresso heterloga, no qual vrias protenas eucariticas de interesse comercial que no puderam ser expressas eficientemente por outros sistemas passassem a ser produzidas por estes microorganismos. Uma caracterstica marcante nestes microorganimsos que eles apresentam o status GRAS (Generally Recognized As Safe) que de suma importncia no que se refere a produo de biofrmacos por engenharia gentica. Organismos com status GRAS no apresentam riscos de toxicidade e patogenicidade, o que permite sua utilizao para aplicaes nas indstrias de alimentos e farmacutica. Diversos produtos para fins teraputicos j foram produzidos por S. cerevisiae, dentre eles: Antgeno da hepatite B -Recombivax: Merck (primeira vacina para uso humano feita com antgeno recombinante, 1986); Leucocina GM-CSF: Immunex (transplantes de medula); Insulina: Novo Nordisk (diabetes); Albumina humana: Recombumin Delta Biotechnology .

Atualmente, com o desenvolvimento de outros sistemas de expresso fngicos, a expresso heterloga em S. cerevisiae tem se restringido introduo de genes para complementar uma via metablica permitindo que a levedura realize um processo que ela seria incapaz de realizar naturalmente. Este o caso da expresso de amilases e celulases para a produo de etanol a partir de substratos amilceos e lignocelulsicos, respectivamente.

2.2 - Pichia pastoris

Ao longo das duas ltimas dcadas, o grande emprego da levedura S. cerevisiae para fins biotecnolgicos estimulou o desenvolvimento de novos sistemas de expresso baseados em espcies alternativas de leveduras, por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae. Dentre estes novos sistemas, destacam-se as leveduras metilotrficas, ou seja, as que crescem em meio contendo metanol como nica fonte de carbono. Quatro gneros apresentam esta caracterstica: Pichia, Hansenula, Candida e Torulopsis, mas somente as espcies Pichia pastoris e Hansenula polymorpha (Pichia augusta) encontraram maior aceitao para a produo de protenas heterlogas em escala industrial por serem melhor estudadas. A levedura P. pastoris apresenta duas caractersticas que a tornam uma atraente hospedeira para a produo de protenas heterlogas. A primeira o forte promotor induzvel, denominado pAOX1, que controla a expresso do gene lcool oxidase (AOX1), envolvido na oxidao de metanol. Existem dois genes que codificam para a lcool oxidase, AOX1 e AOX2. Todavia, 95% da atividade da lcool oxidase atribuda AOX1. O mecanismo de ativao deste gene envolve tanto a induo do seu promotor por metanol quanto a sua represso pela ausncia de outras fontes de carbono. A segunda caracterstica importante de P. pastoris que esta levedura no considerada uma forte fermentadora, como S. cerevisiae. A fermentao realizada por leveduras gera etanol, o qual, em culturas de alta densidade, pode rapidamente atingir nveis txicos (efeito Crabtree). Para uma produo economicamente vivel de protenas recombinantes a concentrao de protenas no meio deve ser proporcional quantidade

de clulas. necessrio, pois, atingir nveis de alta densidade celular os quais no so facilmente obtidos com S. cerevisiae. Vrios genes de diferentes procedncias (bactrias, fungos, invertebrados, plantas e humanos) j foram expressos em P. pastoris sob o controle do promotor AOX1. A maioria dos genes expressos teve seus produtos secretados para o meio extracelular e alguns, como o fator de necrose tumoral humano, foi produzido no ambiente intracelular. A maioria das protenas secretadas por P. pastoris so glicosiladas, o que pode ou no afetar a atividade biolgica da protena recombinante. A glicosilao uma modificao ps-traducional que ocorre primeiramente, no retculo endoplasmtico e, posteriormente, no aparelho de Golgi. Observou-se que o tamanho da cadeia de carboidratos adicionados por P. pastoris bem menor que aquele adicionado por S. cerevisiae. A estrutura destes oligossacardeos muito similar adicionada em mamferos e, por no ser capaz de adicionar manoses terminais com ligaes -1,3, como S. cerevisiae, as protenas produzidas em P. pastoris so menos imunognicas. Todavia, se a glicosilao no desejada, as protenas de interesse devem ser produzidas intracelularmente.

BIORREATORES I. INTRODUO A expresso de protenas em sistemas heterlogos pode ser realizada de vrias maneiras. Diversos estudos tm mostrados novos mtodos para expresso de produtos biotecnolgicos aplicados indstria farmacuticos, com o objetivo de se obter grandes concentraes da protena desejada. Desse modo, a aquisio de sistemas de biorreatores permitiu a otimizao dos processos de crescimento celular e aumento da produo desses biofrmacos. II. TIPOS DE BIORREATORES E APLICAES Biorreatores de Plantas A primeira demonstrao do cultivo de clulas de plantas fora da planta inteira foi feita por Haberlandt em 1902, com a publicao do trabalho entitulado Tentativa de cultivo de clulas de plantas isoladas, tornando-se o pioneiro em sistemas de cultura de clulas de plantas. Estudos adicionais proporcionaram o desenvolvimento do crescimento de plantas in vivo, com a incluso de mudanas no controle da temperatura, aerao e agitao, e diferentes nutrientes adicionados nos meios de cultura. Com os avanos da Biotecnologia e a aplicao de Agrobacterium tumefaciens para transferncia de genes em outros organismos, um aumento de sistemas de cultura de clulas de plantas pde ser observado. Consequentemente, novas estratgias para cultivo de clulas foram introduzidos para produo de diferentes compostos em larga-escala

tais como protenas recombinantes, metablitos derivados de plantas e polissacardeos. Dessa forma, a construo de biorreatores permitiu uma produo de alta qualidade e rendimento de molculas importantes na manipulao de medicamentos. Atualmente, possvel induzir culturas de calos de quase todas as espcies de plantas, especialmente das dicotilednias. Por exemplo, o German Collection of Microorganisms and Cell Cultures apresenta um estoque de 700 linhagens de clulas de 80 famlias de plantas diferentes (WWW.dsmz.de). Desse modo, uma maneira eficiente para se produzir molculas de interesse a transferncia de processos bio-sintticos de frascos para biorreatores. Apesar de essa transferncia ser capaz de preservar o potencial bio-sinttico das culturas de clulas de plantas, ela dependente de diversos fatores inter-relacionados, tais como o mtodo de cultivo e fatores fisiolgicos da planta selecionada. Os biorreatores de plantas so considerados como a tecnologia prioritria no desenvolvimento de microorganismos. Recentemente, vrias configuraes de biorreatores esto sendo utilizadas. Alm das tcnicas tradicionais biorreatores em tanques, em colunas de bolhas e reatores de transporte de ar novos mtodos usando uma cascata de reatores ou uma combinao de reatores diversos. Alm disso, com o objetivo de se otimizar e validar a produo dos compostos desejados a custos reduzidos, novos biorreatores de culturas de clulas de plantas tem sido construdos. Dentre eles, esto os life reactors, wave biorreatores, slug bubble bioreactors e os undertow bioreactors. O sistema Wave consiste numa maquinaria onde a agitao simula o movimento de ondas que garantem uma aerao e mistura do meio homognea. O sistema muito til para cultivo de clulas de planta altamente sensveis e no auxlio das regulaes de cGMP pela presena de uma cmara plstica parte do sistema. Recentemente, o grupo da Nestle R&D Centre in Tours, na Frana, lanou dois tipos de biorreatores: o do tipo wave o de aerao rpida. O primeiro, assim como o sistema descrito anteriormente, baseado na agitao do meio pela formao de ondas, facilitando a aerao livre de bolhas e a homogeneizao do meio de cultura. Esse sistema pode ser usado para at 750L de cultura e foi capaz de aumentar at 1,3 vezes a biomassa das clulas em relao ao biorreator em tanques. O segundo sistema consiste num cilindro plstico onde a aerao obtida via gerao de grandes quantidade de

bolhas que se movimentam da base para o topo do biorreator. Esse biorreator eficiente para culturas acima de 175L, produzindo uma biomassa at 1,2 vezes maior do que a tcnica clssica de biorreatores em tanques. Biorreatores de musgo Os biorreatores de musgo aparecem como uma alternativa na produo em larga-escala de diversas protenas, especialmente no desenvolvimento de produtos biofarmacuticos. Os musgos contm um pequeno genoma de 511 Mpb, o qual permite que seja manipulado mais facilmente do que o sistema de plantas. Alm disso, o risco de contaminao com patgenos humanos e de animais reduzido, quando comparado a culturas de clulas bacterianas e de mamferos. Assim, as espcie Physcomitrella patens a mais utilizada em sistemas de biorreatores, num modelo denominado de transfeco mediada por polietilenoglicol de protoplasmas de musgo. As vantagens de P. patens em relao a plantas incluem uma maior taxa de recombinao homloga no seu DNA nuclear, proporcionando uma gentica reversa direta pelo gene-alvo. Isso permite o silenciamento de genes, sendo extremamente teis para produo de linhagens desejadas. Ademais, P. patens um organismo modelo em estudos fisiolgicos, uma vez que seus estgios de crescimento so bem definidos e separados, proporcionando uma possibilidade nica na anlise de suas condies de desenvolvimento no meio. Nesse caso, h o fato de que o estgio maior de desenvolvimento do musgo ocorre na sua forma halide de gametfito. Portanto, isso torna os procedimentos de glicosilao mais fceis de trabalhar, em comparao com outras culturas de clulas. Outras vantagem do uso de biorreatores de musgo a carncia de propenso para se utilizar cdon usage, permitindo a adaptabilidade para produo de praticamente qualquer protena. Assim, o fato de que musgos so capazes de realizar o processamento ps-traducional de protenas, incluindo a glicosilao e formao de ligaes dissulfeto, torna-os uma excelente ferramenta para a produo de compostos biofarmacuticos.

TCNICAS DE PURIFICAO DE PROTENAS

I. INTRODUO O conhecimento dos processos biolgicos relacionados ao metabolismo celular e a resposta fisiolgicas aos estmulos ambientais veio em grande parte do estudo de protenas particulares. Para estudar uma protena em detalhes os pesquisadores devem ser capazes de separ-la das demais biomolculas que compes os tecidos biolgicos, incluindo microorganismos e vrus, e estudar suas propriedades. Os mtodos necessrios para tal empreitada constituem os princpios fundamentais da qumica de protenas, uma cincia to antiga quanto a prpria bioqumica e que permanece numa posio central nesta rea das cincias biolgicas. Aps a preparao de um extrato protico bruto, uma protena especfica pode ser purificada por diferentes tcnicas cromatogrficas, cujos fundamentos sero aqui descritos.

II. PREPARO DO EXTRATO PROTICO BRUTO Lise celular A escolha do mtodo de lise celular deve ser feita de acordo com a natureza da fonte de protenas (se um fluido biolgico, uma suspenso celular, um tecido slido ou

outro material biolgico). Os mtodos de desrrupo celular podem ser brandos ou vigorosos, sendo utilizados sempre junto a uma soluo extratora, cujas caractersticas, como fora inica, salinidade, polaridade e pH devem ser observadas pelo pesquisador. A soluo extratora pode ainda ser utilizada junto a detergentes, para a solubilizao de protenas membranares; e inibidores de proteases, para a estabilizao de protenas sensveis a hidrlise.

Dilise Caso a soluo extratora escolhida seja incompatvel com os procedimentos cromatogrficos a serem utilizados posteriormente, o extrato protico bruto deve ser dializado. Este procedimento pode ser realizado contra gua, contra uma soluo diluda de um sal voltil, como bicarbonato de amnio, ou contra um tampo especfico. Freqentemente aps a dilise necessria a concentrao da amostra protica para a purificao por cromatografia, o que pode ser alcanado por liofilizao ou tcnicas de osmose reversa.

III. TCNICAS CROMATOGRFICAS Cromatografia de excluso molecular (filtrao em gel) A Filtrao em Gel a mais simples das tcnicas cromatogrficas, separando as protenas com bases na diferena de tamanho. Esta tcnica pode ser aplicada de duas maneiras: Separao de grupos, onde os componentes da amostra so separados em dois grandes grupos de acordo com seu tamanho a fim de se eliminar contaminantes de alta ou baixa massa molecular; Fracionamento de alta resoluo, onde possvel separar um ou mais componentes de uma amostra e separar monmeros de agregados. A Filtrao em Gel se aplica melhor a protenas sensveis a variao de pH e ons metlicos, sendo ainda utilizada como tcnica de desalinizao.

Cromatografia de troca-inica (IEX Ion Exchange)

Na cromatografia de troca-inica as protenas so separadas de acordo com sua carga superficial. Por essa tcnica se capaz de separar protenas com sutis diferenas de carga, como por exemplo, duas protenas que diferem exclusivamente por um nico aminocido carregado. Este aspecto faz da IEX uma tcnica apropriada para captura, purificao intermediria, e polimento de um protocolo de purificao.

Cromatografia de afinidade Esta tcnica separa as protenas de acordo com propriedades especficas que possam gerir a interao reversvel dessas molculas com algum ligante acoplado fase estacionria. Dentre as demais tcnicas cromatogrficas a cromatografia de afinidade a que apresenta maior seletividade e resoluo, sendo ainda a nica para a purificao de protenas com base na sua funo biolgica, estrutura qumica individual, e protenas presentes em baixas concentraes em grandes volumes. Freqentemente esta a tcnica utilizada para a purificao de protenas expressas em sistemas heterlogos.

Cromatografia de interao hidrofbica (HIC Hydrophobic Interaction Chromatography) HIC separa protenas de acordo com diferenas entre a hidrofobicidade dessas molculas. utilizada como tcnica complementar a outras que separam protenas por tamanho, carga ou reconhecimento bioespecfico. inda ideal para utilizao com amostras que se encontram sob altas concentraes salinas, como protenas precipitadas com sulfato de amnio ou amostras provenientes de cromatografias de troca inica. A elevada concentrao salina aumenta a interao entre as pores hidrofbicas das protenas e a matriz cromatogrfica. Durante a separao as protenas so eludas em pequenos volumes, o que se presta para a concentrao de amostras diludas.