Efectos in vitro del ultrasonido teraputico en el ncleo de los fibroblastos humanos Patrick G. De Deyne Micheline Kirsch-Volders Marco y propsito.

El propsito de esta investigacin fue examinar los efectos citolgicos del ultrasonido teraputico en los fibroblastos humanos. Materiales y mtodos. Usando una aproximacin in vitro, el nmero de clulas recubiertas, la morfologa de los cromosomas y la presencia de los husos mitticos, se estudiaron luego de la sonicacin de los fibroblastos humanos puestos en cultivo. La potencia del ultrasonido tena una frecuencia de 1 MHz y fue entregado en un modo de pulso de 2 milisegundos en encendido y 8 milisegundos en apagado . A la sonicacinse le gradu por 0, 30, 60 y 90 segundos. Resultados. Hubo una disminucin dependiente del tiempo en el nmero de clulas recuperadas, un aumento cudruple en el ndice mittico de las clulas que sobrevivieron al tratamiento, y un aumento casi ctuple de aberraciones cromosmicas con prdida de husos mitticos. Conclusin y discusin. El efecto ltico dependiente de la dosis del ultrasonido no trmico puede resultar en el fraccionamiento de las clulas, lo que podra facilitar la fagocitosis durante la inflamacin crnica. Adems, observamos un aumento en las aberraciones cromosmicas y una prdida de husos mitticos como resultado de un tratamiento ultrasnico extremadamente corto (30 segundos). Es posible que estas alteraciones sean mutagnicas o no garanticen la existencia de futuras investigaciones. Es posible que en nuestros experimentos in vitro, el ultrasonido recibido fue ms potente de lo que pueda ocurrir en una situacin clnica (De Deyne PG, Kirsch-Volders M. Efectos in vitro del ultrasonido teraputico en el ncleo de los fibroblastos humanos. Phys Ther. 1995; 75: 629-635) Palabras clave: Cultura celular, aberraciones cromosmicas, huso, ultrasonido teraputico, ultrasonido.

Los efectos biolgicos y citolgicos del ultrasonido teraputico, en respuesta a la sonicacina una frecuencia de 1 MHz e intensidades entre 0,5 y 3 W/cm2, tienen pocos documentos que los avalen, aunque se usa frecuentemente el ultrasonido a estas frecuencias e intensidades en combinacin con otras modalidades. Los estudios que enfatizan los efectos fsicos del ultrasonido teraputico ofrecen poca informacin sobre las consecuencias biolgicas de la sonificacin. Los estudios biomecnicos en tendones de Aquiles de conejos quirrgicamente reparados sugieren un aumento en la resistencia a la tensin como resultado de los tratamientos de ultrasonido. Los mtodos en especies vivas se usan, por lo general, para estudiar los cambios biolgicos. Se ha observado un aumento en la proliferacin de los fibroblastos y en la sntesis glicoaminoglicana despus de un tratamiento de ultrasonido en los tejidos conectivos. Estos efectos celulares sugieren un rol secundario para el ultrasonido usado en el tratamiento de cicatrizar heridas. Un informe sobre un posible efecto teratognico del ultrasonido teraputico qued inconcluso. Sin embargo, se ha notificado un aumento en el

tamao del tumor con el uso de la sonicacincontinua. Dinno y otros revisaron los efectos de los resultados del ultrasonido teraputico a nivel celular. Propusieron que los resultados del ultrasonido teraputico en un flujo de iones en aumento a travs de las membranas celulares y en niveles intracelulares de Ca2+ en aumento. Estos cambios intracelulares pueden resultar en secrecin en aumento, motilidad de las clulas, y sntesis de los factores del crecimiento, todo lo que puede tener efectos beneficiales en el tejido (cicatrizacin de heridas) que est siendo tratado. Sin embargo, en el resumen realizado por Dinno y otros, no se mencionan otras variables como la intensidad y el modo de aplicacin.

Otra forma de evaluar los efectos biolgicos del ultrasonido es mediante el uso de tcnicas de biologa celular como el cultivo de clulas. Una aproximacin in vitro podra mostrar cmo afecta el ultrasonido a las clulas y sus organelos. Kerr y otros, usando clulas hela, mostraron el trastorno de la membrana celular luego de un tratamiento in vitro por ultrasonido. Stella y otros realizaron un estudio a nivel del ncleo, y observaron un aumento en los intercambios de cromtidas hermanas en los linfocitos humanos, pero no hubo aberraciones cromosomticas. Estas aberraciones son mutaciones y se ha demostrado que estn relacionadas con la formacin de neoplasmas. Los experimentos para descubrir los posibles efectos mutagnicos del ultrasonido teraputico han quedado inconsclusos. Sin embargo, un estudio reciente mostr una dilatacin del tumor. No se encontr evidencia epidemolgica alguna que vinculara el cncer con el ultrasonido para uso teraputico. El propsito de este trabajo fue determinar si (1) se poda usar una aproximacin in vitro para estudiar el efecto del ultrasonido para uso teraputico a nivel celular, (2) el ultrasonido teraputico induce un cambio en el nmero de clulas, y (3) el ultrasonido teraputico tiene algn efecto en la morfologa de los cromosomas o la presencia de husos mitticos. Mtodo y materiales Ultrasonido Para este estudio se us un aparato de ultrasonido teraputico Sonoplus 417, calibrado por el fabricante. El cabezal transductor del ultrasonido (3 cm. de dimetro) fue limpiado con una solucin con 70% de etanol para mantener la esterilidad. El cabezal snico fue asegurado sobre un platn de 35 mm., que fue llenado con un volumen total de 1.5 ml de caldo de cultivo de clulas a una temperatura de 37C. El cabezal snico fue puesto perpendicular al platn y bajado para tener contacto con el caldo. La distancia entre el cabezal transductor y el fondo del platn fue aproximadamente de 3 a 4 mm. Para minimizar el efecto calrico de la energa ultrasnica, se us un modo de pulso de 2 milisegundos en encendido y de 8 milisegundos en apagado. La salida se fij a 1 W/cm2 (con un ndice de sonicacin de 2:8). Se realizaron experimentos para saber la respuesta a la dosis y mostr que las intensidades superiores a 1 W/cm2 poda ocasionar la prdida de todas las clulas. Por esto, las constantes fueron la intensidad y el modo de pulso, mientras que

el tiempo del tratamiento fue la nica variable. Las clulas fueron tratados por 0 (controles), 30, 60 y 90 segundos; cada grupo consisti de cinco a seis platones. Las clulas en el grupo control experimentaron el mismo tratamiento y las mismas manipulaciones que en los grupos experimentales. Cultivo de tejidos En este experimento, usamos fibroblastos de la piel de un humano de sexo masculino genticamente normal. Las clulas fueron cultivadas en caldo F12 que contena un 15% de suero fetal de ternero, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina en 5% de dixido de carbono y a una humedad del 95% y 37C de temperatura. Antes de comenzar el experimento, las clulas fueron separadas de platos plsticos para cultivos de 25 ml con una solucin de 0,2% de tripsina 0,2% de cido etilo-enediaminetetractico (AEDT) por 2 a 3 segundos, centrifugadas y resuspendidas. Se tom una alcuota para contar las clulas en un hemocitmetro. Se resuspendi un mililitro (con 1 milln de clulas) en un platn plstico para cultivo de 35 mm. Luego de la sonicacin, las clulas y el caldo fueron recolectados, centrifugados y resuspendidos, y las clulas fueron contadas. Despus, las clulas fueron recubiertas sobre un cubreobjetos de vidrio de 22 mm en platos plsticos de 35 mm y cultivadas por 24 horas. Los fibroblastos fueron manchados segn el mtodo descrito por Wissinger y otros. Esta tcnica permite un manchado diferencial de cromosomas y husos mitticos. Las clulas fueron fijadas en cido actico:metanol (3:1), que contiene 4 mmol de cloruro de magnesio y 1,5 mmol de cloruro de calcio. Luego de tres lavados de 14 minutos en fijacin, las clulas fueron secadas al aire, se les quit el cido ribonucleico y las clulas fueron tratadas por 24 horas en 5% de cido perclrico a 4C. Luego de que las clulas fueran secadas al aire, fueron manchadas por 24 horas en la oscuridad, usando una solucin que consista en 0,5% de safranina O y 0,5% de azul brillante R. Despus del manchado, las clulas fueron lavadas en agua destilada, secadas al aire, y amontonadas en portaobjetos con una resina sinttica para preparar el caldo. Para obtener el ndice mittico, se marcaron las figuras mitticas de las clulas en campos aleatorios. Un campo consista de un cuadrado de 25 mm2 obtenido a travs de un micrmetro ocular. Las clulas fueron vistas con un objetivo x20 en un microscopio de campo brillante. Las aberraciones cromosmicas fueron marcadas mientras se observaban con un objetivo x100 y se clasificaban segn el mtodo descrito por Parry y otros. Se evalu un mnimo de 400 clulas por portaobjeto. Los portaobjetos fueron codificados para eliminar cualquier influencia por parte del observador, quien contaba cuatro de los seis portaobjetos de cada tratamiento. La tabla 1 describe la clasificacin de las figuras mitticas y las aberraciones cromosmicas tal como lo definieron Parry y otros. Aunque los datos fueron obtenidos usando la clasificacin extendida, redujimos los datos y los representamos bajo una clasificacin menos elaborada (grupos I, II y III en Tabla 1). Anlisis de datos Para todos los anlisis estadsticos, se us un nivel alfa de 0,05 para determinar la significancia. Se utiliz un anlisis de varianza (ANOVA) para distinguir las diferencias en (1) el nmero de clulas

recuperadas como resultado de la sonicacin y (2) el aumento del ndice mittico como resultado del tratamiento de ultrasonido. Las pruebas post hoc fueron realizadas para detectar diferencias entre los grupos de tratamiento (0, 30, 60 y 90 segundos). Se us la prueba del chi-cuadrado no paramtico para examinar la relacin entre la dosis de ultrasonido y la clasificacin cualitativa de las figuras mitticas. Resultados Las cuentas de clulas (Figura 1) revelaron que comparados con el grupo control (99853x103 clulas/ml) quedaban 19750x103 clulas/ml luego de un tratamiento de ultrasonido pulsado de treinta segundos. Los tratamientos ms largos de 60 y 90 segundos resultaron en 14534x103 clulas/ml y 9725x103 clulas/ml, respectivamente, siendo presentados despus de la sonicacin. Las pruebas post hoc ANOVA y Newman-Keuls indicaron que cada periodo de sonicacin agreg para la prdida de clulas. El ndice mittico de las clulas sonicadas sugiri un cambio en la proliferacin de clulas. Analizamos la proliferacin de clulas usando el ndice mittico, que iguala el nmero de figuras mitticas/total de clulas contadas x 1.000 (Figura 2). Observamos que el ndice mittico cuadriplic luego de 30 segundos de sonicacin. Sorprendentemente, 90 segundos de ultrasonido hicieron triplicar el ndice mittico. Basndonos en el ndice mittico, la proliferacin de las clulas en los grupos experimentales aument comparado con el del grupo control. El aumento del ndice mittico nos lleva a un anlisis de los cromosomas y los husos mitticos que ser realizado en el futuro. La tabla 2 muestra los datos que obtuvimos primero, antes de reducirlos a la clasificacin simplificada (Tabla 1). La clasificacin de la morfologa de los cromosomas y los husos mitticos (Tabla 3) nos permite observar que de los cromosomas de gran parte de las clulas en el grupo control tienen una morfologa normal. Sin embargo, por alguna razn, los cromosomas aberrantes (grupos II y III) fueron observados en las clulas del grupo control. Los resultados de una sonicacin in vitro de 30 segundos arrojan un aumento casi ctuple en el nmero de clulas con aberraciones en el grupo II, y las clulas con una morfologa cromosmica clasificadas en el grupo III se cuadriplicaron comparados con las clulas en el grupo control. Se not una disminucin concomitante en el nmero de figuras mitticas normales. Un tratamiento de ultrasonido de 60 segundos arroj resultados similares; las aberraciones clasificadas dentro del grupo II (sin husos mitticos) aumentaron por nueve, y las aberraciones clasificadas dentro del grupo III (con husos mitticos) se triplicaron. Se encontraron muy pocas figuras mitticas normales luego del tratamiento de ultrasonido (1,39 0,84 con un tratamiento de 30 segundos) Discusin Los efectos no trmicos del ultrasonido teraputico a nivel celular se entienden muy poco. Esto se ha enfocado a la influencia secundaria del ultrasonido en la cicatrizacin de las heridas. Estos experimentos en vivo parecen indicar un efecto profundo del ultrasonido a nivel celular. Se ha llegado a un amento en la cantidad de componentes en la matriz extracelular, como los

glicoaminoglicanos y la hidroxiprolina (el nico aminocido de colgeno). La importancia del colgeno y su interaccin con los glicoaminoglicanos ha sido documentada correctamente y determina la fuerza y las propiedades viscoelsticas de los tejidos conectivos. Adems del efecto estimulatorio del ultrasonido en los fibroblastos como se ha demostrado en los estudios sobre cicatrizacin de heridas, el ultrasonido teraputico se dice que estimulan la secrecin de factores mitognicos desde los macrfagos. Los macrfagos son clulas importantes en la respuesta inmune a la inflamacin crnica. La observacin de que los macrfagos pueden ser estimulados por ultrasonido pueden apoyar los estudios clnicos que sugieren el uso ptimo del ultrasonido durante la inflamacin crnica, y no durante la inflamacin aguda. La disminucin dependiente de la dosis del nmero de clulas recuperadas demostr el efecto destructivo del ultrasonido no termal. La disminucin de las clulas recuperadas se puede deber a los efectos mecnicos y microvibratorios del ultrasonido, que pueden destruir las clulas. El efecto ltico no es discriminatorio y en la inflamacin crnica puede destruir el tejido cicatrizante (incluso el colgeno y los fibroblastos) as como los macrfagos, que limpian los restos. Sin embargo, los macrfagos migran al sitio de la inflamacin por quimiotaxis. La hiptesis que afirma que el ultrasonido puede aumentar la quimiotaxis por los macrfagos es interesante, pero an no se ha probado. Se cree que un efecto ltico del ultrasonido puede mediar por un trastorno de las membranas celulares. Kerr y otros usaron un microscopio para rastrear electrones para demostrar la apariencia de los poros en la membrana celular cuando las clulas fueron sonicadas en suspensin. Usando un diseo experimental similar, nuestro informe describe una prdida de clulas que depende de la dosis, probablemente debido al efecto ltico del ultrasonido no trmico sobre los fibroblastos cultivados. Las clulas postsonicadas tienen un ndice mittico ms alto, lo que indica una proliferacin celular ms alta. Sin embargo, el ndice mittico no muestra dependencia alguna en la dosis, lo que sugiere que la mayor parte del efecto ocurri en los 30 segundos posteriores a la sonicacin. Estos descubrimientos parecen ser similares a los realizados por Young y Dyson, quienes encontraron un aumento en el nmero de fibroblastos en vivo. Se necesitan hacer ms anlisis a futuro que requieran el uso de mtodos para doblar el tiempo y la incorporacin de la timidina (3H). Los cambios estructurales del aparato mittico fueron estudiados usando una clasificacin detallada basada en un manchado diferencial de los cromosomas y los husos mitticos. El anlisis cualitativo del ncleo para determinar la presencia de cromosomas o husos mitticos normales prob su importancia en la ilustracin de la amplitud de los cambios nucleares. Estos datos fueron reducidos a una clasificacin simplificada en tres grupos (I, II y III; ver Tabla 1). En nuestros experimentos, los datos fueron conseguidos 24 horas despus de que las clulas fueran tratadas con ultrasonido, demostrando as que las clulas eran viables. Sin embargo, la viabilidad de las clulas por 24 horas no necesariamente implica la capacidad de la divisin celular. El ndice mittico aumentado que notamos en la figura 2 no podra atribuirse a las figuras mitticas contadas errneamente, lo que son, en realidad, aberraciones cromosmicas. Ntese que la suma

de las figuras mitticas clasificadas para cada grupo en la Tabla 3 son iguales al ndice mittico, mostrado en la figura 2. El aumento del dao en el huso/cromosoma que puede resultar del ultrasonido afecta a los microtbulos/cromatinas en la interfase ms que en los cromosomas en mitosis. Los datos muestran que el mayor aumento ocurri en las figuras mitticas clasificadas como grupo II (aberrante sin husos mitticos). Si este descubrimiento es verdadero, podra sugerir un efecto adverso preferencial sobre los husos mitticos y los microtbulos, ms que sobre los cromosomas. La interaccin del ultrasonido con husos mitticos puede ser mecnica y nica debido al diseo experimental, pero los resultados de este estudio necesitan ser confirmados. Nosotros documentamos un aumento en las aberraciones cromosomales en los fibroblastos como resultado de un tratamiento de ultrasonido extremadamente corto. Se deben tomar precauciones en extrapolar los resultados de experimentos in vitro a situaciones in vivo, Este es un problema inherente del cultivo de clula/tejido. En nuestro experimento, las clulas (en suspensin) estaban directamente expuestas al ultrasonido. Es posible que una pequea dosis (30 segundos, 1 W/cm2, pulso de 2:8) usada in vitro resulte en una magnificacin de la energa que reciben las clulas (posiblemente por medio de la cavitacin, corriente acstica). Puede ser que el enfoque in vitro no refleje la situacin clnica y la dosis de ultrasonido recibida sea demasiado fuerte. Las aberraciones cromosmicas que se reportaron aqu pueden ser tan destructivas para las clulas que incluso si las clulas son viables, pueden ser incapaces de dividirse e inducir neoplasmos. Conclusin Este trabajo describe una prdida de clulas dependiente de la dosis, como resultado del fraccionamiento de las clulas que pueden facilitar la resolucin de la inflamacin crnica. Nuestros experimentos no descartan un efecto adverso posible del ultrasonido al nivel de los cromosomas y husos mitticos. Se necesitan estudios posteriores para determinar si las aberraciones cromosomales mencionadas aqu son verdaderamente mutagnicas o son resultado del diseo experimental.