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BIOTECNOLOGA MOLECULAR Y CELULAR

Transgenic Arabidopsis Plants Expressing the Type 1 Inositol 5Phosphatase Exhibit Increased Drought Tolerance and Altered Abscisic Acid Signaling

INSTRUCTOR DEL CURSO DR. RAYMUNDO ROSAS QUIJANO

NOMBRE DEL ALUMNO: LOURDES VITAL LPEZ

Reynosa, Tamaulipas a 31 de Octubre del 2011

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Transgenic Arabidopsis Plants Expressing the Type 1 Inositol 5-Phosphatase Exhibit Increased Drought Tolerance and Altered Abscisic Acid Signaling

Introduccin
Los fosfolpidos estn asociados a la membrana y a los fosfatos inositol soluble, conocidos colectivamente como los fosfoinostidos, se ubican en las clulas eucariotas y estn involucrados en la regulacin de una multitud de funciones celulares. En respuesta a un estmulo, tal como estrs hiperosmtico, PtdInsP2 es hidrolizado por la fosfolipasa C (PLC) para producir los segundos mensajeros inositol soluble 1, 4,5-trifosfato (InsP3) y diacilglicerol .Los fosfolpidos son ideales para mediar en la sealizacin celular, debido a su alta tasa de rotacin y su distribucin espacial, que est regulado en parte por la accin concertada de los fosfoinostidos especficos quinasas, fosfolipasas, fosfatasas y la va fosfoinositida integra la deteccin de la membrana plasmtica con intracelular sealizacin y proporciona as un medio de ambos sensores y la propagacin de una seal. Se ha demostrado que InsP3 puede desencadenar la liberacin de Ca2+ desde los depsitos intracelulares como la vacuola.InsP3 est implicado en la propagacin de Ca2+ oscilaciones en las clulas guarda y clulas de la raz del cabello, en la comunicacin de clula a clula, y en la regulacin del Ca 2+ diurna fluctuaciones. Con el fin de manipular la va de los fosfoinostidos de plantas y comprender los efectores rio abajo de sealizacin mediada InsP3, se generaron plantas transgnicas que expresan constitutivamente el polifosfato inositol 5-fosfatasa (InsP-5-ptase) de tipo mamfero, una enzima que hidroliza especficamente el inositol fosfato soluble y InsP3 tetracisfosfato inositol (InsP4) y no los fosfolpidos de inositol. Se elegi esta enzima heterloga por varias razones. La hiptesis en este trabajo es que el aumento inducido por estmulos en InsP3 y InsP3 mediador, por las cascadas de sealizacin se ve afectada en plantas transgnicas y por lo tanto el tiempo y/o magnitud de la respuesta se retrasa o disminuye. Adems, se utiliz el InsP 5-ptase para diseccionar la funcin de InsP3 de planta de sequa. El cido abscsico (ABA) es un mediador principal de la respuesta de las plantas a estrs abitico, tales como la sequa, la sal, y el fro. En el estrs por sequa respuesta, ABA acta en varios niveles celulares, incluyendo la regulacin de la apertura de los estomas y la activacin de la expresin gnica. Muchos segundos mensajeros, incluyendo a Ca2+, InsP3, CADP ribosa, y otros, estn implicados en la sealizacin mediada por ABA. Adems, no hay interferencia entre ambos de ABA dependiente y ABAindependiente. Las vas de participacin de otros que responden a la sequa son factores tales como DREB2A y ERD1.

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La expresin ectpica de la planta endgena del gen InsP 5 ptase tambin ha revelado diferencias en las respuestas ABA en comparacin con el tipo salvaje. Estomas de las plantas transgnicas que sobreexpresan Arabidopsis InsP 5ptase, At5PTasa1, se mostraron menos abierta que la de tipo salvaje y menos sensible a la ABA, con la induccin de retraso de la respuesta del gen de expresin ABA. La induccin de genes de respuesta a ABA tambin fue atenuada en plantas transgnicas que expresan otra Arabidopsis fosfatasa inositol, At5PTase2. Con base en nuestras predicciones y el trabajo por los dems (que se describe arriba), se espera que el InsP 5 ptase en plantas transgnicas sea menos tolerante a la sequa e incapaz de soportar prolongado estrs hdrico. En esta investigacin se muestra que las clulas de las plantas transgnicas muestran la sensibilidad diferencial de ABA exgeno en comparacin con plantas silvestres que en los bioensayos para controlar la apertura de estomas y cierre. Adems, con la sequa, los niveles de la ABA en las plantas transgnicas no aumentan tanto como en la de tipo silvestre. Una clave para entender el fenotipo de tolerancia a la sequa es el aumento de ms del doble en los niveles de transcripcin basal de la sequa inducida por ABA-independiente del factor de transcripcin DREB2A y un subconjunto de DREB2A genes reguladores en la tona de plantas transgnicas. Estos resultados sugieren que InsP3 acta como un regulador negativo de la va de sealizacin DREB2A para la sequa y que en ausencia de InsP3, compensa sta y otras vas que se han activado en las plantas transgnicas, lo que lleva a una mayor tolerancia a la sequa.

Mtodos:
Material vegetal y condiciones de crecimiento Tipo salvaje (ecotipo Columbia) y plantas transgnicas INSP 5 ptase de Arabidopsis thaliana, se cultivaron en una cmara de crecimiento bajo condiciones de das cortos de 8 horas en luz y 16 horas de oscuridad a 21 oC con una intensidad de aproximadamente 150mol/m2s. Medida de prdida de agua y estrs sequa: la prdida de agua es totalmente prdida de tamao comparable, peso y desarrollo que fueron exceso de las rosetas bien hidratadas tipo silvestre y plantas silvestres. Despus de las medidas de prdida de agua, el rea de superficie de salidas fue medida utilizando un rea metro de LI 3100 (Li-Cor). RWC fue medida como fue descrito utilizando 6 semanas de plantas viejas sobre un periodo de 8 das sin el agua en una cmara con una humedad relativa del 30%. El valor promedio por separado por lnea de plantas est indicado a cada punto de tiempo.

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Bioensayos de estomas: Cscara epidermales fueron tratadas de la superficie abaxial o tipo silvestre y dejado en solucin buffer como esta descrito por Roelfsema y Prins. Estas fueron observadas directamente o incubadas en la luz por 3 horas. Para el tratamiento Ca2+, las cascaras fueron incubadas por 3 horas en la luz en la solucin buffer descrita (0.1 mM Ca2+) o en este buffer con adicionar Ca2+ o con 1 mM Ca2+. Ensayos de germinacin de semillas: En placas conteniendo un papel filtro en agua diferentes concentraciones de ABA como se describe Weigel et-al. La germinacin fue de cotiledones verdes a 3-4 dias despus del plaqueo. Medidas ABA y anlisis de Azcar: Los niveles de azcar fueron convertidas a trimetilsilil derivadas, y cromatografa de gas- espectro de masa fue diseado utilizando una cromatografa ultra gas thermotrace GC acoplado a un espectrofotmetro de masa termo DSQ II. Los datos presentados son promedios de las tres replicaciones independientes biolgicos. Estudios de marcaje con [3H] Inositol: Las placas fueron incubadas en un crecimiento en una cmara bajo condiciones de das largos con rotacin dulce aeracin para 4 a 5 das. Las especies fosfato inositol fueron identificados basados en la coelucin de varios estndares. Ensayos Ins1P3: La epidermis de la cscara fueron preparados como describe y solucin buffer de incubacin en luz. Despus de 2 horas, cscaras fueron inmediatamente congelados y molidos en un contenido nitrgeno lquido y ensayado por trifosfato-Ins-1, 4,5 utilizando el receptor de vinculacin. se las de kit

Medicin de Aequorin: Las plantas transgnicas que expresaran Aequorin fueron seleccionadas por RTPCR, fueron mantenidas hasta la generacin T3 y T4. Se implement un control de expresin y InsP-ptasa, y extractos, los cuales fueron seleccionados para luminiscencia de Aequorin, mediante una reconstruccin in vitro. Como una medida de estimulacin, las semillas de control, fueron incubadas en la oscuridad con un agitamiento suave. La luminiscencia fue monitoreada a intervalos de 0.2 s y convertida a concentraciones de Ca. Para la estimulacin fra, se inyecto agua fra a ~10 s seguidas de Ca, descargada a 70 s. En los tratamientos de ABA, se procedi a una inyeccin a ~10 S seguidas de una descarga de 70 s. Anlisis de micro arreglos: para los anlisis de micro arreglos, las muestras fueron recolectadas en el da 0 al da 7 del tiempo RWC, y congeladas en Nitrgeno Lquido. Se realiz tres duplicados para la especie nativa y de las dos lneas transgnicas (T6 y T8), as como tambin dos replicaciones del vector de control (C2), El RNA fue asilado utilizando el kit de Quiagen RNeasy de plantas, y una tarjeta de cRNA biotinada, que fue sintetizada usando en dos ciclos del protocolo Affymetrix. Los arreglos de Arabidopsis se analizaron mediante el uso del software GCOOS. Anlisis estadstico de los datos de micro arreglos: para dos grupos de anlisis, se estim una seal de cada trascripto, el cual fue calculado basado en Centro de Biotecnologa Genmica

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algoritmo de Micro Arrays suite 5.0 (Afflymetrix). La determinacin diferencial de expresin fue determinada utilizando una implementacin de pruebas de permutacin descritas por la pgina Expression Analysis. Di, fue calculada para cada uno de los trascriptos se compararon grupos, y su diferencia fue computada entre Di y su promedio o en orden con su t-statistic esperado de la referencia de distribucin. Aislamiento de RNA, RTPC y q RT-PCR: el RNA fue asilado de las hojas, utilizando el kit de Quiagen RNeasy mini kit, con una columna de tratamiento libre de RNasa y DNasa. La primera hebra de cDNA fue sintetizada utilizando de RNA total usando el kit de Stratagen, Stratascript y primers al azar. Para RT-PCR, el cDNA fue amplificado usando Hot Start Taq Polimerasa y primers especficos para el gen. Los primers especficos del gen, fueron diseados con la ayuda de AtRTprimer, una base de datos para la generacin de primers especficos de RT-PCR. Los niveles de trascripto fueron estandarizados basados en la amplificacin de cDNA, de la referencia de genes como ACTIN2/8 y UBIQUITIN10.

Despus de 12 das sin agua, la de tipo salvaje las plantas y las plantas de la lnea de control de vectores se ablanden y se pongan marrones, mientras que las plantas de tres I independientes de InsP 5-ptase las lneas se mantienen verdes e inflados (figura 1a). Las plantas transgnicos muestran una disminucin del 30% en la tasa de prdida de agua de hojas sueltas en comparacin con las plantas de tipo salvaje (Figura 1b).

Resultados:

Durante este perodo de tiempo, las plantas transgnicas pierde menos agua durante el una la noche (figura 1c). El grado y El InsP 5 ptase de plantas muestrada y mayor tolerancia a la sequade crecimiento de las races y la pierden menos agua en comparacin con Plantas silvestres. masa de races entre plantas silvestres y transgnicos como ase sequa. Cuando el observa en el En este trabajo, se estudi la respuesta de plantas transgnicas la extremo el experimento fue comparable, agua es retenida, las plantas transgnicas son capaces de soportar las condiciones de descarta la posibilidad de que el agua sequa ms que las plantas de tipo salvaje. reduce la prdida de la plantas transgnicas fue causado por la retencin de agua debido a la mayor diferencial de crecimiento de las races. La conducta estomtica fue comparable entre las dos lneas independientes de plantas transgnicas y la de tipo silvestre y las plantas de control de vectores (figura 1d). Estos resultados demuestran que las plantas transgnicas son tolerantes a condiciones de sequa y bajo condiciones

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Figura 1.- Prdida de agua el InsP 5-ptase en plantas transgnicas y ms sequa tolerante comparada con una planta silvestre.

Las clulas guardianas transgnicas muestran respuestas alteradas a ABA.

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La apertura de los estomas fue monitoreada inmediatamente despus de pelar o despus de la incubacin bajo condiciones de oscuridad o luz durante 3 horas (figura 2a). No hubo diferencias en la apertura de estomas entre las de tipo salvaje y las plantas transgnicas bajo estas condiciones. Adems se monitoreo la respuesta de las clulas de guarda bajo alta concentracin de ca2+ y aba. Las clulas transgnicas eran menos sensibles al cierre en presencia de 1 mm de ca2+ en comparacin con el tipo salvaje (figura 2b). Para la respuesta a ABA, se midieron tanto la promocin de cierre de los estomas, donde las cscaras epidrmicas fueron incubadas primero en luz y luego tratados con ABA (figura 2c), y la inhibicin de la de apertura de Figura 2.- Las plantas de la InsP 5-ptase muestra una respuesta los estomas, donde las cscaras epidrmica fueron preparadas a partir de alterado responde al Ca2+ y bioensayos en estomtico ABA. plantas que se incubaron en la oscuridad y luego tratados con luz o con aba en Los niveles de insp3 aumentaron presencia de luz (figura 2d). Sin embargo, rpidamente luz la pulverizacin y ABA en presencia de con no pudo inhibir la apertura de los despus de las clulas Las otra vez estomas en 30 min. transgnicas, mientras rociadas con agua que plantas fueron que en las clulas de tipo silvestre la apertura de fuertemente contiene 0,1% fuer etanol como

disolvente control (figura 3a, la lnea de puntos negro). Los niveles de insp3 se redujeron significativamente en las plantas transgnicas y mostr un aumento apreciable en el curso del tiempo despus de la fumigacin con aba o disolvente de control (figura 3, slido lneas grises y puntos). Tambin se monitoreo la expresin de genes de respuesta a ABA despus del tratamiento con ABA y no se detect ningn deterioro en la induccin de los genes de respuesta a aba en las lneas transgnicas en comparacin con el tipo salvaje (figura 3b).expresin de varios genes de respuesta a ABA, incluyendo rab18, kin2 y cor15a, fue inducida por igual (si no mejor), sin demora en la tiempo en las plantas Respuesta de la planta completa a ABA. transgnicas en comparacin con el tipo salvaje. Estos resultados indican que un aumento de onsp3 mediada por ABA es no es esencial para la induccin de estos genes que responden a ABA. Tambin se monitoreo la respuesta de germinacin de las semillas de las

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Figura 3.- Cambios en InsP3 y Gen de expresin en respuesta a exgenos ABA.

Cambios en el metabolismo Inositol fosfato. Centro de Biotecnologa Genmica

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Se estableci a determinar el impacto del aumento de la hidrlisis de insp3 en la biosntesis del inositol fosfato y, en particular, insp6. Plntulas de arabidopsis fueron marcadas con [3h] inositol de 3 a 4 y el inositol fosfatos solubles fue extrado y analizado por intercambio de aniones por HPLC. Las etiquetas de [3h] inositol resultaron de plntulas enteras (figura 4a) o cscaras de la epidermis (figura 4b) muestran alteracin de los niveles de [3h] inositol fosfatos en las lneas transgnicas en comparacin con el tipo salvaje. En las plntulas transgnicas, consistente con el incremento de la hidrlisis de insp3, los niveles fueron de insp2 fueron ligeramente incrementados mientras que los niveles total de ismeros insp3 se redujeron. Los niveles de los ismeros total es de insp5 tambin disminuyeron. Por el contrario los niveles de InsP6 fueron fcilmente detectadas y se redujeron en plantas transgnicas (en un 25%) y las cscaras (en un 50%) comparadas con el
Figura 4.- InsP6 es reducido en InsP 5-ptase semillas y epidermis de la cscara comparada con el tipo silvestre de plantas. a) Perfiles inositolfosfato de plntulas de una semana de edad marcados por 4 D y analizados por cronofotografa cambio de anin.

b)

Perfiles de inositolfosfato marcados por 18 horas los datos.

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La aparicin de la escasez de agua se retrasa en las plantas transgnicas.

Para caracterizar la respuesta a la sequa, se supervis el contenido relativo de agua (CRA) de las hojas de tipo silvestre y transgnicos durante un perodo de deshidratacin. Para estos experimentos, se regaron muy bien las plantas de tamao similar y madurez (~6 semanas de edad) se mantuvieron en una cmara de crecimiento bajo condiciones de das cortos a una humedad relativa del 30%. CRA se midi en el da 0 (bien regada) y durante un perodo de 8dias sin agua. Un CRA de <60% se considera un grave estrs hdrico. Como se observa en la Figura 5, las lneas transgnicas mantienen un CRA de> 85% durante ms tiempo que el tipo silvestre. Tambin se controlaron los niveles de ABA en las plantas durante el transcurso del tiempo CRA. Los niveles de ABA se midieron en muestras de hojas cosechadas en el da 0 y en los das 7 y 8 (Figura 5B). En el da 0, los niveles de ABA fueron igualmente bajos en todas las lneas de la planta (ver Figura 3 en lnea de consulta). A medida que el estrs de sequa avanz haba la disminucin de CRA, el nivel de ABA aumento en las lneas tanto de tipo Figura 5. Las plantas INSP5/PTASE mantienen contenidos salvaje y transgnicos. Sin embargo, los niveles de relativamente altos de agua y bajos niveles de agua ABA siempre se mantuvo por debajo de las plantas comparados con el tipo silvestre durante la estere hdrica. transgnicas en comparacin con el tipo salvaje a) Los niveles de CRA fueron medidos en el inclusosobreuna CRA del 60%. El ms alto CRA y el da 0 y en un periodo de 8 das sin agua, cada punto en el ms pequeo de los niveles de ABA, fue en ambos tiempo representa el promedio del valor de 10 plantas separadas das 7 y 8 con un rgimen sin riego (Figura 5) por lnea. indican que las plantas transgnicas se obtienen la b) Los niveles de ABA fueron medidos en muestras de das menor sequa que los controles de tipo salvaje. En 0, 7 y 8 de tres experimentos independientes. algunos ensayos, las plantas se volvieron a regar el da 8. La recuperacin ms rpida es tambin evidente por los patrones de expresin de

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Anlisis de microarreglos en los cambios de la transcripcin con dficit hdrico.

Tres replicas biolgicas fueron realizadas con el tipo salvaje y 2 lneas de transgnico independiente (T6 y T8). Dos replicas biolgicas de la lnea del control (C2) donde se localiza como un control adicional. El perfil del transcripto fue localizado usando la serie de Arabidopsis ATH1 (Affymetrix). Un arreglo de hibridacin, la adquisicin de datos y el anlisis fueron realizados por anlisis de expresin de Durham, NC, utilizando la estacin de fluidos Affymetrix y el software GCOS. Como indica en la figura 6A, dos grupos de comparaciones fueron realizados en un orden para determinar cualquier diferencia en el perfil de expresin entre el basal (0) y la tensin de la sequa del tipo silvestre y las lneas
Figura 6 Esquema del experimento de micro arroyos y confirmacin de perfiles de trascripcin usando qRT-PCR. a) El esquema muestra el control (cero) y muestras de estrs hdrico (D) analizadas por micro arroyos y la comparacin que fue presentadas entre muestras. b) Para (D) qRT-PCR de trascripcin seleccionados para validar el resultado de los arreglos. b) Trascriptos seleccionados muestran la regulacin negativa BASAL en lneas transgnica comparadas con tipo silvestre y vector control. c) Trascriptos seleccionados muestran la regulacin positiva BASAL en lneas transgnica comparadas con tipo silvestre y vector control. d) Trascriptos seleccionados estn regulados positivamente por el estrs hdrico por el tipo silvestre y el vector control que estn significativamente con las plantas transgnicas.

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Comparacin del perfil de expresin basal

Las plantas transgnicas no muestran diferencias morfolgicas evidentes o de desarrollo comparadas con las plantas salvajes. Bajo condiciones de crecimiento normal. Consistente con este resultado, nicamente una pequea fraccin de transcriptos mostrados alteraron la expresin basal en las lneas transgnicas comparada con las de tipo silvestre y el vector control (<0.4% del trascripto). Hubo ms genes reguladores negativos (62 trascriptos) que positivos (20 transcriptos) en la lnea transgnica. De los reguladores negativos el 18% cay en la categora de defensa, incluyendo varios genes relacionados con la patognesis (PR-1, PR-2, y PR5). Un segundo grupo distintivo de genes reguladores positivos (11%) representan protenas involucradas con en puentes de Ca2+ y transporte y plegamiento de protenas incluyendo CRT3 y BiP3 (tablas 2). Estos reguladores negativos pueden ser indicadores de que la InsP3. Figura 7. El InsP-5 ptase de las plantas muestra una respuesta atenuada Almacenadores de Ca2+ esta Ca2+ respuesta a estmulos de sal o fro. subutilizada en la InsP3. Inversamente a) Control Aequorin-expresin (tipo silvestre) y planta de semillero en clulas de tabaco expresa la alta InsP 5-ptase (Tr) fueron tratados con NaCl, y luminuscencia fue medida en actividad humana PtdlnsP kinasa I Un Luminometro. b) Un experimento similar en el cual la planta de semillero (que tiene niveles basales 50 veces fue tratado con hielo-agua fra. ms de plegamiento que en el tipo silvestre), detectamos una regulacin positiva del retculo endoplasmatico de puentes Ca2+ en protenas , que presumiblemente mantienen un alta

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Comparacin de perfiles sequa.

expresin en respuesta a

estrs de

Se generaron cuatro formas de diagramas Venn usando la lista de reguladores positivos y negativo en cada lnea de planta y determinar el comn y nico modelo de expresin entre el tipo silvestre y lnea transgnica en respuesta al estrs hdrico. La lista generada de comparacin VENN fue tambin revisada para la superposicin entre el tipo silvestre/C2 nicamente y grupos transgnicos (para genes que mostraron gran similitud que los dos de regulacin positiva o negativa con altos valores de P) para generar la lista de genes de regulacin positiva o negativa tambin el tipo silvestre y el vector control nicamente o lneas transgnicas. Interesante fue un gran nmero de genes regulados positivamente o regulado en el grupo de tipo silvestre/C2 que en la lnea transgnica, que pueden ser un reflejo de niveles de percepcin de estrs para ambas regulaciones fueron entre 500 a 200 genes que tambin estuvieron regulados positivos o negativos con la sequa en las 4 lneas de plantas privadas. Hubo 244 trascriptos que fueron exclusivamente de regulacin positiva con el estrs hdrico en el tipo silvestre y el control vector. Por el contrario fueron nicamente 4 genes que estuvieron nicamente regulados positivamente en las lneas transgnicas con sequa. En las lneas transgnicas hubo nicamente 22 genes regulados negativamente con sequa. Estas son predicaciones que codifican protenas desconocidas (25%). La sealizacin de InsP3 mediada por Ca2+ es atenuada en las plantas transgnicas Los autores predijeron que si la InsP3 est involucrado en la mediacin una seal de estrs inducida por Ca2, entonces las plantas transgnicas de sealizacin podran ser afectada por la sealizacin de Ca2+ en respuesta al estrs. Con el fin de probar esta hiptesis, se nosotros generamos plantas transgnicas que expresan el Ca2+ vinculante Aequorin fotoprotena. Dos lneas de control de expresin Aequorin independientes y dos Aequorin independientes que expresan lneas InsP 5 ptase fueron seleccionadas y probadas en respuesta de Ca2 +. Las plntulas fueron incubadas en el sustrato coelenterazina y luego se somete a una sal o un estmulo fro (mediante la inyeccin de 250 mM de NaCl o agua helada), y la luminiscencia se midi en un luminmetro. Las cuentas de luminuscencia se recogieron cada 0,2 s y se convierte en la concentracin de Ca2+ como describe. El pico de respuesta de Ca2+ fue reducido en la lnea InsP 5 ptase en comparacin con la respuesta del control en respuesta estmulo frio o sal (Figura 7). En base a nuestros resultados, el componente InsP3 mediado de la seal de Ca2+ en estas plantas Centro de Biotecnologa Genmica

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es ~150 a 200 nm y constituye ~30% del total de la seal de Ca2+ en estas condiciones.

Discusin:
Sealizacin de InsP3 mediada por Ca2 + plantas InsP 5 ptase se atena en las

De acuerdo con el paradigma de la sealizacin, el primero efecto agua abajo de InsP3 documentado es provocar la liberacin de Ca2 + desde los depsitos intracelulares. Utilizando plantas que expresan aequorin, hemos demostrado que la sealizacin InsP3 mediada por Ca2 + se reduce en las plantas transgnicas en comparacin con plantas silvestres en respuesta a la sal, el fro o la adicin exgena de ABA y que el InsP3 mediada por Ca2 + es la contribucin, el 30%. Sin embargo, se desprende de nuestros resultados que la sealizacin de Ca2 + y la homeostasis es sutilmente alterada en las plantas transgnicas. Las clulas guardianas transgnicas fueron menos sensibles a las altas concentraciones de Ca2 +, y hubo un regulacin a la baja de los genes implicados en la unin y transporte de Ca2 +.

Las respuestas ABA se altera en las plantas transgnicos InsP 5 ptase Es bien sabido que el Ca2 + es un intermediario clave en algunos, pero No todos los procesos regulados por ABA. ABA es conocida por inhibir K + canales de rectificacin hacia el interior, un proceso que tambin implica una aumento de Ca2 + y fosfatos de inositol. El flujo de salida es inducido por el flujo de pH en las clulas guardianas, sin embargo, es independiente de Ca2 +, y de la activacin protector celular canales de aniones flujo de salida de la aplicacin de ABA a la citosol no fue precedida por una elevacin de Ca2 + y no poda ser imitado por los fosfatos de inositol o CADP-ribosa. Las clulas guardianas transgnicas InsP 5 ptase mostraron una disminucin en la respuesta a la inhibicin de la apertura de los estomas mediada por ABA en comparacin con plantas de tipo silvestre. La disminucin de la respuesta de las clulas guardianas transgnicas mediada por ABA y una alta concentracin de Ca2 + tambin puede ser explicado por el hecho de que InsP6 se reduce, ya que InsP6 es importante para la regulacin de las clulas guardianas. En conjunto, estos resultados apoyan la especulacin de que el PLC (y / o InsP3 y InsP6) slo puede ser necesaria para la inhibicin de la respuesta de la apertura mediada por ABA. Por el contrario, la respuesta de cierre de los estomas al ABA exgeno se ha mejorado en las plantas InsP 5 ptase. Esto podra mejorar la sensibilidad en la respuesta a la sequa, a pesar de que en la planta los niveles endgenos de ABA no aumentaron tan rpidamente con el estrs de sequa.

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Con respecto a la sealizacin cuando se es regulado por ABA, la induccin de los genes responsables con tratamientos de ABA exgenos fue comparable (si no ms fuerte) en el transgnico InsP 5-ptase y el tipo silvestre. Esto contrasta con plantas que sobre expresan At5PTase1 y At5PTase2 las cuales mostraron una expresin retrasada o atenuada de los genes seleccionados los cuales eran sensibles a ABA. Tanto At5PTase1 como At5PTase1 han mostrado la hidrolisis de la membrana de fosfolpidos en la adicin de Ins P3, mientras que la enzima animal es especficamente soluble en inositol fosfato como lo es InsP3. Cambios en la apertura de las estomas son regulados por cambios en el volumen que guardan las clulas, los cuales podran involucrar hasta un doble cambio en el rea superficial de las membranas. Esto, a su vez requiere una significante reorganizacin de los lpidos de la membrana para las vesculas de la va de secrecin y endocitosis. La sobreexpresin de At5PTases o el decremento de la produccin de PLC podra tener un impacto negativa en la biognesis de la membrana y as como en la regulacin de los estomas. Cambios en la transcripcin basal inducidos por la sequa en plantas transgnicas InsP5asa puede contribuir a una mayor tolerancia a la sequa. Los resultados de los microarreglos han revelado interesantes e importantes diferencias en la abundancia de la transcripcin entre el tipo silvestre y las plantas transgnicas, tanto en los niveles de la transcripcin basal como en la respuesta ante el estrs por la sequa. Se ha demostrado la unin de DREB2A con DRE elemento promotora de los genes de respuesta ante el estrs. La unin es regulada por un dominio de regulacin negativa en la protena DREB2A y puede ser tambin influenciada por la fosforilacin. Aunque la transcripcin constitutiva de los factores de transcripcin especficos de la familia DREB conferida para mejorar la tolerancia al estrs, esto causo retardo severo en el crecimiento bajo condiciones normales. Sin embargo, si solo un subgrupo de estos genes es regulado positivamente, es posible inducir tolerancia sin afectar el crecimiento. Proponemos que el constituyente de amortiguacin de la seal de InsP3 y la cantidad incrementada de intermediarios durante las rutas podra llevar a la des-represin selectiva de estrs inducido por las transcripciones y la tolerancia al estrs creciente, sin inhibir el crecimiento en condiciones no estresadas. Es posible que el aumento de la hidrlisis en las plantas transgnicas InsP3 InsP5ptase podra conducir a un aumento del flujo a travs de esta va, lo que resulta en mayores niveles de RFOs. El trabajo preliminar sugiere que los niveles basales son similares en plantas InsP 5ptase en comparacin con las plantas de tipo silvestre. Es probable que la sobre regulacin basal de los genes de regulacin DREB2A seleccionados en plantas transgnicas InsP5ptase contribuye a su mayor capacidad para resistir la sequa. Centro de Biotecnologa Genmica

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La comparacin de las muestras de estrs hdrico tambin ha revelado algunos aspectos importantes. Hubo, desde 150 hasta 200 genes que fueron comnmente sobreregulados o poco regulados en las plantas transgnicas y de tipo salvaje. Sin embargo, las plantas transgnicas muestran una regulacin al alza compensatoria de una va independiente de ABA en la que participa DREB2A y un subgrupo seleccionado de genes regulados por DREB2A. Estos resultados sugieren que la regulacin coordinada de estos genes en las plantas InsP 5 ptase contribuye a conferir tolerancia a la sequa sin afectar negativamente el crecimiento de las plantas. La regulacin selectiva de este subconjunto de la va DREB2A podra ser prometedor como mecanismo para incrementar la resistencia a la sequa en plantas de cultivo.

Conclusin:
Con el fin de manipular la va de los fosfoinostidos de plantas y comprender los efectores de sealizacin mediada InsP3, se generaron plantas transgnicas que expresan constitutivamente el polifosfato inositol 5-fosfatasa (InsP 5 ptase) de tipo mamfero, una enzima que hidroliza especficamente el inositol fosfato soluble y InsP3 tetracisfosfato inositol (InsP4) y no los fosfolpidos de inositol. La hiptesis de estos autores era que el aumento inducido por estmulos en InsP3 y InsP3 mediador, por las cascadas de sealizacin se ve afectada en plantas transgnicas y por lo tanto el tiempo y/o magnitud de la respuesta se retrasa o disminuye. Investigaciones anteriores le dan a estos datos apoyo en el cual el InsP3 es una seal universal en gravitropismo de planta y en la disminucin de la respuesta. La expresin ectpica de la planta endgena del gen InsP 5 ptase tambin ha revelado diferencias en las respuestas ABA en comparacin con el tipo salvaje. Estomas de las plantas transgnicas que sobreexpresin Arabidopsis InsP 5 ptase, At5PTase1, se mostraron menos abierta que la de tipo salvaje y menos sensible a la ABA, con la induccin de retraso de la respuesta del gen de expresin ABA. La induccin de genes de respuesta a ABA tambin fue atenuada en plantas transgnicas que expresan otra Arabidopsis fosfatasa inositol, At5PTase2. En base a sus predicciones y el trabajo por los dems, se esperaba que el InsP 5 ptase en plantas transgnicas sea menos tolerante a la sequa e incapaz de soportar prolongado estrs hdrico. Aunque, las plantas transgnicas pierden menos agua y son ms tolerantes a la sequa que el tipo de plantas salvaje. Por tanto las clulas de las plantas transgnicas muestran la sensibilidad diferencial de ABA exgeno en comparacin con plantas silvestres que en los bioensayos para controlar la apertura de estomas y cierre. Adems, con la sequa, los niveles de la ABA en las plantas transgnicas no aumentan tanto como en la de tipo salvaje. Una clave para entender el fenotipo de tolerancia a Centro de Biotecnologa Genmica

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la sequa es el aumento de ms del doble en los niveles de transcripcin basal de la sequa inducida por ABA-independiente del factor de transcripcin DREB2A y un subconjunto de DREB2A genes reguladores en la tona de plantas transgnicas.

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