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Determinacin de glcidos
Isaac Tnez1, Aurora Galvn2, Pedro Montilla1
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Dep. de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Crdoba, Avda. Menndez Pidal s/n, 14004 Crdoba, Espaa. 2 Dep. de Bioqumica y Biologa Molecular, Edificio C-6 (Severo Ochoa), Campus de Rabanales, Universidad de Crdoba, 14071 Crdoba, Espaa

RESUMEN

Siendo aldehdos o cetonas, los glcidos se clasifican tambin atendiendo a la cantidad de unidades que los constituyen en: monosacridos, oligosacridos o polisacridos. El monosacrido ms abundante y de especial relevancia para el ser humano es la glucosa, debido a su participacin en diferentes trastornos metablicos y endocrinos, siendo la diabetes sacarina la causa ms comn de las afecciones del metabolismo de los hidratos de carbono. Esta prctica analiza los glcidos, sus reacciones coloreadas, importancia, metabolismo y fisiopatologa, as como al conocimiento de las principales medidas para su identificacin y seguimiento. Ttulo Corto: Glcidos Palabras Clave: Hidratos de carbono, glucosa, diabetes, reacciones coloreadas Abreviaturas: 1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS Los glcidos, tambin conocidos como azcares, sacridos, carbohidratos o hidratos de carbono, constituyen el grupo de biomolculas ms abundantes sobre la superficie terrestre y representan los principales componentes de tipo energtico-nutricional. Estas molculas responden a la composicin genrica Cn (H2O)n, con una relacin entre H y O que le ha valido el trmino de carbohidrato. Desde el punto de vista qumico, los glcidos son polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas, esto es, alcoholes polivalentes (polialcoholes) que contienen un grupo carbonilo aldehdico (si lo porta el carbono del extremo) o cetnico (si lo porta un carbono interno). Entre las propiedades fsicas destaca la de su poder edulcorante y el desviar, como despus analizaremos, la luz polarizada en el seno de las soluciones. Sus funciones biolgicas principales son: * Reserva energtica: hgado, musculatura... * Papel estructural o plstica en el mundo vegetal y animal * Fuente inmediata de energa para la inmensa mayora de las clulas * Suministradores de tomos para formar otras molculas en rutas anapletricas El objetivo perseguido en esta prctica ser una correcta comprensin del concepto
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de glcido y de su clasificacin. Asimismo, se pretende una introduccin a la fisiopatologa y relevancia clnica relacionadas con estas macromolculas, as como a las reacciones que han servido y sirven para su reconocimiento. 1.1. Metabolismo de los glcidos. La digestin de los polisacridos se inicia en la boca, en donde la amilasa de la saliva hidroliza el almidn para dar dextrinas y maltosa. En el estmago, la amilasa de la saliva se inactiva por el pH. En el intestino, a pH ms alcalino, actan las enzimas procedentes del pncreas como la amilasa pancretica. Finalmente, enzimas de la mucosa intestinal concluyen la degradacin (disacaridasas). Posteriormente los monosacridos son absorbidos a travs de la pared intestinal hacia el torrente sanguneo y llevados al hgado por medio de la circulacin portal. 1.2. Regulacin hormonal Las hormonas que regulan la concentracin de glucosa en sangre son: a. b. c. d. e. f. g. h. i. Insulina (clulas beta del pncreas), hipoglucemiante Glucagon (clulas alfa del pncreas), hiperglucemiante Adrenalina (mdula suprarrenal), hiperglucemiante Tiroxina (glndulas tiroides), efecto insignificante Hormona del crecimiento, GH (pituitaria anterior o hipfisis anterior), hiperglucemiante Hormona adrenocorticotropa, ACTH (pituitaria anterior), hiperglucemiante Cortisol (corteza suprarrenal), hiperglucemiante Somatostatina (clulas del pncreas, otros tejidos) leve Somatomedinas (hgado), leve

1.3. Alteraciones del metabolismo de la glucosa Hiperglucemias * Diabetes sacarina o Mellitus (clasificacin segn el comit de expertos de la ADA y la OMS) Diabetes Mellitus tipo 1 Diabetes Mellitus tipo 2 Diabetes gestacional Otros tipos especficos de diabetes: Defectos genticos de la funcin de la clula beta Defectos genticos en la accin de la insulina Enfermedades del pncreas exocrino Endocrinopatas Inducida por qumicos o drogas Infecciones Formas no comunes de diabetes mediada por fenmenos inmunes Otros sndromes genticos asociados a veces con diabetes
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* Afecciones en la tolerancia a la glucosa * Anormalidad previa de tolerancia a la glucosa * Anormalidad potencial de la tolerancia a la glucosa Hipoglucemias Reactiva Facticia Posprandial Espontnea o de ayuno Errores innatos del metabolismo Afectaciones del Almacenamiento del Glucgeno

Tipo I (von Gierke) Tipo II (Pompe) tipo III (Cori) Tipo IV ( Andersen) Tipo V ( McArdle ) Tipo VI ( Hers) Tipo VII ( Tauri) Tipo VIII, IX y X Galactosemia Incapacidad de metabolizar la galactosa por deficiencia o ausencia de las tres enzimas que participan en su metabolismo. La galactosemia clsica es diagnosticada en lactantes. Tras la ingestin de leche se presentan vmitos, diarrea, cirrosis, cataratas y retraso mental. El diagnstico se efecta por la identificacin de galactosa en orina o suero y se confirma al encontrar una deficiencia enzimtica. Afecciones del metabolismo de la fructosa La fructosa puede aparecer en orina despus de la ingesta de frutas, miel y jarabes. Hay tres grupos especficos de afectaciones; todos ellos se transmiten como rasgo autosmico recesivo. Enfermedades de almacenamiento de los mucopolisacridos Los mucopolisacridos son componentes estructurales de cartlagos, hueso, piel y otros tejidos conjuntivos. Los tres tipos que participan son: dermatn dulfato, heparn sulfato y queratn sulfato.
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El Sndrome de Hurler es el prototipo; se trata de un almacenamiento progresivo que conlleva el enturbiamiento de la cornea y la muerte antes de los 10 aos. Los individuos presentan anomalas esquelticas, retraso en el desarrollo y hepatoesplenomegalia. Se diagnostica mediante la determinacin de mucopolisacridos en la orina. 2. MATERIAL Y REACTIVOS 2.1 Material 3. PROCEDIMIENTO 3.1. Reacciones coloreadas de los glcidos La reactividad de los hidratos de carbono es debida fundamentalmente, a los grupos funcionales carbonilo e hidroxilo. 3.1.1. Prueba de Molisch Determina la presencia de glcidos en el medio. El cido sulfrico es utilizado como agente de deshidratacin. El proceso consiste en la formacin de un producto de condensacin color prpura, que se obtiene al reaccionar el hidrato de carbono en el medio cido con el reactivo de Molisch que contiene -naftol. * Preparacin del reactivo de Molisch: disolver 100 g de -naftol en 1000 ml de alcohol etlico (95%). * Enumerar diferentes tubos * Incorporar 1 ml de las siguientes soluciones: Glucosa 5 por 100 Arabinosa 5 por 100
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cido clorhdrico Agua destilada Arabinosa Bao mara Cloruro frrico Fructosa Glucosa Orcinol -Naftol Pipetas 1 5 ml Pipetas automticas 25 1000 L Pipetas Pasteur Puntas desechables Resorcino Sacarosa Tubos de ensayo de vidrio Xilosa

Fructosa 5 por 100 Sacarosa 5 por 100 Azcar problema Agua destilada

* Aadir dos gotas del reactivo (inclinando los tubos de ensayo durante la adicin) * Depositar lentamente en cada tubo, a lo largo de su pared, 2 ml de cido sulfrico concentrado * Agitar ligeramente * Observar los cambios que acontecen en la interfase entre las dos disoluciones 3.1.2. Reaccin de Barfoed El reactivo basa su capacidad en la reduccin de los iones Cu2+ presentes en una dilucin. Este reactivo contiene Cu2+ en un medio ligeramente cido y es una prueba caracterstica de monosacridos. * Preparacin del reactivo de Barfoed: Disolver 66 g de acetato cprico y 10 ml de cido actico glacial en 800 ml de agua. Completar la solucin hasta 1 litro con agua. * Tomar tres tubos * Poner 2 ml de una disolucin que contenga respectivamente: Glucosa 5 % Sacarosa 5% Problema

* Incorporar 3 ml del reactivo * Poner en bao mara. Posteriormente, observar el cambio de color. Retirar los tubos una vez iniciado dicho cambio o cuando comiencen a precipitar. Anotar el tiempo transcurrido hasta que tuvo lugar la reaccin positiva. 3.1.3. Prueba de Seliwanoff El resorcinol condensa con los frufurales derivados de cetosas originando un color rojo intenso. Este fenmeno es desencadenado porque las cetosas se deshidratan a mayor velocidad que las aldosas. * Preparacin del reactivo de Seliwanoff: Tomar 0.5 g de resorcinol en 330 ml de HCl concentrado y diluir con agua destilada hasta 1 litro. * Tomar 4 tubos de ensayo * Incorporar 3 ml del reactivo * Depositar 3 gotas, con pipeta Pasteur, de: Glucosa 2% Sacarosa 2%
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Problema

* Poner 10 min al bao mara * Anotar tiempo en el que tiene lugar la reaccin 3.1.4. Test de Bial Se caracteriza por la presentacin, mediante condensacin, de un producto de color azulado originado por la reaccin del furfural, derivado de la pentosa, en su reaccin con HCl y el orcinol. Se trata de una reaccin caracterstica tanto de pentosas como de cidos urnicos. * Preparacin del reactivo de Bial: disolver 3 g de orcinol en 1 litro de HCl concentrado y aadir posteriormente FeCl3 al 1 %. * Preparar 6 tubos de ensayo * Aadir 1 ml de: Glucosa 2% Xilosa 2% Arabinosa 2% Fructosa 2% Sacarosa 2% Problema

* Aadir 3 ml del reactivo * Calentar en bao mara * Observar cambio de color

3.2. Aislamiento y cuantificacin del glucgeno heptico Los hidratos de carbono son almacenados como sustancia de reserva por los seres vivos en forma de polisacridos; el almidn y la inulina son las formas de almacenamiento en vegetales, mientras que el glucgeno es la reserva glucdica de los animales. El glucgeno consta de unidades de glucosa unidas por enlace glucosdico (1-4) formando cadenas; cada 8 10 unidades de glucosa, la cadena presenta ramificaciones que se unen mediante enlace (1-6). El glucgeno es especialmente abundante en el hgado (entre 3-5 g por 100 g de tejido fresco ) y en, en menor medida, el msculo. El ayuno disminuye las reservas de glucgeno fundamentalmente heptico. El objetivo de la prctica es el aislamiento del glucgeno heptico de ratas alimentadas y de ratas sometidas a 48 horas de ayuno. Su cuantificacin (como equivalente de glucosa) se realiza mediante la tcnica de la glucosa-oxidasa. Antes de
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realizar la determinacin de glucosa es necesario hidrolizar el glucgeno de manera enzimtica (con -amilasa) o bien por hidrlisis cida con ClH (la que se propone en este protocolo). 3.2.1 Aislamiento del glucgeno El glucgeno puede ser aislado de los tejidos por digestin de stos con una solucin concentrada de KOH (30%), en la cual el glucgeno es estable. Se separa despus de protenas y otros metabolitos solubles por su propiedad de precipitar con alcohol etlico (al 66%, concentrado final). 1. Tomar 0.2 g de hgado de rata en un tubo de vidrio con 2 ml de KOH (30%) caliente. Introducir el tubo en agua hirviendo durante 30-40 min con agitacin ocasional, hasta la completa digestin del tejido. Dejar 1 g de hgado para su homogenizacin y cuantificacin de protenas por la tcnica de Biuret. 2. Centrifugar 5 min a 3000 rpm y eliminar el precipitado. 3. El sobrenadante se pasa cuidadosamente a otro tubo de vidrio limpio, al que se aade 0.2 ml de SO4Na2 15% y 4 ml de alcohol etlico. Agitar para mezclar bien todos los componentes (no utilizar parafilm). Dejar en hielo 15-20 min para que precipite el glucgeno. 4. Centrifugar 5 min a 3000 rpm. Desechar el sobrenadante. El precipitado de color blanco-marrn es el glucgeno (la purificacin completa del glucgeno implica 35 precipitaciones alcohlica y una cida). 5. Disolver el precipitado (en el mismo tubo) con 1 ml de agua (una vez eliminado bien todo el sobrenadante de potasa).

3.2.2. Hidrlisis del glucgeno a glucosa Se realiza una hidrlisis cida del glucgeno para romper, al azar, los enlaces glucosdicos (1-4) y (1-6). Si la hidrlisis no es completa tendr lugar la formacin intermedia de todos los oligosacridos posibles de glucosa. Si la hidrlisis es total solo se obtendran restos de glucosa. En las condiciones experimentales se considera total 1. Aadir 1 ml de HCl 5N al tubo que contiene 1 ml de la solucin acuosa del glucgeno,. Agitar. 2. Incubar en un bao de agua hirviendo y luego enfriar en hielo 3. Aadir 1 ml de NaOH 5N con el fin de neutralizar la solucin. 4. Tomar 1 ml de la solucin anterior y aadir 2 ml de un tampn fosfato 100 mM. (esta ser la solucin A y representa una dilucin 1:3 de la inicial) 5. Tomar 1 ml de la solucin A y aadir 2 ml del tampn fosfato 100 mM. Esta ser la solucin B. 3.2.3. Cuantificacin La cuantificacin de la glucosa se realiza por la tcnica de la glucosa oxidasa tomando 0,1 ml de las soluciones A y B
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3.2.4. Clculo de las concentraciones de glucgeno Se debern calcular las concentraciones de glucgeno, expresado en gramos de glucosa por 100 g de tejido. La comparacin del glucgeno heptico entre ratas alimentadas y ayunadas debe resultar sorprendente.

3.3. Caso clnico Varn de raza blanca de 16 aos de edad lleg a la sala de urgencias del hospital en estado estuporoso. Al efectuar el examen fsico se observ que presentaba respiracin profunda y taquipnea, su aliento tena olor a frutas y su piel y membranas mucosas estaban secas. Datos de laboratorio Sodio 128 mmol/L (138-145 mmol/L) Calcio 10 mg/dL (8-25 mg/dL) Potasio 6,1 mmol/L (3,1-5,5 mmol/L) Fsforo 3,6 mg/dL (3.0 -4.5 mg/dL) Cloruro 88 mmol/L (95-105 mmol/L) Bicarbonato 9 mmol/L (21-27 mmol/L) Urea en sangre 50 mg/dL (8-25 mg/dL) pH 7,12 (7,35-7,45) pCO2 28 mmHg (35-45 mmHg) Glucosa srica 750 mg/dL (70-110 mg/dL) Acetona srica 3+ (0) Hematocrito 53% (42-45%) Hemoglobina 17,6 g/d}L (14-16 g/dL) Recuento leucocitos 12000/mm3 (4.300-10000 mm3) Recuento eritrocitos 6 millones /mm3 (4,5-5,2/mm3) 1. Identificar los datos de laboratorio y los signos y sntomas anormales Respiracin profunda y rpida, piel y mucosas secas, olor a fruta en el aliento, madre diabtica y hermano, sodio bajo, potasio alto, cloruro bajo, bicarbonato bajo, urea alta, pH bajo, pCO2 baja, glucosa srica alta, acetona srica alta, hematocrito alto, hemoglobina alta, recuento de leucocitos alto y recuento de hemates alto 2. Con base a los antecedentes clnicos de la paciente, las observaciones clnicas y datos de laboratorio, el tipo de intolerancia a la glucosa se clasificara como: Diabetes tipo I 3. Por qu aumentan los cuerpos cetnicos?
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Por el incremento de la liplisis para obtener energa de los lpidos. Este fenmeno induce un incremento en el acetil coenzima A que satura al ciclo de Krebs e induce la unin de unos con otros originando cido grasos parcialmente catabolizados denominados cuerpos cetnicos. 4. Qu observaciones indican prdida de agua? Piel y mucosas secas, aumento de urea, aumento de hematocrito, aumento de hemoglobina, aumento de eritrocitos, aumento de leucocitos, descenso de sodio y descenso de cloro 5. Qu parmetro nos indica un buen control sobre los estados de glucemia en los ltimos 120 das. La hemoglobina glucosilada (HBA1c) 4. BIBLIOGRAFA RECOMENDADA Berezov TT, Korovkin BF (1992): Chemistry and metabolism of carbohydrates. En Berezov TT, Korovkin BF (eds): Biochemistry, 1 Ed. Editorial Mir Publishers Moscow (Mosc, Rusia), pp. 215 256. DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (1998): Estudio general del metabolismo de los hidratos de carbono. En DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (eds): Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Bioqumico, 1 Ed. Editorial Paraninfo (Madrid, Espaa), pp. 53 72. Hanson NQ (1995): Carbohidratos. En Anderson SC, Cockayne (eds): Qumica Clnica, 1 Ed. Editorial Interamericana McGraw-Hill (Mxico D.F., Mxico), pp. 141 166. Harris RA (2004): Metabolismo glucdico I: Principales rutas metablics y su control. En Devlin TM (eds): Bioqumica, 4 Ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp. 597 664. Muoz E (1988): Propiedades qumicas de los azcares. En Lozano JA, Tudela J (eds): Prcticas de bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 Ed. Editorial Sntesis (Madrid, Espaa), pp. 65 70. McKee T, Mckee JR (2003): Hidratos de carbono. En Mckee T, McKee JR (eds): Bioqumica. La base molecular de la vida, 3 Ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana (Madrid, Espaa), pp. 200 233. Surez MD (1998): Alteraciones de la digestin, absorcin y metabolismo de los hidratos de carbono. En Gonzlez de Buitrago JM, Arilla E, Rodrguez-Segade M, Snchez A (eds): Bioqumica Clnica, 1 Ed. Editorial Alhambra (Madrid, Espaa), pp. 145 160.