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I.
AISLAMIENTO:
Competencias: el estudiante: Asla microorganismos productores de alcohol a partir de sedimentos de cachina y de fruta.
Procedimiento: 1.1. Aislamiento de microorganismos productores alcohol. 1.2. a. Observacin de la muestra: Evaluar las caractersticas organolpticas de la muestra (cachina o fruta).
a. Aislamiento: Para la muestra de fruta: lavar la superficie de la fruta con 20 ml SSF estril utilizando una bolsa de primer uso. Tomar del lavado dos asadas y sembrar por estra y agotamiento sobre placas de agar papa dextrosa (PDA) con cloranfenicol e incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das.
P ara la muestra de cachina: tomar una asada de sedimento y sembrar por estra y agotamiento en placas (PDA) con cloranfenicol e incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das.
b. Identificacin. Realizar un estudio macroscpico y microscpico de las colonias presentes en el medio de cultivo (Sabouraud). Repicar las colonias obtenidas en tubos con agar Sabouraud o PDA inclinado por el mtodo de estra. Rotular los tubos e incubarlos a temperatura ambiente por 3 a 5 das. Conservar los cultivos en refrigeracin.
Identificacin macroscpica
Observacin microscpica
PDA + cloranfenicol
II. SELECCION: Competencias: Selecciona microorganismos productores de alcohol a partir de colonias que presenten clulas levaduriformes. Conserva las cepas de los microorganismos mejores productoras de alcohol. Procedimiento: 1. Seleccin de microorganismos productores de alcohol. a. Sembrar la levadura aislada, en placa de agar Papa Dextrosa Agar (PDA). Incubar a temperatura ambiente por 2 a 3 das. b. Determinar la concentracin celular de cada cultivo empleando cmara de Newbauer, colocar 3 ml de caldo Sb o SSF estril en la placa, resuspender las clulas y extraer la suspensin a un tubo estril. c. Inocular suficiente suspensin celular para alcanzar una concentracin de 107 o 108cel/ml en 100 ml de mosto de uva con 20 - 25 grados brix, en frascos de fermentacin de 120 ml de capacidad. d. Sellar los sistemas de fermentacin e incubar durante 7 das a temperatura ambiente. e. Determinar la cepa con mayor capacidad de produccin de alcohol en forma indirecta por el consumo de azucares reductores utilizando el refractmetro. f. Repicar la cepa en 2 tubos de agar Sb incubar a temperatura ambiente por 2 a 3 das y conservar a 4 C en refrigeracin
PDA + Cloranfenicol
Sedimento
Azul de metileno 1ml 1ml 1ml
SSF 9ml
SSF 9ml
SSF 9ml
1ml
10
10
10
Inoculo
RESULTADOS: Determinacin de la concentracin de las levaduras de la cachina X x 25 x 103 x 10 x 104 x d = cel/ml X=8 8 x 25 x 108 = cel/ml 2x1010 cel/ml C1 x V1 = C2 x V2 V1 = C2 x V2 C1 V1 = 108x 100ml 2x1010 V1 = 0.5 ml Determinacin de la concentracin de las levaduras de la fruta X x 25 x 103 x 10 x 104 x d = cel/ml X = 30 30 x 25 x 108 = cel/ml 3x1010 cel/ml C1 x V1 = C2 x V2 V1 = C2 x V2 C1 V1 = 108x 100ml 3x1010 V1 = 0.3 ml
0.5 ml
Inoculo de la fruta
- Cmara de luz ultravioleta - Levadura (s) seleccionada (s) por su mayor grado alcohlico. - Solucin salina fisiolgica (NaCl 0.85%) - Mechero - Hisopo estril
2. PROCEDIMIENTO
a. Sembrar la levadura aislada en placa de Agar Papa Dextrosa. Incubar a temperatura ambiente por 2 a 3 das. b. Determinar la concentracin celular de cultivo empleando cmara de Newbauer, colocar 3 ml de calo Sb o SSF estril en placa, resuspender las clulas y extraer la suspensin a un tubo estril. c. Inocular suficiente
7
suspensin
8
celular
para
alcanzar
una
concentracin de 10 0 10 cel/ml en 100 ml de mosto de uva con 200- 250 grados Brix, en frascos de fermentacin de 120 ml de capacidad. d. Sellar los sistemas de fermentacin e incubar durante 7 das a temperatura ambiente. e. Determinar la cepa con mayor capacidad de produccin de alcohol en forma indirecta por el consumo de azucares reductores utilizando el refractmetro. f. Repicar la cepa en 2 tubos de agar Sb a temperatura ambiente por 2 a 3 das y conservar a 40 C en refrigeracin.
SSF
PDA
PDA
PDA
Placa control
5 min.
10 min.
15 min.