Bactriophages, transduction et conversion lysognique Introduction Les bactriophages ou phages sont des virus infectant les bactries.

Comme tous les virus, ils se caractrisent par la possession d'un seul acide nuclique et par un parasitisme intracellulaire obligatoire. Les bactriophages ont t dcouverts par Frederick Twort en 1915. Cet auteur avait remarqu que des colonies de microcoques prenaient parfois un aspect vitreux, d une destruction des cellules bactriennes, et que cette caractristique tait transmissible des colonies normales par simple contact. En 1917, Flix d'Herelle fit une observation similaire en dcouvrant dans les selles de malades atteints de dysenterie bacillaire un agent infectieux capable de dtruire spcifiquement des cultures de Shigella dysenteriae. Pratiquement toutes les espces bactriennes peuvent tre infectes par des phages spcifiques si bien qu'ils sont prsents dans le sol, dans l'eau, sur les plantes, dans les cavits naturelles de l'homme et des animaux, dans les aliments, etc. Les bactriophages sont considrs comme tant plus nombreux dans la biosphre que n'importe quel autre groupe d'organismes, procaryotes inclus. Comme tous les virus, les phages sont classs en fonction de la nature de leur acide nuclique et de leur structure (type de symtrie, prsence ou absence d'une enveloppe Rplication Un contact phage-bactrie peut donner lieu trois ventualits : . La bactrie rsiste l'infection. Cette rsistance rsulte soit de l'absence de rcepteurs permettant la fixation du phage soit de la prsence d'enzymes de restriction capables de dgrader l'acide nuclique phagique. . Le phage ou uniquement son acide nuclique pntre dans la bactrie et le phage se multiplie l'intrieur de la cellule bactrienne. Le cycle est productif et le phage est qualifi de virulent. Selon les bactriophages, le cycle productif peut ou non conduire une lyse de la bactrie. . Le phage ou uniquement son acide nuclique pntre dans la bactrie et l'acide nuclique phagique s'intgre dans le gnome bactrien o il persiste l'tat latent sous forme de prophage. Le cycle est qualifi de lysognique et le bactriophage est appel phage tempr. tapes prliminaires Les tapes prliminaires, adsorption et pntration, sont communes au cycle productif et au cycle lytique.

La rencontre d'un phage et d'une bactrie se fait au hasard et sa probabilit dpend du nombre de bactries et de phages. Le phage se fixe sur des rcepteurs spcifiques de la bactrie prsents soit sur la paroi (lipo-polysaccharide, protines, acides tchoques), soit sur la membrane cellulaire (bactries appartenant la classe des Mollicutes), soit sur les flagelles, soit sur les pili communs soit sur les pili sexuels. Pour que l'adsorption soit possible, il faut que les rcepteurs phagiques et bactriens prsentent une troite spcificit l'un envers l'autre. Une bactrie n'est donc sensible qu' un nombre limit de phages et un phage n'est capable d'infecter qu'un nombre restreint de bactries. La pntration est variable selon les phages. Certains d'entre eux pntrent en totalit dans la bactrie et l'acide nuclique n'est libr qu'aprs dsintgration de la capside. Pour d'autres bactriophages Cycle productif L'infection de la cellule conduit une rorganisation de l'activit mtabolique et la machinerie cellulaire est dtourne au seul profit des synthses virales. La rplication du phage T4 (Enterobacteria phage T4) nous servira de modle pour la rplication des virus ADN. Ce phage possde un ADN bicatnaire dans lequel l'hydroxymthylcytosine remplace la cytosine. La rplication de l'ADN et la synthse des constituants viraux s'effectuent en quatre phases correspondant aux fonctions hyper-prcoces, aux fonctions prcoces, la rplication de l'ADN phagique et aux fonctions tardives. . Dans une premire tape (fonctions hyper-prcoces), une infime fraction de l'ADN phagique est transcrite par la transcriptase bactrienne, puis elle est traduite pour donner une sous-unit ' qui remplace la sous-unit de la transcriptase bactrienne. . La transcriptase bactrienne ainsi modifie est capable de transcrire environ 20 p. cent du gnome phagique. Cette phase prcoce conduit (i) la synthse d'une dsoxyribonuclase qui clive l'ADN bactrien, (ii) la synthse d'hydroxymthylcytosine qui remplace la cytosine et protge l'ADN phagique de l'action des enzymes de restriction bactriennes et de la dsoxyribonuclase d'origine phagique, (iii) la synthse d'une ADN polymrase ADN dpendante et (iv) la synthse d'une sous-unit '' qui remplace la une sous-unit ' au sein de la transcriptase. . Grce l'action de l'ADN polymrase ADN dpendante l'ADN phagique se rplique. . La transcriptase bactrienne modifie par la sous-unit '' est capable de transcrire environ seul l'acide nuclique pntre dans la cellule.

80 p. cent de l'ADN phagique. Au cours de cette phase tardive, seront synthtiss les protines structurales, des protines d'assemblage et du lysozyme. La phase d'assemblage succde la synthse des protines labores lors de la phase tardive. L'assemblage est un phnomne complexe et il existe trois "chanes de montage" spcialises dans l'assemblage de la tte, de la queue et des fibres. L'encapsidation de l'ADN s'effectue la fin de l'assemblage des capsomres de la tte. Les virions noforms s'accumulent dans le cytoplasme et ils seront librs la suite d'une lyse de la cellule provoque par le lysozyme d'origine phagique. Le cycle productif du phage T4 est donc un cycle lytique. La dure du cycle est d'environ 25 minutes. Aprs adsorption sur les pili sexuels, l'ARN phagique pntre dans le cytoplasme par un mcanisme mal lucid. L'ARN possde quatre gnes : un gne code pour la protine de capside, un gne code pour une protine permettant l'attachement phage-rcepteur, un gne code pour une ARN polymrase ARN dpendante (rplicase) et le quatrime gne code pour une protine responsable de la lyse cellulaire. Durant les premires minutes qui suivent l'infection on assiste une synthse importante de rplicase permettant la formation d'ARN bicatnaires L'assemblage des virions est observ une vingtaine de minutes aprs l'infection et il est suivi d'une phase de libration conscutive la lyse de la cellule. Cycle lysognique Des bactriophages, appartenant tous l'ordre des Caudovirales, sont appels des phages temprs. Ces phages peuvent tablir avec les bactries des rapports de longue dure, ventuellement rversibles, qualifis de lysognie. La bactrie est dite lysogne et le cycle de rplication phagique est appel cycle lysognique. Au cours de la lysognie, l'ADN phagique est intgr au chromosome bactrien sous la forme d'un prophage incapable de se rpliquer de faon autonome. La rplication du prophage est lie celle du chromosome bactrien. La lysognie a t dcouverte avec le phage (Enterobacteria phage ) infectant Escherichia coli. Le phage (famille des Siphoviridae) est constitu d'une tte et d'une queue non contractile. L'ADN phagique est un ADN bicatnaire, linaire, possdant ses extrmits des brins monocatnaires (12 nuclotides), dont les squences en bases sont complmentaires ce qui permet des appariements. Ces squences monocatnaires sont parfois dnommes bouts collants. Aprs la pntration du gnome phagique dans le cytoplasme bactrien, l'ADN phagique se circularise grce l'appariement des bouts collants. Sous forme circulaire, l'ADN du phage s'intgre dans le chromosome bactrien, sans perte de matriel gntique. Cette intgration

fait intervenir le gne int qui code pour une intgrase ainsi que des sites d'attachement (sites att) prsents sur l'ADN phagique (att ) et sur l'ADN bactrien (att B). Le site att B est situ entre les oprons galactose (gal) et biotine (bio). Sous forme intgre, l'ADN phagique ou prophage perd ses capacits de rplication autonome, il se rplique en mme temps que le chromosome bactrien et, lors de la division bactrienne, il est transmis aux cellules filles. Le phage ne s'intgre qu'entre gal et bio, mais d'autres phages, comme le phage P2 (Enterobacteria phage P2, famille des Myoviridae) de Escherichia coli ou le phage P22 (Enterobacteria phage P22, famille des Podoviridae) des salmonelles, peuvent avoir plusieurs sites d'intgration. Le phage Mu-1 (Enterobacteria phage Mu-1, famille des Myoviridae) peut s'intgrer totalement au hasard sur une molcule d'ADN bactrien. La lysognie prsente deux caractristiques : (i) une absence d'expression des gnes phagiques impliqus dans le cycle productif et (ii) une protection vis--vis de l'infection par un phage homologue. Ces deux caractristiques sont lies la prsence d'un rpresseur. Le rpresseur est une protine synthtise par le bactriophage et qui se fixe sur des oprateurs viraux. Ce rpresseur bloque la majorit des fonctions virales et seules quelques fonctions prcoces sont conserves et peuvent s'exprimer dans la bactrie lysogne. Le rpresseur peut tre inactiv et cette inactivation permet l'expression du prophage et conduit un cycle productif analogue celui tudi pour le phage T4. L'induction (ou passage d'un cycle lysognique un cycle productif) peut tre spontane ou induite. L'induction spontane est rare. Selon le phage et la bactrie, elle se produit une frquence variant de 10-2 (toutes les 100 divisions bactriennes) 10-6. La frquence de l'induction est augmente par les rayons UV, les rayons X, l'yprite, l'thylne-imine, des peroxydes organiques, etc. Ces agents inactivent le rpresseur et permettent alors l'expression totale du gnome phagique. Le gne xis permet la synthse d'une excisase qui, associe l'intgrase, inverse son processus et permet une excision. Le prophage est alors libr et le cycle productif peut se drouler normalement. Une modalit particulire d'induction est obtenue en croisant une bactrie Hfr lysogne et une bactrie F- non lysogne. Dans ces conditions, on n'obtient pas de recombinants car les bactries F- sont lyses. En effet, lorsque le prophage de la bactrie Hfr pntre dans la bactrie F-, dpourvue de rpresseur, le prophage s'excise et dclenche un cycle productif. Cette induction provoque par la conjugaison est appele induction zygotique. Le prophage apparat donc comme un gne ltal potentiel, existant l'tat rprim chez une bactrie et transmissible la descendance.

Conversion lysognique Les prophages, intgrs au gnome bactrien, expriment quelques fonctions prcoces susceptibles de modifier les proprits de la bactrie hte. Ce phnomne est connu sous le nom de conversion lysognique. La conversion lysognique peut aussi conduire des modifications antigniques bien connues chez les salmonelles. Ainsi, pour les srovars des groupes O:2, O:4 et O:9 du schma de Kauffmann-White, la spcificit antignique O:1 est li la prsence du prophage P22. La prsence ou l'absence de la spcificit antignique O:1 ne conduit cependant pas un changement de nom du srovar. Par exemple le nom de Typhimurium s'applique des srovars possdant ou non la spcificit O:1. De mme, dans le groupe E1, caractris par les antignes O:3,10, la spcificit antignique O:10 peut devenir O:15 lorsque la bactrie est lysogne pour le phage 15. Une salmonelle possdant la spcificit O:15 peut acqurir la spcificit O:34 lorsqu'elle hberge le phage tempr 34. Transduction La transduction est un transfert de matriel gntique (ADN chromosomique ou extrachromosomique) par des bactriophages dits transducteurs. Compte tenu de l'troite spcificit existant entre les phages et les bactries, ces transferts se font essentiellement entre bactries appartenant une mme espce. La transduction a t dcouverte en 1951 (rsultats publis en 1952) par Zinder et Lederberg chez Salmonella Typhimurium. En 1992, Norton D. Zinder a publi un article fort intressant* relatant la dcouverte de la transduction. Trs schmatiquement, le protocole utilis par Zinder et Lederberg est le suivant : une culture de la souche LT-2 de Salmonella Typhimurium (souche auxotrophe pour l'histidine) et une culture de la souche LT-22 de Salmonella Typhimurium (souche auxotrophe pour le tryptophane) sont places chacune dans une branche d'un tube en U spar la base par une membrane en verre fritt qui interdit tout contact entre les deux souches bactriennes. Des bactries prototrophes sont obtenues une frquence de 10-5. Ces bactries prototrophes appartiennent toujours la souche LT-22 et aucune bactrie de la souche LT-2 ne devient prototrophe. La frquence d'apparition des prototrophes exclut une mutation. La prsence d'un filtre en verre fritt limine la possibilit d'une conjugaison. L'addition de DNase dans le milieu n'inhibe pas l'apparition des prototrophes ce qui exclut une transformation. La seule explication possible tait celle d'un transfert gntique faisant intervenir de l'ADN sous une

forme suffisamment petite pour traverser le verre fritt et sous une forme suffisamment protge pour rsister la DNase. Des tudes complmentaires ont permis de montrer que le transfert tait d au phage P22 et que ce transfert pouvait tre aboli par des anticorps neutralisants Gram positif. Il existe deux types de transduction, une transduction gnralise et une transduction localise, dont les mcanismes reposent sur l'existence des deux types de rplication (cycle productif et cycle lysognique). Transduction gnralise La transduction gnralise est due des phages virulents. Lors du cycle productif, l'ADN bactrien est dtruit par une dsoxyribonuclase d'origine phagique. Au moment de la morphognse, un fragment d'ADN bactrien peut tre encapsid par erreur et venir remplacer l'ADN phagique. La taille du fragment d'ADN bactrien doit tre proche de celle de l'ADN phagique et elle correspond environ 1 pour cent du chromosome. Le phage ayant incorpor de l'ADN bactrien ne peut plus de rpliquer (phage dfectif), mais il peut transfrer de l'ADN bactrien une bactrie rceptrice (les tapes d'adsorption et de pntration ne sont pas modifies chez un phage dfectif). Cette transduction est qualifie de gnralise ou de non spcifique car elle concerne tous les fragments d'ADN (chromosomique ou extra-chromosomique) pourvu que leur taille soit compatible avec une encapsidation. Aprs le transfert d'ADN dans une bactrie rceptrice, deux modalits sont possibles. . Le fragment d'ADN va s'intgrer par recombinaison homologue et toute la descendance de la bactrie rceptrice portera l'ADN transfr. On dit que la transduction est complte. . Le fragment d'ADN reste libre, il ne sera pas rpliqu, mais les gnes transmis sont fonctionnels et peuvent tre exprims. Lors de la multiplication bactrienne, seule une des deux cellules filles acquiert le fragment d'ADN transfr et, au cours des divisions successives, ce fragment sera peu peu dilu. On dit que la transduction est abortive. L'exprience de Zinder et Lederberg s'explique de la manire suivante : La souche LT-22 est lysognise par le phage P22. Occasionnellement, le prophage s'excise et donne naissance un cycle lytique. Les virions noforms passent au travers du filtre et infectent les cellules de la souche LT-2. Pour cette souche, le phage P22 n'est pas lysogne, il se multiplie selon un cycle lytique et certains virions incorporent par erreur le gne permettant dirigs contre le phage P22. Ultrieurement, la transduction a t observe chez de nombreuses bactries Gram ngatif et

l'utilisation du tryptophane. Le passage du filtre en sens inverse permet ces virions dfectifs d'introduire ce gne dans la souche LT-22 qui devient alors prototrophe. Transduction localise La transduction localise est ralise par des phages temprs. Elle ne correspond pas une erreur d'encapsidation mais une excision anormale du prophage. Lorsque le rpresseur est inactiv, un cycle productif succde un cycle lysognique. Dans les conditions normales, l'ADN phagique est excis dans son intgralit. Toutefois, avec une frquence de l'ordre de 10-6, l'excision est anormale et on obtient la libration d'une molcule d'ADN hybride constitue d'un fragment d'ADN phagique et d'un fragment d'ADN bactrien. Ce fragment d'ADN bactrien est adjacent la zone d'intgration du prophage d'o le nom de transduction localise. Dans le cas du phage , seuls les gnes gal ou bio peuvent tre transfrs et la transduction localise est spcifique. Le phage transducteur gal est un phage dfectif, incapable d'initier un cycle productif. Le phage transducteur bio ne peut plus accomplir un cycle lysognique, mais il reste capable de donner un cycle productif. Lorsque le phage possde plusieurs sites d'intgration (Enterobacteria phage P2, Enterobacteria phage P22, ...) la transduction localise devient non spcifique. Avec le phage Mu-1, qui peut s'intgrer totalement au hasard sur une molcule d'ADN bactrien, de nombreux gnes bactriens peuvent tre transfrs et la transduction localise a des allures de transduction gnralise. Gntique molculaire Depuis longtemps, les phages sont utiliss comme vecteurs et amplificateurs de gnes. Des fragments d'ADN de sources diverses peuvent tre intgrs dans le gnome d'un bactriophage soit par insertion simple soit par dltion-remplacement. Les bactriophages ont ainsi permis l'obtention de banques d'ADN. Plus rcemment, des phages filamenteux ADN monocatnaire circulaire sont utiliss pour prsenter leur surface, en fusion avec le domaine amino-terminal de leurs protines, des molcules telles que des peptides, des fragments d'anticorps ou d'autres protines. Cette technique (phage display) prsente de multiples applications, mais son tude dborde du cadre de cette tude.