ESTABLECIMIENTO DE AJO MORADO (Allium sativum) cv. Morado Arequipeo IN VITRO CON INTERACCIN BAP-ANA.

1. INTRODUCCION: El ajo (Allium sativum L.) es una planta herbcea constituida por un bulbo subterrneo, formado por "dientes" unidos en su base alrededor del tallo verdadero y recubiertos por catfilos blancos o morados, cuya tonalidad vara segn la variedad y la altura del sitio de siembra (Ramos, 1991). Las hojas son alargadas, planas y envainadoras; las flores de color rosado o verde y no producen semillas. El falso tallo es blando, liso y de hasta 40 cm de longitud, de donde nacen bulbillos areos. El sistema radical consta de numerosas races adventicias simples, delgadas y poco ramificadas que crecen superficiales en el suelo. Las especies de este gnero presentan el mismo patrn bsico de crecimiento apical, tanto en la raz como en el tallo y la frecuencia de ramificacin del brote apical vara con la especie, el cultivar y las condiciones de crecimiento (Brewster, 1994). Las diversas metodologas tradicionales utilizadas para los estudios histolgicos, han contribuido significativamente en la comprensin de la formacin de nuevos individuos propagados por cultivo in vitro, ya que permiten observar los cambios morfolgicos y anatmicos que ocurren en el tejido experimental. Adems, proveen ideas de los procesos celulares que permiten proponer hiptesis para futuras investigaciones (Yeung, 1999). Los procesos morfogenticos en los cuales se logra la propagacin in vitro son variables y dependen principalmente de la relacin auxina/ citoquinina (Him y Pez de Csares, 1998). Considerando que el desarrollo de brotes in vitro tiene alguna variacin epigentica, es conveniente realizar estudios histolgicos para conocer el origen de los rganos regenerados y tambin observar los diferentes cambios anatmicos que ocurren durante la organognesis (Valverde et al., 1992). Ayabe y Sumi (1998) realizaron estudios histolgicos de tallo de ajo y observaron que el desarrollo del brote estaba dividido en cuatro etapas: expansin de la zona rodeada por la parte basal de los primordios foliares, formacin de las yemas axilares en forma de domo, diferenciacin de la yema directamente de cada domo y el desarrollo del brote. Estos mismos autores sealaron que la formacin celular interna y del domo fue similar a la del pice caulinar.

2. JUSTIFICACION: De los cultivos de Alliaceae, el ajo (Allium sativum L.) es considerado como una especie valiosa por muchas culturas diferentes. Adems de su conocida utilizacin en el arte culinario, hoy es un producto apreciado por sus beneficios medicinales, especialmente en Europa y Asia. Algunos de sus productos derivados, poseen actividades biolgicas tales como antibiticas, antiparasitario, reductores de riesgo de enfermedades cardiovasculares y como potenciales agentes anticancergenos. El ajo uno de los principales cultivos de Arequipa, pero con problemas de enfermedades las cuales dificultan la exportacin; adems las exigencias cada vez mayores del mercado y la aparicin permanente de nuevos competidores y megacentros (Plaza Vea, Wong, Tottus, etc.) obligan a replantear las estrategias de produccin local.

Entre las enfermedades que afectan a este cultivo, los virus son los responsables de las mayores prdidas (entre un 20 y 80% de disminucin en el peso de los bulbos). Las infecciones son causadas por un complejo viral que incluye Potyvirus (Onion yellow dwarf virus, OYDV, y Leek yellow stripe virus, LYSV); Carlavirus (Garlic common latent virus, GCLV y Shallot lantent virus, SLV), y Allexivirus (Garlic virus-A, -B, -C, -D, -E, -X, GarV-A B C- D- E -X; Garlic mite-borne filamentous virus, GarMbFV). Este conjunto causa un mosaico que si bien no mata la planta produce una infeccin crnica. Debido a la exclusiva propagacin agmica de esta especie, la totalidad de las plantas estn infectadas por virus, por lo tanto es evidente la importancia que tiene la obtencin de propgulo libre de virus como salida de control. En Argentina se ha detectado la presencia de OYDV y LYSV, GCLV, GarMbFV, GarV-C y otros Allexivirus todava no caracterizados completamente.

3. OBJETIVOS: 3.1. Objetivos generales: Establecer el cultivo in Vitro de Allium sativum a partir de brotes de dientes de ajo. Determinar el efecto de los reguladores de crecimiento: interaccin BAP-ANA, en el cultivo in Vitro de ajo.

3.2. Objetivos especficos: A travs de la micropropagacin obtener plantas completamente idnticas. Determinar la dosis adecuada para la proliferacin del brote de dientes de ajo.

4. LOCALIZACIN: Se localiza en el laboratorio de biotecnologa de la Escuela Profesional de Agronoma de la Universidad nacional de San Agustn.

5. ANTECEDENTES: Mujica, Sanabria, Mogolln; 2008: primeros indicios de bulbificacin in vitro se observaron a partir del da siete, caracterizndose por el engrosamiento de la base de las hojas envainadoras y el cambio en la intensidad de la coloracin, a medida que el bulbo fue desarrollndose. A los 21 das de haberse iniciado el proceso de bulbificacin in vitro del ajo, se observ la formacin de los "dientes" a partir de las yemas ubicadas en las axilas de las hojas envainadoras. Conci, Vilma, Cafrune; 2005: Trabajos realizados en la Argentina se ensayaron tratamientos de termoterapia con agua y con aire caliente, antes de la extraccin del meristema. Los mejores resultados se obtuvieron con aire caliente. Para ello dientes de ajo fueron sembrados en terrinas con una mezcla de tierra/ mantillo/arena (1/1/1) y mantenidos en una cmara a 36C. Cuando plantas de ajo Blanco fueron sometidas 60 das a 36C y luego se hizo el cultivo de meristema, se regeneraron pocas plantas, pero las que

se obtuvieron resultaron libres de virus. Cuando se probaron 5 cultivares de ajo durante 40 das a 36C se pudo observar valores de supervivencia del cultivo de meristema que variaron entre 40 y 82%, resultando libres de virus entre 30 y 100% de las plantas obtenidas, dependiendo del cultivar. Los controles en los cuales se obtuvieron plantas slo por cultivo de meristema, sin termoterapia, el porcentaje de plantas desarrolladas vari entre 70 y 100%, y de ellas, en algunos cultivares, no se obtuvieron plantas libres de virus y en otros lleg hasta el 21%.

6. HIPOTESIS: Con la micropropagacin in Vitro a travs de brotes de ajo morado daremos una buena solucin y/o alternativa para obtener bulbos con mejor vigor y condicin para su posterior siembra en campo definitivo y as poder aumentar el rendimiento de la especie. Se espera llegar a un brotamiento directo sin pasar por el callo para evitar la variacin y que el crecimiento se d en 30 das, con soluciones ricas en citoquininas y en menor concentracin de auxinas.

7. MATERIALES Y METODOS: 7.1. Materiales: Bulbos de ajo morado (Allium sativum L.) estos bulbos deben ser disgregados en sus respectivos "dientes" y se mantienen bajo refrigeracin (8 a 10C) durante 15 das para estimular el proceso de regulacin. Bistur, papel aluminio y ligas Algodn Pinzas Alcohol, leja Agua destilada Autoclave Medio MS Tubos de ensayo

7.2. Mtodos y clculos: Propagacin in vitro en un medio MS Se realizaran 9 tratamientos con 4 repeticiones cada repeticin en con 10 ml de solucin; tubos de ensayo (25 x 150 mm)

Clculos del medio MS: 9 tratamientos a 4 repeticiones = 36 tubos de ensayo a 10 ml= 360 ml.

BAP ANA

2 M 0.5/2 1/2 1.5/2

4 M 0.5/4 1/4 1.5/4

6 M 0.5/6 1/6 1.5/6

0.5 M 1 M 1.5 M

360 ml

BAP
2 M (A) 4 M (B) 6 M (C)

120 ml

120 ml

120 ml

ANA
0.5 M (A) 1 M (B) 1.5 M (C) 0.5 M (D) 1 M (E) 1.5 M (F) 0.5 M (G) 1 M (H) 1.5 M (I)

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

Stock A: 1000 ml ----------------- 100 ml 160 ml ------------------- X X= 16 ml Stock B, C, D: 1000 ml ----------------- 50 ml 160 ml ------------------- X X= 8 ml Stock E: 1000 ml ----------------- 4 ml 160 ml ------------------- X X= 0.64 ml

Agar:

1000 ml ----------------- 6 gr 160 ml ------------------- X X= 0.96 gr

Azcar:

1000 ml ----------------- 30 gr 160 ml ------------------- X X= 4.8gr

BAP A: C1 V1 = C2 V2 1000 M (X) = (2) (80 ml) X= 0.16 ml 1000 M (X) = (4) (80 ml) X= 0.32 ml 1000 M (X) = (6) (80 ml) X= 0.48 ml

B: C

ANA A: B: C: D: E 1000 M (X) = (0.5) (40 ml) X= 0.02 ml 1000 M (X) = (1) (40 ml) X= 0.04 ml 1000 M (X) = (0.5) (40 ml) X= 0.02 ml 1000 M (X) = (1) (40 ml) X= 0.04 ml 1000 M (X) = (1.5) (40 ml) X= 0.06 ml

8. PROCEDIMIENTOS: Desinfeccin de la cmara de siembra con alcohol y dejar el mechero prendido por unos minutos e iniciar el proceso de extraccin y siembra. Para la extraccin del meristemo se corta un trozo de tejido en forma cbica, incluyendo el disco basal donde est el meristemo. Este se desinfecta mediante un lavado con agua corriente luego en alcohol 70% por 30 segundos Lavar con hipoclorito de Na al 5 % durante 5 min. Y enjuagar con agua destilada 3 veces. Posteriormente, el trozo de tejido es colocado sobre papel estril bajo un estereoscpio dentro de una cmara de flujo laminar y con la ayuda de instrumental estril se procede a

la extraccin del explante constituido por el domo ms 2 primordios foliares (0,3 mm aproximadamente). Luego de la escisin sembrar en el medio de iniciacin donde se desarrollar una planta completa Repetir el procedimiento con todos los frascos etiquetndolos y mantenindolos en evaluacin.

9. PARAMETROS A EVALUAR: Sobrevivencia de explantes. Fenolizacion. Brotes. Contaminacin de frascos. Morfognesis.

10. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES:

Semanas Actividades 1 2 3 4 5 6

Bsqueda de informacin y antecedentes bibliogrficos.

Llevar

los

ajos

la

x x

refrigeradora (8C)

Preparacin del medio

Extraccin del explante

x x x

Desinfeccin del explante

Instalacin del explante

Evaluaciones

x
de informe

x x

Elaboracin final

11. BIBLIOGRAFIA: Ayabe, M. y S. Sumi. 1998. Establishment of a novel culture method, stemdisc culture, and its practical application to micropropagation of garlic (Allium sativum L.). H. Mujica, M.E. Sanabria, N. Mogolln y Y. Perozo. 2008. Formacin in vitro del bulbo del ajo morado (Allium sativum L.)- Universidad Pedaggica Experimental "Libertador", Instituto Pedaggicode Barquisimeto; Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado". CANAVELLI, A; NOME, S. F. y CONCI, V. C. 1998. Incidencia de las virosis en ajo Rosado Paraguayo. Fitopatologa Brasilera CONCI, V.C. 1997. Virus y Fitoplasmas de ajo. In Burba, J. L. 50 temas sobre produccin de ajo. Vol. 3: 267-293. EEA-INTA La Consulta, Mendoza, Argentina. CONCI, V.C. y NOME, S.F. 1991. Virus free garlic (Allium sativum L) plants obtained by thermotherapy and meristem tip culture. J. Phytopathology 132: 189-192.