GENETK TANI YNTEMLER

Yrd.Do.Dr.Aye Gl ZAMAN Seluk niversitesi Meram Tp Fakltesi Tbbi Genetik AD, KONYA

GENETK TANI YNTEMLER

1- Sitogenetik ve Molekler Sitogenetik Tan Yntemleri I. Sitogenetik Tan Yntemleri 1. Klasik Sitogenetik Tan Yntemleri 2. zellemi Sitogenetik Tan yntemleri a. Karde kromatid deiimi (Sister Chromatid Exchange= SCE) b. Mikronkleus (MN) c. Frajil blge tayini II. Molekler Sitogenetik Tan Yntemleri 1.Ak karyotiplemesi(Flow karyotyping) 2. Floresans in situ hibridizasyon (FISH) 3. Fiber FISH 4. Multicolor-FISH a. Spectral karyotyping (SKY) b. Multiplex-FISH (M-FISH) c. R-FISH d. Cobra-FISH e.Komparatif genomik hibridizasyon(CGH) 2. Molekler Genetik Tan Yntemleri I. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) II. Allel-zg oligonkleotid analizi (Allele-specific oligonucleotid= ASO) III. DNA dizi Analizi IV. Mikroarray Analizi

Kromozomlar

mitotik/mayotik metafaz

Spontan olarak blnen dokularda Kltrde blnmeleri iin uyarlan hcrelerde

3

Spontan olarak blnen hcreler: Kemik ilii Lenf nodlleri Solid tumorler Baz plevral ya da asidik svlar Fetal asitler Kistik higroma Fetus ya da yeni doan kan
4

Spontan olarak blnme hz dk olan hcreler: Kan lenfositleri Amniyon svs Koryonik villuslar Deri ve fibroblast ieren dier dokular

HCRE (DOKU) KLTR

Ksa sreli kltr (24-72, bazen 96 saat) rn: Kemik ilii, kan Uzun sreli kltr (1-3 hafta) rn: Amniyon svs, deri ve dier dokular ...

Doku Kltrnden kullanlan besi yerleri ve katk maddeleri (Kltr Ortam): 1. Besi Yerleri (=Vasat) Dengelenmi tuz solsyonu ile hazrlanrlar Hanks ya da HBSSozmotik basn ve pH kontrol Glukozhcreler iin enerji Medyumlar TC Medium 199 Minimal Esential Medium (MEM) McCoys 5A Nutrient Hams F-10 RPMI-1640 gibi Daha spesifik besi yerleri. rn: Chang Leibovitz L15
7

Doku Kltrnden kullanlan besi yerleri ve katk maddeleri (Kltr Ortam):

2. Antibiyotik Penicillin streptomycin

BAKTER

amphotericin nystatin

MANTAR

3. Serum Dana serumu (FBS) Sr fetusu serumu (FCS) Hcre byme faktrleri, adhezyon faktrleri, iz elementler, hormonlar,vitaminler 4. L-Glutamin ounlukla besi yerinin iinde hazr
8

5. Mitoz uyaran =Mitojen: EBV(Epstein Bar Virus), Pokeweed mitojen (PWM), Phorbol ester (TPA) En ok kullanlan mitojen : Phytohemagglutinin insan periferik kan kltrndeki olgun lenfositleri uyararak onlar blnmeye tevik eder.

KROMOZOM ELDES ve PREPARATLARIN HAZIRLANMASI (HARVESTING)

* 2 saat nce Kolisin ya da Demekolsin (mitozu durdurmak iin) sv faz * Santrifj hcre faz * Hipotonik Muamelesi 0.075 M KCl , % 0.95lik Na Sitrat * Fiksatif Muamelesi: (3 Metanol : 1 Asetik Asit) X 3 kere * Lamlara yayma ve kurutma
10

G-Bandlama
Most common method used Chromosomes treated with trypsin denatures protein Giemsa stain each chromosome characteristic light and dark bands 400 bands per haploid genome Each band corresponds to 5-10 megabases Dark bands are gene poor
11

diyogram

12

ISCN
International System for Human Cytogenetic Nomenclature Kromozomlarn herbir blgesinin numaralandrlmas Sentromere (proximal) en yakn blgeler iin en kk Sentromere (distal) en uzak blgeler iin en byk numaralar
13

HRB-Bandlama
Yksek znme 800 band prometafaz kromozom Metotreksat ve Kolisin kullanlr

14

Q-Bandlama
zellikle Y kromozomu anomalilerinde ve mozaisizim tansnda kullanlr G-band benzeri bandlar elde edilir.Fakat polimorfizmler saptanamaz Floresans mikroskop gereklidir.
15

R-Bandlama
X kromozom anomalilerini tanmlamak iin kullanlr Kromozomlar giemsa ile bandlanmadan nce sya tabii tutulur Ak ve karanlk renkteki bandlar terstir.

16

C-Bandlama
Sentromerleri ve heterokrometini tanmlamak iin kullanlr. Heterokromatik blgeler Tekrarlayan diziler ierir Olduka kondanse kromatin fiberleridir.
17

NOR-Bandlama
Gm (NOR)boyama: Nukleolar organizasyon blgeleri ve akrosentrik kromozomlarn ikincil boumlar boyanr.

18

Karde kromatid deiimi

ki hcre dngs boyunca kromatidleri ayrma frsat veren BrdU (bromo-deoxyuridine) kltr ortamna eklenir. Sadece bir zincirde DNA BrdU almsa normal karanlk Giemsa boyamas olur, dier zincir daha ak renkle boyanr. Eer deiim gerekletiyse, kromatid para para ak ve koyu renklerde grlr: "harlequin kromozomlar.
19

Karde kromatid deiimi

20

Mikronkleus teknii

21

Frajil blge tesbiti

22

Ak Karyotiplemesi
Ultrasonik titreim bal Hcre sspansiyonu
Koruma svs

dedektrler

ANALZR

pozitif ykl tek floresan hcre ieren damlalar

Nonfloresan negatif ykl tek hcre ieren damlalar

Hcre toplayc Hcre toplayc

23

Ak Karyotiplemesi
Kromozom says

Floresan oran

24

Floresans In Situ Hibridizasyon FISH

Hedefin hazrlanmas Probun hazrlanmas Denaturasyon Hibridizasyon Hibridizasyon sonras ykama Kromozomlarn boyanmas Floresans mikroskobi

25

Tm Kromozom Boyama Problar (Kromozom Painting Prob )

Chromosome 8 painting probe

26

Sentromer Spesifik Problar

kromozom 7 sentromer spesifik signal kromozom 8 sentromer spesifik signal

27

Lokus Spesifik Problar Tek Gen Problar

DiGeorge Sendromu (22 de mikrodelesyon) 22q13e zg kontrol sinyali 22q11.2ye zg DiGeorge probu

SRY lokus spesifik prob kullanlarak yaplm FISH rnei. SRY/X probu kullanld. X kromozomu SRY

28

Telomerik Problar:

29

Fiber FISH

30

Spektral Karyotipleme (SKY)

31

Multiplex FISH
Akcier kanseri hcre dizilerinde 5-florokrom M-FISH karm ile hibridizasyon sonras A)gerek renk metafaz, B) snflandrlm renk sunumu

32

Multiplex FISH

C). Karyotip

33

Cobra FISH
nsan COBRAFISH prob set ile elde edilen 12-renk imaj. Sadece adet florokrom kullanlarak yaplan oranl iaretleme(DEAC, Cy3 and Cy5 ). Beyaz ok klasik sitogenetik yntemlerle tesbit edilemeyen bir translokasyonu gstermektedir.
www.nature.com/.../v1/n1/full/nprot.2006.41.html 34

R x FISH=Cross-species colour FISH

www.nature.com/.../v1/n1/full/nprot.2006.41.html

35

Karlatrmal genomik hibridizasyon= comparative genomic hybridization (CGH):

36

Karlatrmal genomik hibridizasyon(CGH):

Hasta dokunun DNAs (TEST) aretleme (Krmz Floresan) Normal doku DNAs (KONTROL) aretleme (Yeil floresan)

Normal metafaz kromozomu ile hibridizasyon

-2 0 2 (log2 ratio)

Amplifikasyon

Delesyon

37

Karlatrmal genomik hibridizasyon (CGH):

CGH-metafaz pla

Test DNAs ile hibridizasyon *Test DNA FITC/yeil *Referans DNA Rhodamine/krmz

38

Karlatrmal genomik hibridizasyon (CGH):

CGH- karyotip

Ayn metafazn CGH karyogram(bir nceki slayt

39

Karlatrmal genomik hibridizasyon (CGH):

CGH idiyogramlar

40

Karlatrmal genomik hibridizasyon (CGH):

normal

kazanm

kayp

41

Polimeraz zincir reaksiyonu(PZR)

ift zincir DNA

Isyla zincirlerin Primerlerin ayrlmas hibridizasyonu

DNA polimeraz +dATP, Primerlerden +dGTP, DNA sentezi +TTP, +dCTP

1.basamak

2.basamak Birinci siklus

3.basamak

Ayrlan DNA zincirleri balanan primer

DNA sentezi

Ayrlan DNA zincirleri balanan primer

DNA sentezi

Ayrlan DNA zincirleri balanan primer

DNA sentezi

DNA oligonkleotid primerler

Amplifiye edilecek olan cift zincirli kromozomal DNA blgesi (hedef blge)

Birinci siklus ki adet cift sarmal DNA molekl sentezlenir

kinci siklus Drt adet cift sarmal DNA molekl sentezlenir

nc siklus Sekiz adet cift sarmal DNA molekl sentezlenir

42

PZR'nin genetikte kullanm alanlar:

Onkogenezis aratrmalar, Kaltsal hastalklarda taycnn ve hastann tans (mutasyon analizi), Prenatal tan, Klinik rneklerde patojen organizmalarn saptanmas, Adli tp (DNA parmak izi aratrmas,vb), Prob oluturulmas/klonlama/gen ekspresyon arastrmalar, DNA dizi analizinde, byk miktarda DNA rneklerinin oluturulmasnda, Bilinmeyen dizilerin tayininde, Gemi DNA'nn incelenmesinde, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analizinde, Invitro fertilizasyon yaplan tek hcrede, implantasyon ncesi genetik testlerin yaplmas, DNA protein interaksiyonunun aratrlmasnda (footprinting) kullanlabilir.

43

Allel-zg oligonkleotid (ASO)

Hibridizasyon

Hatal eleme Hibridizasyon yok

Genotip

Hatal eleme Hibridizasyon yok Genotip

Hibridizasyon

44

Allel-zg oligonkleotid (ASO)

heterozigot

Homozigot Homozigot Homozigot

hastalar

Homozigot

heterozigot heterozigot

heterozigot

45

DNA Dizi Analizi:

46

DNA Dizi Analizi:

47

Mikroarray Analizi
Hedef mRNA hazrlanmas

RT/PCR Floresan boyalarla iaretleme

Microarray oluturulmas

Eit oranda birletirme

Hedef karm mikroarray ile hibridize edilir tarama Verinin analizi

48

Mikroarray analizi

49

Mikroarray analizi

50