4

Revista Tecnicaa No. 27, Septiembre de 2011

Artculos tcnicos

Aislamiento e Identificacin de Bacterias cido Acticas en Materia Prima y Tren de Fermentacin en el Ingenio Providencia S.A.
Mayra Alejandra Hurtado M.1, Ingrid Marcela Ramos P.1, Darly Silvana Parrado S.2 , Hctor Egidio Guzmn A.3 Palabras clave: Acetobacter sp., Gluconobacter sp., acidez voltil, actico, oxidacin, sobreooxidacin

Introduccin
La diversidad de variables que influyen sobre el proceso de produccin eficiente de alcohol carburante constituye un reto para la industria. En este proceso es particularmente importante la etapa de fermentacin durante la cual se deben mantener bajos niveles de acidez lctica y actica, ya que valores superiores a 3000 ppm de la primera y 1000 ppm de la segunda pueden afectar negativamente el comportamiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae y consecuentemente, afectar negativamente la eficiencia y produccin de alcohol carburante. En el proceso de produccin de etanol los puntos crticos de control microbiolgico se encuentran en la materia prima, la etapa de propagacin de la levadura y la fermentacin, ya que en ellas puede ocurrir contaminacin por bacterias cido acticas (BAA), microorganismos que se desarrollan en ambientes ricos en azcares y aerobios. Adems, algunos gneros como Acetobater sp. prefieren etanol como fuente de carbono y generalmente predominan en las ltimas etapas de las fermentaciones y en el vino, incluso en condiciones de baja tensin de oxgeno (Bartowsky y Henschke, 2008; Gullo y Giudici, 2008; Du Toit y Lambrechts, 2002). Las BAA son bacilos gram negativos ampliamente conocidos por su habilidad para oxidar rpida e incompletamente sustratos de carbono, especialmente azcares y alcoholes, por lo que se encuentran altamente adaptados en ambientes ricos en azcar y etanol. La presencia de estas bacterias puede generar un aumento en la acidez voltil expresada en trminos de cido actico en la materia prima y en el mosto de fermentacin, debido a su capacidad de oxidacin de etanol a cido actico e incluso, en algunos casos, de sobreoxidacin hasta CO2 y H2O. Estos microorganismos tienen dos sistemas enzimticos que dan lugar a la conversin de etanol en cido actico. Inicialmente el etanol se oxida por accin de alcohol deshidrogenasa (ADH) a acetaldehdo, producto intermedio que por accin de aldehdo deshidrogenasa (ALDH) se oxida y transforma en cido actico (Bartowsky y Henschke, 2008; Gullo y Giudici, 2008). Desde 2005, cuando se inici la produccin de alcohol carburante en el Ingenio Providencia, se han venido presentando problemas constantes de contaminacin con levaduras salvajes
1. Estudiantes en pasanta Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana-Bogot D. C. 2. Coordinadora Laboratorio Microbiologa Planta de Alcohol Carburante. 3. Asistente Laboratorio Fsico-Qumico Planta de Alcohol Carburante.

www.tecnicana.org

y bacterias cido lcticas; adems, a partir del segundo semestre de 2008 se present la contaminacin con bacterias cido acticas, lo que fue evidenciado por el aumento de la acidez voltil, principalmente en el tanque de activacin de la levadura, donde las condiciones son completamente aerbicas. Esto hizo necesario iniciar el estudio de las caractersticas y el comportamiento de este tipo de bacterias con el fin de establecer el impacto que tienen sobre la fermentacin y las posibles alternativas para su control. El objetivo del presente trabajo fue seleccionar un medio de cultivo que permita la identificacin y cuantificacin fcil y rpida de bacterias cido acticas en materiales del proceso de fermentacin, caracterizar a nivel de gnero los aislamientos obtenidos a partir de materia prima (Miel B) y tren de fermentacin, y determinar la cintica de produccin de cido actico de estos aislamientos.

medio GYP (Kadere et al., 2008): glucosa, 2%; acetato de sodio trihidratado, 0.5%; triptona, 0.5%; extracto de levadura, 0.5%; fosfato de potasio, 0.1%; Tween 80, 0.5%; y agar, 1.7%. En medio Manitol (Kadere et al., 2008): manitol, 2.5%; extracto de levadura, 1%; y agar, 1.5%. En medio WL diferencial: extracto de levadura, 0.4%; triptona, 0.5%; dextrosa, 5%; fosfato de potasio, 0.055%; sulfato de magnesio, 0.015; cloruro de calcio, 0.0125%; cloruro de potasio, 0.0425%; cloruro de hierro (III), 0.00025%; sulfato de manganeso, 0.00025%; verde de bromocresol, 0.0022; y agar, 1.7%. Y en medio Williamson (Surez e igo, 2004): medio base = mosto, 50%; extracto de levadura, 0.5%; agar, 2%; y etanol grado reactivo, 4%. Buffer citrato: cido ctrico, 4.7% y fosfato disdico, 4.38%. El pH del medio GYP se ajust a 6.8, mientras que

los medios Manitol y Williamson se ajustaron a pH 7.0. El crecimiento de levaduras se inhibi por la adicin de cicloheximida 100 ppm. Las cajas se incubaron a 30C durante 72 horas en condiciones aerobias. La morfologa microscpica de cada colonia se confirm mediante coloracin de gram. Los aislamientos correspondientes a bacilos o cocobacilos gram negativos se caracterizaron bioqumicamente a nivel de gnero mediante pruebas de oxidasa, catalasa y oxidacin de etanol. Para esta ltima se prepar el medio propuesto por Jurez y Pars (1997) y se inocul cada aislamiento en la superficie inclinada del medio utilizando una estra e incubando durante 72 h a 30 C en condiciones aerobias. Las lecturas de la prueba se hicieron a 24 horas, 48 horas y 72 horas. Un cambio de color de verde a amarillo en el medio producto de viraje del pH de neutro a cido fue calificado como resultado positivo, lo que indica el consumo de etanol por oxidacin. Esta prueba permiti diferenciar presuntivamente dos gneros de BAA: Gluconobacter sp., que oxida etanol hasta cido actico (viraje del medio a amarillo) y Acetobacter sp., que lo oxida hasta CO2 y H2O (viraje del medio inicialmente a amarillo y luego a verde). Curvas de produccin de cido actico Las curvas de produccin de cido actico fueron realizadas con dos aislamientos del tanque de activacin, previamente seleccionados a partir de medio WL diferencial y denominados como WL1 y WL3, correspondientes a Gluconobacter sp. y Acetobacter sp., respectivamente, y un aislamiento obtenido a partir de Miel B denominado BAA-02, correspondiente a

Materiales y mtodos
Obtencin de muestras Durante el periodo septiembre de 2009 y enero de 2010 se analizaron muestras provenientes del mosto del tanque de activacin de levadura (R-305), los fermentadores (R-311, R-312, R-313), el tanque sedimentador de levadura (R-331), el tanque acidulador de levadura (CV-304), la Miel B, y del contenido de slidos sedimentables (T-121) de la planta de alcohol de Ingenio Providencia S.A,. Medios de cultivo, obtencin de aislamientos y caracterizacin bioqumica Las cepas se aislaron y se les inocul 0.1 ml de cada dilucin seriada en

Las BAA son bacilos gram negativos ampliamente conocidos por su habilidad para oxidar rpida e incompletamente sustratos de carbono, especialmente azcares y alcoholes, por lo que se encuentran altamente adaptados en ambientes ricos en azcar y etanol. La presencia de estas bacterias puede generar un aumento en la acidez voltil expresada en trminos de cido actico en la materia prima y en el mosto de fermentacin, debido a su capacidad de oxidacin de etanol a cido actico e incluso, en algunos casos, de sobreoxidacin hasta CO2 y H2O.

Revista Tecnicaa No. 27, Septiembre de 2011

Gluconobacter sp. Las cepas se reactivaron en caldo GYP a 30C y 120 r.p.m. durante 24 horas. Los inculos fueron preparados en 500 ml en caldo miel estril con extracto de levadura (0.1%), Feed (mezcla de miel B, agua de proceso y nutrientes) (11%) y urea (0.04%) y se complet el volumen con agua de proceso. Las curvas de produccin de cido actico para los tres aislamientos se construyeron para simular a escala de laboratorio las condiciones del tanque de activacin (R-305), en medio estril que contena Feed (9.25%), urea (0.03%) y agua de proceso (71.58%); se ajust a pH 4.0 y se suplement con etanol grado reactivo (2.5%) e inculo (16.6%) (Ingenio Providencia S. A, 2010). Cada aislamiento se evalu por duplicado durante 10 h a 30 C y 120 r.p.m. tomando muestras al comienzo y a las horas 2, 4, 5, 6, 8 y 10 para analizar poblacin por recuento en placa en medio WL diferencial y acidez voltil (ppm). La concentracin de etanol (v/v, %) se cuantific al comienzo y a las horas 5 y 10. Adicionalmente, se midieron el oBrix y se analizaron azcares fermentables y residuales por cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC).

e igo, 2004; Du Toit y Lambrechts, 2002; Sokollek et al, 1998). En el presente trabajo se evidenci que estos medios efectivamente permiten el crecimiento de colonias a partir de muestras de mosto para produccin de alcohol carburante, las cuales morfolgicamente pertenecen al grupo de BAA. En general, las poblaciones obtenidas en los cuatro medios de cultivo evaluados para una misma muestra no presentaron diferencias mayores a una unidad logartmica (resultado no mostrado). En los medios GYP y Manitol se observaron los menores recuentos de unidades formadoras de colonia (UFC/ml), mientras que los medios Williamson y WL diferencial mostraron mayor recuperacin, lo que puede estar asociado con su composicin, ya que el crecimiento de BAA es influenciado de forma crtica por la disponibilidad de fuentes de nitrgeno, carbono y factores de crecimiento disponibles en el medio (Gullo y Giudici, 2008). Adicionalmente, el medio GYP present baja selectividad ya que permiti tambin la recuperacin de bacterias gram positivas.

El medio WL diferencial present mayores ventajas en comparacin con los dems medios evaluados, tales como alta recuperacin y selectividad, facilidad en el recuento de UFC/ml, debido a que es un medio translcido que propicia la diferenciacin de las colonias de BAA (Foto 1 A), adems, es el nico medio evaluado qumicamente definido, por lo que su preparacin es sencilla y rpida. Por estas caractersticas se seleccion como medio de cultivo para la determinacin rutinaria de la poblacin de BAA presente en el tren de fermentacin y materia prima. Aislamiento de bacterias cido acticas e identificacin presuntiva de gnero Se obtuvieron en total doce aislamientos a partir de las muestras del tren de fermentacin en los cuatro medios de cultivo evaluados, que corresponden a doce colonias morfolgicamente diferentes. De estos, slo un aislamiento correspondi a bacilos gram positivos, proveniente del medio GYP, que no fue incluido en la caracterizacin bioqumica y los medios Williamson, WL diferencial y Manitol mostraron una alta selec-

Resultados y discusin
Seleccin de medio de cultivo Los medios de cultivo evaluados resultaron adecuados para el crecimiento y aislamiento de BAA a partir de muestras de procesos de fermentacin, lo que confirma los hallazgos en vino y vinagre (Kadere et al, 2008; Bartowsky y Henschke, 2008; Gullo y Giudici, 2008; Gullo et al, 2006; Baena et al, 2006; Surez

Foto 1. Morfologa de aislamientos de BAA. A.: Colonias de BAA en medio WL Diferencial, B.: Morfologa microscpica (Cocobacilos gram negativos).

www.tecnicana.org

tividad hacia bacilos y cocobacilos gram negativos (Foto 1 B), morfologa reportada para BAA (Gullo y Giudici, 2008; Kedere et al, 2008; Sokollek et al, 1998; Jurez y Pars, 1997). Adicionalmente, se obtuvieron cuatro aislamientos en el medio WL diferencial a partir de Miel B. Se encontr que trece de los diecisis aislamientos obtenidos fueron catalasa positiva y oxidasa negativa. De acuerdo con Bergey et al. (1994) y Kadere et al. (2008) estas cepas pertenecen a los gneros Acetobacter o Gluconobacter. La colonia denominada WL4 fue catalasa negativa y la BAA-02 fue oxidasa positiva (Cuadro 1); por tanto, no fueron incluidas en los ensayos posteriores. Las cepas de Acetobacter fueron confirmadas y diferenciadas de Gluconobacter utilizando el mtodo descrito por Jurez y Pars (1997). Basado en este mtodo, las cepas de Acetobacter sobreoxidan etanol a actico y finalmente a CO2 y H2O a travs del ciclo de los tricarboxlicos.

En el caso de Gluconobacter, debido a su ciclo de cidos tricarboxlicos incompleto (-cetoglutarato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa no funcionales) no tiene la capacidad de oxidar cidos orgnicos como actico, ctrico, lctico, mlico, pirvico y succnico (Bartowsky y Henschke, 2008; Gullo y Giudici, 2008; Kedere et al, 2008). Despus de la incubacin, las cepas G1, G2, G3, WL3, M1 y M2 acidificaron el medio (Cuadro 1), lo que indica el consumo de etanol por oxidacin y produccin de cido actico. No obstante, luego de prolongada la incubacin ste revirti a pH neutro, lo cual significa que el cido actico fue convertido en CO2 y H2O, por lo que fueron clasificadas presuntivamente como Acetobacter sp. (Kadere et al, 2008). Por su parte, los aislamientos W1, W2, WL1, WL2, BAA-01, BAA-02 y BAA-04L se clasificaron como Gluconobacter sp. porque slo oxidaron etanol hasta actico (Cuadro 1). Los aislamientos

fueron conservados en caldo GYP con glicerol (50%) en congelacin a -20C. No obstante, es necesario aclarar que la identificacin presuntiva se bas en el trabajo realizado por Jurez y Pars (1997), quienes definieron una metodologa para la diferenciacin entre los gneros mencionados anteriormente, motivo por el cual no se tiene en cuenta el gnero Gluconacetobacter, que tambin tiene capacidad de sobreoxidacin de etanol hasta CO2 y H2O (Bartowsky y Henschke, 2008). Esto significa que los aislamientos identificados como Acetobacter sp. pueden pertenecer a Gluconacetobacter; por tanto, se requieren pruebas bioqumicas confirmatorias y valuaciones ms detalladas que permitan definir la especie. Tomando como referencia las identificaciones presuntivas hasta nivel de gnero de los aislamientos, se podra afirmar que la composicin del medio WL diferencial abarc ms

Cuadro 1. Caracterizacin bioqumica de los aislamientos de bacterias cido acticas (BAA).

Medio de cultivo Williamson Cdigo de colonia W1 W2 BAA-01 BAA-02 BAA-03L BAA-04L GYP G1 G2 G3 WL1 WL2 WL3 WL4 Manitol M1 M2 Catalasa + + + + + + + + + + + + + + Oxidasa + 24 h cido cido neutro cido cido cido cido cido cido neutro cido cido neutro cido cido Oxidacin de etanol (pH) 48 h cido cido neutro cido cido cido neutro neutro neutro cido cido cido cido neutro 72 h cido cido cido cido cido cido neutro neutro neutro cido cido neutro neutro neutro Gnero Gluconobacter sp. Gluconobacter sp. Gluconobacter sp. Gluconobacter sp. No determinado Gluconobacter sp. Acetobacter sp. Aacetobacter sp. Acetobacter sp. Gluconobacter sp. Gluconobacter sp. Acetobacter sp. No deteminado Aacetobacter sp. Acetobacter sp.

Revista Tecnicaa No. 27, Septiembre de 2011

Aislamiento WL 1
5000 4500 4000 Acidez voltil (ppm) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5 Tiempo (h) 6 7 8 9 10 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Grado alcohlico (%v /v )

Aislamiento WL 3
Acidez coltil (ppm)
6000 4000 2000 0 0 5 10
2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 00

Tiempo (h)

Figura 1. Aumento de la acidez voltil y disminucin del grado alcohlico en cepas WL1 y WL3.

Aislamiento BAA-02
8000 7000 Acidez voltil (ppm) 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 2 4 Tiempo (h) 6 8 10 3 2,8 2,6 2,4 2,2 21,8 1,6 1,4 1,2 10,8 0,6 0,4 0,2 0

Figura 2. Produccin de actico y disminucin del grado alcohlico para la cepa BAA-02.

ampliamente los requerimientos nutricionales de las bacterias cido acticas presentes en el mosto del tanque de activacin R-305, y posiblemente en el tren de fermentacin. Produccin de cido actico de Gluconobacter sp. y Acetobacter sp. En la Figura 1 aparece el comportamiento de la produccin de cido actico de las cepas aisladas del tanque de activacin. En el ensayo con el aislamiento WL1 se alcanz un nivel de acidez voltil de 4155 ppm al final de la fermentacin, equivalente a un aumento de 2520 ppm en relacin con la inicial, aunque se present la mxima produccin en

la hora 8 con 4645 ppm (Figura 2 A). Por su parte, el aislamiento WL3 aument la acidez voltil en 1865 ppm respecto a la inicial y lleg a 3540 ppm al final de la fermentacin y a su mxima produccin (3812 ppm) a la hora 8 (Figura 1 B). Por otra parte, el aislamiento proveniente de materia prima BAA02 mostr el mayor aumento de acidez voltil en el medio frente a las cepas WL1 y WL3, pues logr hasta la hora 10 una acidez voltil de 7625 ppm, equivalente a un aumento de 5905 ppm respecto al inicio de la fermentacin, con tendencia a seguir aumentando (Figura 2). La marcada diferencia de produccin de cido

actico entre los aislamientos provenientes del tanque de activacin y la cepa de materia prima posiblemente se debe a que en el momento de obtener los aislamientos WL1 y WL3 en 2009, coincidencialmente se estaba aplicando en el tanque de activacin un biocida a base de amonio cuaternario en una concentracin de 200 ppm. Es posible que el efecto de este producto se reflej en la baja produccin de actico por ambas cepas, debido a que se enlaza a sitios cargados negativamente en la pared bacteriana de la clula. Estos enlaces electrostticos causan en las bacterias tensiones en la pared celular y disminuyen la permeabilidad de la pared, evitando con ello el flujo normal de compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos (Lentechh, 2010); por el contrario, el aislamiento BAA-02 no fue sometido a estrs fisiolgico o qumico, ya que en el tanque de almacenamiento de miel B no se aplic biocida. En los ensayos de fermentacin con los aislamientos seleccionados se pretenda simular las condiciones de operacin en planta del tanque de activacin (R-305), en el cual se espera que el grado alcohlico se

Grado alcohlico (%v /v )

Grado Alcohlico (%v/v)

www.tecnicana.org

mantenga en un nivel menor que 2% v/v. Los resultados para las tres cepas mostraron una reduccin leve de ste, lo que demuestra que la produccin de cido actico tuvo lugar no solo a partir de los azcares disponibles en el medio sino tambin del alcohol. Sin embargo, en el tanque de activacin esta disminucin no fue tan relevante, ya que en l se pretende nicamente la propagacin de Saccharomyces cerevisiae, mientras que en los fermentadores, a pesar de que se busca condiciones anaerobias, por su capacidad de 1000 m3 y operacin al 80%, se pueden generar reas microaeroflicas en las que estas bacterias pueden sobrevivir (Bartowsky y Henschke, 2008; Du Toit y Lambrechts, 2002; Joyeux et al., 1984) y su accin puede generar prdida en la produccin diaria de etanol. La produccin de cido actico, expresada como acidez voltil, por parte de los tres aislamientos evaluados durante 10 horas de seguimiento alcanz valores mayores que 3000 ppm, una concentracin que puede causar disminucin de la viabilidad y el rendimiento de la levadura S. cerevisiae durante su etapa de reproduccin y fermentacin, como lo demostraron Giannattasio et al. (2005), quienes encontraron que concentraciones de 2400 ppm y 3600 ppm de cido actico adicionado a un medio YPD que contena Saccharomyces cerevisiae en fase exponencial tuvieron un efecto inhibidor y no txico, mientras que con una concentracin de 4600 ppm se evidenci toxicidad en la levadura y disminuyeron los porcentajes de viabilidad a 30% en 90 min y 0% a 200 min. Aunque en el presente trabajo no se evalu el efecto de las tres cepas de BAA sobre la levadura, se

sabe, por experiencia en planta, que valores de acidez voltil mayores que 1000 ppm en el tanque de activacin se consideran alarmantes e implican la liquidacin del tanque. Tambin se realizaron anlisis para evaluar la relacin entre el consumo de azcares fermentables entendidos en trminos de glucosa, fructosa y sacarosa y la produccin de cido actico, ya que en planta es muy importante mantener un porcentaje de azcares fermentables (AF) para garantizar el buen desarrollo de la levadura en etapa de propagacin. El aislamiento WL1, que present la menor produccin de actico, tambin present el menor consumo de AF (4.93%), mientras que la cepa WL3 present un consumo de AF igual a 11.77%. A su vez, el aislamiento BAA-02 registr un mayor consumo de azcares fermentables (18.7%), que se relaciona con la alta produccin de actico durante el tiempo de evaluacin (Figura 3). Los anlisis realizados por HPLC mostraron que los aislamientos WL3 y BAA-02 tenan mayores consumos de sacarosa (11.63% y 12.09%, respectivamente) comparados con el aislamiento WL1. Sin embargo, el aislamiento BAA-02 present 36% de mayor afinidad por glucosa

(Figura 3), lo que demuestra que para este tipo de microorganismos es metablicamente ms fcil usar la glucosa presente en la miel B. El alto consumo de glucosa por parte de esta cepa puede ser explicado por la capacidad de las bacterias cido acticas para oxidar la glucosa a travs de una segunda ruta no fosforilada, que puede dar lugar a un cmulo de productos parcialmente oxidados como gluconato y cetocidos derivados (Stainer, 2003). El Brix al final de la fermentacin para BAA-02 fue de 8.33o, que comparado con el Brix de WL1 (7.93o) y WL3 (8,31o) evidencia que durante las 10 horas de fermentacin no solo tuvo lugar la produccin de acido actico sino que tambin, debido al metabolismo que poseen estas bacterias, ocurri la produccin de intermediarios metablicos como carboxlicos, los cuales se acumulan y aumentan el Brix en la mezcla al final de la fermentacin (Stainer, 2003).

Conclusiones
El medio WL diferencial fue seleccionado para la determinacin rutinaria de la poblacin de bacterias cido acticas presente en el tren de fermentacin y materia prima

% Fruc HPLC BAA-02 11,48 12,09 12,48 12,18 11,67 4,7 5,6 7,5

% Gluc HPLC

% Sac HPLC 36,07

WL3 WL1

Figura 3. Porcentajes de consumo de azcares fermentables por el mtodo HPLC.

10

Revista Tecnicaa No. 27, Septiembre de 2011

por su alta selectividad y capacidad de recuperacin, facilidad en la preparacin y en la realizacin de la tcnica de recuento en placa. Este medio permiti la obtencin de aislamientos pertenecientes a los gneros Acetobacter y Gluconobacter, mientras que en los medios Williamson, GYP y Manitol se aisl slo uno de los dos gneros. Se obtuvieron trece aislamientos identificados presuntivamente como bacterias cido acticas pertenecientes a los gneros Acetobacter y Gluconobacter, a partir de diecisis colonias morfolgicamente distintas obtenidas en los medios evaluados. Se destaca que siete de ellos correspondieron preliminarmente al gnero Gluconobacter y seis a Acetobacter. La evaluacin de produccin de cido actico de tres de estas cepas mostr que las bacterias provenientes de miel B tienen mayor capacidad de produccin de cido actico al alcanzar valores de 7000 ppm en 10 horas de fermentacin, en relacin con las aisladas del tanque de activacin, lo cual, a su vez, se relacion con un mayor consumo de azcares fermentables, particularmente glucosa.

Referencias
Baena, S.; Jimnez, C.; Santos, I.; Cantero, D.; Barja, F. y Garca, I. 2006. Rapid method for total, viable and non-viable acetic acid bacteria determination during acetification process. Process Biochemistry. 41: 1160-1164. Bartowsky, E y Henschke, P. 2008. Acetic acid bacteria spoilage of bottled red winwA review. Journal of Food Microbiology. 125: 60-70. Bergey, D.; Krieg, N y Holt, J. 1994. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Wlliams & Wilkins. Pg. 71. Du Tooit, W. y Lambrechts, M. 2002. The enumeration and identification of acetic acid bacteria from South African red wine fermentations. International Joournal of Food Microbiology. 74: 57-64. Fuentes, L.; Tapia, A.; Jimenez, T.; Mascarua, M.; Santoyo, Y.; Caso, L.; Romero, H.; Cajica, M.; Len, D.; Rosales, M.; Fguemann, P. y Castillo, M. 2003. Bacterias acticas: diversidad e interaccin con plantas. Elementos. 41:57. Giannattasio, S.; Guaragnella, N.; Corte-Real, M.; Passarella, S. y Marra, E. 2005. Acid stress adaptation protects Saccharomyces cerevisiae from acetic acid-induced programmed cell death. Gene. 354: 93-98. Gullo, M y Giudici, P. 2008. Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar: Phenotypic traits relevant for starter cul-

tures selection. International Journal of Food Microbiology. 125: 46-53. Gullo, M. ; Caggia, C.; De Vero, L. y Giudici, P. 2006. Characterization of acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar. International Journal of Food Microbiology. 106: 209-212. Hernandez, A.; Alfaro, I. y Arrieta, R. 2000. Microbiologa Industrial. Revert. 750p Jurez, A. y Pars, R. 1997. Bioqumica de los microorganismos. Editorial Revert, S.A. Espaa. Pg. 56. Kadere, T.; Miyamoto, T.; Oniang`o, R.; Kutima, P. y Njoroge, S. 2008. Isolation and identification of the genera Acetobacter and Gluconobacter in coconut toddy (mnazi). African Journal of Bioechnology. 7(16): 2963-2971. Lenntech Water treatment solutions. En: http://www.lenntech.es/biocidas.htm. (Consulta: Junio de 2010) Stainer, R.; Ingraham, J.; Wheelis, M. y Painter, P. 1996. Microbiologa. Segunda edicin. Editorial Revert. 750p Sokollek, S.; Hertel, C y Hammes, W. 1998. Cultivation and preservation of vinegar bacteria. Journal of Biotechnology. 60: 195-206. Surez, J. e igo, L. 2004. Microbiologa Enolgica: Fundamentos de vinificacin. Tercera Edicin. Ediciones Mundi Prensa. Espaa. Pg. 455 y 456.

Agradecimientos
El desarrollo y la culminacin de este trabajo fueron posibles gracias a la ayuda conjunta del Laboratorio de Microbiologa y Fsico-Qumico y al personal de la Destilera del Ingenio Providencia S.A.