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AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ALCOHOL

I.

AISLAMIENTO:

Competencias: el estudiante: Asla microorganismos productores de alcohol a partir de sedimentos de cachina y de fruta.

Procedimiento: 1.1. Aislamiento de microorganismos productores alcohol. 1.2. a. Observacin de la muestra: Evaluar las caractersticas organolpticas de la muestra (cachina o fruta).

a. Aislamiento: Para la muestra de fruta: lavar la superficie de la fruta con 20 ml SSF estril utilizando una bolsa de primer uso. Tomar del lavado dos asadas y sembrar por estra y agotamiento sobre placas de agar papa dextrosa (PDA) con cloranfenicol e incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das.

P ara la muestra de cachina: tomar una asada de sedimento y sembrar por estra y agotamiento en placas (PDA) con cloranfenicol e incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das.

Cachina PDA + Cloranfenicol Incubar a To de ambiente x 3 5 das

b. Identificacin. Realizar un estudio macroscpico y microscpico de las colonias presentes en el medio de cultivo (Sabouraud). Repicar las colonias obtenidas en tubos con agar Sabouraud o PDA inclinado por el mtodo de estra. Rotular los tubos e incubarlos a temperatura ambiente por 3 a 5 das. Conservar los cultivos en refrigeracin.

Borde entero Forma ovoide

Identificacin macroscpica

Observacin microscpica

Incubar a T o ambiente 3 5 das Refrigerar Repicar

PDA + cloranfenicol

II. SELECCION: Competencias: Selecciona microorganismos productores de alcohol a partir de colonias que presenten clulas levaduriformes. Conserva las cepas de los microorganismos mejores productoras de alcohol. Procedimiento: 1. Seleccin de microorganismos productores de alcohol. a. Sembrar la levadura aislada, en placa de agar Papa Dextrosa Agar (PDA). Incubar a temperatura ambiente por 2 a 3 das. b. Determinar la concentracin celular de cada cultivo empleando cmara de Newbauer, colocar 3 ml de caldo Sb o SSF estril en la placa, resuspender las clulas y extraer la suspensin a un tubo estril. c. Inocular suficiente suspensin celular para alcanzar una concentracin de 107 o 108cel/ml en 100 ml de mosto de uva con 20 - 25 grados brix, en frascos de fermentacin de 120 ml de capacidad. d. Sellar los sistemas de fermentacin e incubar durante 7 das a temperatura ambiente. e. Determinar la cepa con mayor capacidad de produccin de alcohol en forma indirecta por el consumo de azucares reductores utilizando el refractmetro. f. Repicar la cepa en 2 tubos de agar Sb incubar a temperatura ambiente por 2 a 3 das y conservar a 4 C en refrigeracin

Incubar a To ambiente x 2 3 das

Cepa de levadura aislada

PDA + Cloranfenicol

SSF 3 ml Perlas de vidrio

Sedimento
Azul de metileno 1ml 1ml 1ml

SSF 9ml

SSF 9ml

SSF 9ml

1ml

10

10

10

Inoculo

Determinacin de la concentracin en la cmara Newbauer

RESULTADOS: Determinacin de la concentracin de las levaduras de la cachina X x 25 x 103 x 10 x 104 x d = cel/ml X=8 8 x 25 x 108 = cel/ml 2x1010 cel/ml C1 x V1 = C2 x V2 V1 = C2 x V2 C1 V1 = 108x 100ml 2x1010 V1 = 0.5 ml Determinacin de la concentracin de las levaduras de la fruta X x 25 x 103 x 10 x 104 x d = cel/ml X = 30 30 x 25 x 108 = cel/ml 3x1010 cel/ml C1 x V1 = C2 x V2 V1 = C2 x V2 C1 V1 = 108x 100ml 3x1010 V1 = 0.3 ml

0.5 ml

Incubar durante 7 das

Inoculo de la fruta

Mosto con 24.3 grados Brix

Medicin de los grados Brix

Cuadro de la evaluacin de las levaduras fermentadoras de alcohol


MUESTRA DIA 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CONSUMO ALCOHOL 15.7 9.2 13.2 12.0 11.0 8.6 8.6 23.2 23.0 23.0 22.2 20.0 4.3 2.5 Cachina 24.3 23.6 21.3 19.1 17.2 Fruta 24.3 24.4 24.4 24.6 24.6

MEJORAMIENTO EMPIRICO DE LEVADURAS MEDIENTE EL EMPLEO DE RADIACION ULTRA VIOLETA


1. MATERIALES

- Cmara de luz ultravioleta - Levadura (s) seleccionada (s) por su mayor grado alcohlico. - Solucin salina fisiolgica (NaCl 0.85%) - Mechero - Hisopo estril

2. PROCEDIMIENTO

a. Sembrar la levadura aislada en placa de Agar Papa Dextrosa. Incubar a temperatura ambiente por 2 a 3 das. b. Determinar la concentracin celular de cultivo empleando cmara de Newbauer, colocar 3 ml de calo Sb o SSF estril en placa, resuspender las clulas y extraer la suspensin a un tubo estril. c. Inocular suficiente
7

suspensin
8

celular

para

alcanzar

una

concentracin de 10 0 10 cel/ml en 100 ml de mosto de uva con 200- 250 grados Brix, en frascos de fermentacin de 120 ml de capacidad. d. Sellar los sistemas de fermentacin e incubar durante 7 das a temperatura ambiente. e. Determinar la cepa con mayor capacidad de produccin de alcohol en forma indirecta por el consumo de azucares reductores utilizando el refractmetro. f. Repicar la cepa en 2 tubos de agar Sb a temperatura ambiente por 2 a 3 das y conservar a 40 C en refrigeracin.

SSF

PDA Cepa mejor productora de alcohol Suspensin celular

PDA

PDA

PDA

Placa control

5 min.

10 min.

15 min.

Colocar algodn con alcohol

INCUBAR A TO AMBIENTE POR 72 HORAS SIN LUZ

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