EXPERIENCIA N 02 MICROSCOPIA: DESCRIPCIN Y MANEJO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO DE LUZ Y TIPOS DE MICROSCOPIOS I.

INTRODUCCIN: La microscopia es una herramienta fundamental de la biologa y sus especialidades, de la cual es ms relacionada con la histologa, pero realmente la anatoma microscpica que queda desvelada por las tcnicas microscpicas va ms all de los tejidos (histologa) ya que abarca la clula y sus componentes (citologa y biologa celular), rganos y sistemas orgnicos (fisiologa). Ciertamente estas tcnicas no se aplican de una forma esttica de los componentes de los organismos vivos para obtener una mera descripcin de estos, sino que al acompaar a otras disciplinas de la biologa permiten desvelar la funcin de los distintos componentes por ello que el objetivos de la practica consiste en la obtencin de la destreza microscopio ptico como herramienta fundamental en el estudio celular e histolgico.

Breve historia: Como sabemos una de las bases de la investigacin es la observacin. Pero el estudio de organismos pequeos y detalles tisulares quedaba restringido debido a la resolucin del ojo humano (0.125 mm). La necesidad de un nivel de resolucin mayor propicio la aparicin de instrumentos fundamentales para el desarrollo de la biologa, la aparicin del microscopio compuesto de Janssen y posteriormente su mejoramiento con lentes mas pulidos por parte de Antony van Leeuwenhoek. Las caractersticas del primer microscopio diferan de los actuales, ya que estos tenan una sola lente casi esfrica, montada entre dos placas metlicas y la muestra se situaba sobre un pequeo alfiler. Con dos tornillos que movan la muestra para el enfoque.

Los microscopios pticos modernos datan de principios del siglo pasado y se caracterizan por ser de tipo compuesto, al disponer de una lente ocular y una lente objetivo. Existen actualmente diversos tipos de microscopios pticos que se diferencian fundamentalmente en las caractersticas de la fuente de luz empleada. Tipos de microscopios: a) Microscopio de campo claro: Ms comn en los laboratorios de histologa, se denomina microscopio compuesto o de campo claro. Es descendiente directo de los primeros microscopios. El microscopio actual recurre a la distribucin especfica de grupos de lentes para amplificar las imgenes. La fuente luminosa es un espejo o un filamento de tungsteno cuya luz es dirigida a un solo punto por la lente condensador. El haz de luz se localiza por debajo de la preparacin que debe ser bastante fina para atravesarla. Al pasar la muestra, parte de la luz es absorbida y la diferencia de absorcin de la luz en diferentes partes del espcimen produce contrastes que revelan detalles de su estructura, tras pasar a travs de las lentes objetivos que se encuentran asentadas sobre una platina mvil. b) Microscopio de contraste de fases: Permite observar clulas y tejidos sin colorear y por eso resulta especialmente til para el examen de clulas vivas. Existen pequeas diferencias del ndice de refraccin en diferentes partes de la clula. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin y experimenta una reflexin y se retarda quedando desfasada con las ondas adyacentes. Estas diferencias de refraccin no resultan evidentes con el microscopio ptico, pero con el microscopio de contraste de fases las longitudes de onda fuera de la fase se anulan con otras inducidas por una serie de

anillos del sistema ptico, con el cual puede verse el objeto con un grado de contraste adecuado. c) Microscopio de fluorescencia: Permite detectar molculas que emiten fluorescencia. Algunas sustancias emiten luz de una determinada longitud de onda del espectro visible cuando son expuestas a la longitud de onda menor, generalmente la luz ultravioleta. Se usa este microscopio para detectar molculas fluorescentes naturales y adems detecta la fluorescencia artificial asociada a una sustancia o componente determinado. d) Microscopio ultravioleta: Se analiza la absorcin de la luz ultravioleta por los componentes de la muestra. Tiene un modo de funcionamiento similar a un espectrofotmetro, pero permite registrar los resultados como una fotografa. No permite por supuesto una visin directa debido a la incapacidad del ojo humano de captar la luz ultravioleta. Se utiliza para detectar ciertos componentes muy especficos en las muestras, tales como cidos nucleicos o ciertos aminocidos. e) Microscopio electrnico (ME): Estos microscopios utilizan rayos de electrones en lugar de luz, lo que les permite tener un poder de resolucin muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0.005 0.0003 nm, muy corta comparada con la luz visible (426 750 nm). El poder de resolucin del ME es de 0.003 um, comparado a 0.25 um del microscopio compuesto. Los aumentos pueden ser hasta un milln de veces. A causa de la naturaleza de este instrumento solo puede examinarse objetos muy delgados, incluso una bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que para preparar muestras para el ME se necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Despus de la deshidratacin, muestra se incluye en una resina y es aqu donde re realizan cortes finos con un ultramicrtomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola bacteria puede cortarse en cinco o seis secciones. Si solo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por lo que se montan clulas enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de electrones es dirigido por sobre la preparacin y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. A la primera tcnica se denomina Microscopia

Electrnica de Transmisin (MET) y a la segunda Microscopia Electrnica de Barrido (MEB).

II. OBJETIVOS:

Describir e identificar las partes del microscopio compuesto de luz Adquirir destreza en la manipulacin del microscopio compuesto de luz Determinar los fundamentos de la microscopia

III.EL MICROSCOPIO PTICO:

A. Componentes: El microscopio compuesto es un complejo instrumento de precisin, de uso frecuente en laboratorios biolgicos. Consta de 2 partes fundamentales la parte ptica y la parte mecnica.

1. Parte ptica: 1.1 Sistema de lentes: Oculares y Objetivos

Ocular(es): van cerca del ojo del observador, es un sistema de 2 lentes planos convexos con un diafragma intermedio, pueden ser de 5x, 10x, 12x que son los aumentos adems dan una imagen virtual y derecha. Objetivos: llamados as por van cerca al objeto a observar. Est constituido por un tubo cilndrico cnico, que lleva en su interior un sistema de lentes destinados a dar una imagen real e invertida del objeto, pueden ser de 10x, 40x, 100x que indican el aumento.

Clases de objetivos: Objetivos secos: Son aquellos que entre el lente frontal y el objeto a observar no existe sustancia alguna, excepto el aire.

Objetivo de inmersin: aquellos que entre el lente frontal y el preparado a observar se interpone una sustancia liquida (comnmente aceite de cedro), cuyo ndice de refraccin es parecido al del vidrio (1.50), solo se utiliza para preparados en seco. Se caracteriza por: Ser el de mayor aumento La lente frontal es ms pequea Lleva inscrita una fraccin 1/20 o una decima 1.20

(que nos indica la distancia focal de este objetivo, que es la distancia entre el lente y el objeto a observar en este caso 1.20 mm) 1.2 Sistema de Iluminacin: Espejo o fuente de luz: Situado en la parte inferior del microscopio. En los microscopios modernos se trata de una bombilla incandescente o halgena mientras que en modelos antiguos el microscopio posee un espejo que refleja la luz hacia la platina. Condensador: Es un sistema dispositivo constituido por un sistema de dos o ms lentes montados dentro de un cilindro cnico truncado, de metal, est constituido por debajo de la platina. Este sistema permite concentrar o condensar los rayos luminosos emitidos por el espejo. Se acciona por un tornillo. Diafragma: Situado debajo del condensador, regula la cantidad de luz que incide sobre la preparacin. Constituido por un sistema de laminillas metlicas, dispuestas de tal forma que permita abrir y cerrar y as regular la luz.

2. Parte Mecnica:

Tiene la funcin de dar el soporte y ubicacin a los elementos del sistema ptico y el sistema de iluminacin, permitiendo desplazamientos que favorecen el correcto enfoque del instrumento.

Formado por:

Pie: Sostiene al microscopio, asegurando su estabilidad. Brazo: articulada al pie, al tubo ocular y los tronillos macro y micromtrico. Es de donde se toma para su traslado y manejo. Platina: es una plancha metlica colocada en posicin horizontal, perpendicular al brazo, en el centro presenta un orificio que permite el ingreso de la luz, lleva adherida unas pinzas que sujetan la lamina porta objetos, as mismo un carril mvil (charriot) para el desplazamiento del preparado. Tubo ptico: metlico de forma cilndrica, oscurecido interiormente en el extremo superior se ubica el lente ocular, e inferiormente, ya sea directamente o por medio del revlver, los lentes objetivos. Revolver: Dispositivo metlico, de forma circular, atornillado en la parte inferior del tubo ptico, gira su eje central, presenta de 3 a 4 orificios donde se entornillan los objetivos. Y sirve para cambiar la disposicin de los objetivos en la observacin. Tornillo macromtrico: se sita en la parte media de la columna, permite grandes desplazamientos de la platina. Tornillo micromtrico: situado bien debajo del macromtrico o bien comparten la misma ubicacin. Sirve para hacer desplazamientos finos con la finalidad de afinar la imagen.

B. Aspectos tericos sobre el funcionamiento del microscopio ptico:

a) Aumento proporcionado por un Microscopio: dado que el objetivo

da una imagen real y aumentada que es nuevamente aumentada por el ocular, el aumento total del microscopio compuesto ser el producto de ambos. Si bien es importante conocer los aumentos con los que se trabaja, no lo es tanto como saber el poder de resolutivo del mismo. Por ejemplo: objetivo de 20x con un ocular de 10 x dar un aumento de 200 veces.

b) Poder de Resolucin de un Microscopio: el poder resolutivo se

refiere a la capacidad mxima para ver separados dos puntos situados muy juntos. El Poder de resolucin del ojo humano es de 0.125 mm, eso quiere decir que si vemos 2 puntos ms cerca que 0.125 mm lo veremos como uno solo. Un microscopio compuesto puede resolver como mximo 0.20 um. Para mejor entendimiento de estos dos conceptos valga un ejemplo. Si con una lupa de 4 aumentos se observa una preparacin microscpica, no se pueden ver las clulas. Pues bien si se hace una fotografa a travs de la lupa y se ampla 50 veces, por lo tanto tendr una ampliacin de 200 aumentos pero no ver las clulas, pero si observa la misma preparacin por el microscopio a 200 aumentos se distinguen perfectamente las clulas, y en una fotografa a travs del microscopio y sin necesidad de ampliacin puede reconocerse esas clulas. Por qu entonces no se ven en la primera fotografa y en la segunda si? Sencillamente por el poder de resolucin, puesto que el de la lupa es pequeo y al ampliar la fotografa solo se ve ms grande lo que ya se vea antes, y en cambio cuando amples la foto se ver borrosa, sin definicin a esta foto se le llamara exceso de ampliacin y falto de resolucin. Por tanto, la calidad de un juego de lente (ocular-objetivo) depender no solo de la capacidad del lente para la ampliacin sino tambin de la resolucin que presenta. La calidad del lente depender de lo cerca que se aproxime su poder de resolucin al lmite terico, y este esta determinado por la longitud de onda de la luz visible que se utilice para la observacin, por el grosor del espcimen y por la apertura numrica del objetivo. La apertura numrica es un factor determinante en la eficiencia de un objetivo y del condensador para dar imgenes con alta resolucin. De tal manera a mayor apertura numrica la imagen presenta mejor luminosidad y resolucin. La apertura numrica responde a la siguiente frmula: AN: nsen. Donde n es igual al ndice de refraccin del medio que se encuentra entre el objetivo y el preparado. Normalmente este medio es el aire (n: 1) o aceite de inmersin (n: 1.4).

C. Manejo y Enfoque de un Microscopio:

a) Reglas Generales Para El Cuidado Del Microscopio

1. Traslado. Se toma con la mano derecha el brazo del microscopio y con la mano izquierda la base.
2. El cordn se deber enrollar sobre si mismo, no alrededor del cuerpo

del microscopio.
3. El microscopio se encender hasta que comience la observacin. 4.

Ya encendido, no se apagar constantemente, sino hasta finalizar la observacin de todas las muestras que se indiquen en la prctica, mientras no se observe, se disminuir la intensidad luminosa.

5. Mientras permanezca encendido se evitar realizar cualquier

movimiento brusco.
6. Se evitar manejarlo con las manos hmedas o mojadas. 7. Cuando no se est observando, deber eliminarse la lente ocular con

el objeto de menor aumento.

8. El sistema ptico y de iluminacin nunca deber ser tocado con los

dedos.
9. No se debern colocar los portaobjetos mojados sobre la platina. 10. Despus de usar el lente de inmersin se deber limpiar con un pao

suave o con un papel higinico.

11. En las preparaciones en fresco siempre deber cubrirse con

cubreobjetos. b) Obtencin De Un Buen Enfoque:

1. Colocar el portaobjetos sobre la platina del microscopio. 2. Utilizar el objetivo de menor aumento. 3. Deslizar el tubo del microscopio por medio del tornillo

macromtrico, observando lateralmente hasta que el objetivo quede cerca del portaobjetos.
4. Observar a travs de los oculares subiendo lentamente el tubo del

microscopio hasta observar la preparacin enfocada, no debe bajarse el tubo del microscopio mientras se est observando, porque puede llegar a chocar el objetivo con el portaobjetos y ocasionar desperfectos.
5. Afinar la imagen moviendo lentamente el tornillo micromtrico. 6. Si se desea mayor aumento, girar el revlver al objeto adecuado. 7. Si se utiliza el objeto de inmersin (100 X) colocar sobre la

preparacin una gota de aceite de cedro y baja el tubo del microscopio hasta que la lente del objetivo toque a la gota, observa y ajusta cuidadosamente despus de su uso limpiar el objetivo con un tejido suave (papel seda)y alcohol.
IV.

Resultados :

A) Seale los componentes del sistema ptico y sistema mecnico de la siguiente figura del microscopio compuesto de luz.

B. Cuestionario: 1. Qu es la apertura numrica? 2. Qu entiende por Poder de Resolucin? 3. Qu tipo de imagen da el ocular y los objetivos? 4. Cul es la mxima capacidad de resolucin que posee el MC? 5. Cmo se calculo el nmero de aumentos en una muestra?