Revista Dental de Chile 2002; 93 (2): 25-28

Revisin Bibliogrfica

Autores:
Dr. Mario Reyes M. * Dra. Sandra Montero R.* Dr. Julio Cifuentes F.* Dr. Emilio Zarzar C.*
*Servicio de Ciruga y Traumatologa Mxilo Facial. Clnica Alemana. Santiago Direccin Postal: Vitacura 5951. Vitacura. Santiago.

Actualizacin de la Tcnica de Obtencin y Uso del Plasma Rico en Factores de Crecimiento (P.R.G.F.)
Extraction Technique and Surgical Use of the Plasma Rich in Growth Factors (P.R.G.F.) Update

Resumen
El uso del plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), en ciruga, tiene beneficios tcnicos importantes y puede incrementar la regeneracin sea, al utilizarse junto con injertos de hueso autlogo. Sus predecesores fueron el adhesivo de fibrina, utilizado como hemosttico y adhesivo quirrgico, el fibringeno autlogo, con el que se preparaba el gel de fibrina autloga y, posteriormente, el plasma rico en plaquetas o PRP, el cual se mezcla con cloruro clcico y trombina bovina para producir la agregacin y desgranulacin plaquetaria, obtenindose factores de crecimiento. El PRP requiere grandes volmenes de sangre, un ambiente intrahospitalario, implementacin sofisticada, plantea dos ciclos de centrifugacin a altas revoluciones y utiliza trombina bovina para su activacin. Siguiendo los mismos principios del PRP, surge la tcnica de obtencin del PRGF, que requiere menores volmenes de sangre, un equipamiento simple que permite su uso en la consulta, no utiliza trombina bovina y plantea una sola centrifugacin con menos revoluciones, preservando la integridad de la membrana plaquetaria, permitiendo as obtener una mayor concentracin de factores de crecimiento; siendo un procedimiento econmico, enormemente eficiente y 100% autlogo.

Summary
The use of PRGF in oral and maxillofacial surgery procedures has technical benefits and may enhance bone regeneration when used in conjuction with autologous bone grafts. The fibrin adhesive was used as a haemostatic agent and surgical adhesive, before PRGF appeared. Autologous fibrinogen was widely used to produce the autologous fibrin gel, until platelet rich plasma (PRP) became the best option to obtain growth factors, after mixing this plasma with calcium chloride and bovine trombine, which causes platelet addition and exocytosis of these factors. However, PRP requires large volume of blood, hospitalary environment, sophisticated equipment, two high-speed spinning cycles and utilizes bovine trombine for its activation. Following the same principle, PRGF appears as an alternative which requires: minimum volume of blood, a plain equipment that allows its performance at the ambulatory office, a single low-speed spinning cycle -which contributes to obtain a higher concentration of growth factors- and does not utilize bovine trombine. Therefore, PRGF is an economic, highly efficient and 100% autologous technique.

Introduccin
El uso del gel de plasma rico en plaquetas (PRP) para la colocacin de injertos seos en ciruga oral y maxilofacial, fue originalmente propuesto por Marx en 1986 y, en los ltimos aos, se ha masificado su uso con excelentes resultados, debido fundamentalmente, a la capacidad que tiene de incrementar la regeneracin sea al ser utilizado junto con injertos de hueso autlogo y a que es un procedimiento relativamente simple. Ha despertado el inters tambin en otras reas como ortopedia, otorrinolaringologa, ciruga plstica, neurociruga y periodoncia. La tcnica de obtencin y utilizacin del PRP ha sufrido algunas variaciones, dado que se ha seguido investigando al respecto y en la actualidad el procedimiento se ha simplificado y optimizado a la vez, tanto as, que hoy se prefiere hablar de plasma rico en factores de crecimiento (plasma rich in growth factors o PRGF). La presente revisin pretende actualizar los conceptos referentes a este importante recurso y mostrar cmo se realiza hoy, tanto la tcnica de obtencin del PRGF, como su uso clnico.

Desarrollo
El desarrollo del PRGF parte en los aos 80 con el adhesivo de fibrina, el cual aparece en el mbito de la investigacin en respuesta a la necesidad de mejorar los agentes hemostticos y los adhesivos quirrgicos, sobre todo en aquellos rganos en los que resulta muy difcil controlar el sangrado como hgado, riones, cerebro, en tejidos infectados, quemados o soportes de injertos(1). Matras describi este adhesivo como una sustancia con propiedades selladoras y hemostticas que promova la reparacin del tejido y el cierre de la herida y que fue comercializado con el nombre de Tisucol(3).
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Como consecuencia del veto a su utilizacin por la Food and Drug Administration (FDA), se ha desarrollado otra modalidad: la obtencin del fibringeno autlogo, que evita los riesgos de infeccin y rechazo. La tcnica sugiere la obtencin de sangre del paciente das antes de la ciruga para aislar el fibringeno en el laboratorio con el que se prepara el gel o cola de fibrina autloga. El mecanismo de accin de la cola de fibrina mimetiza la ltima etapa de la coagulacin en la cual el fibringeno se convierte en fibrina por accin de la trombina, la que en presencia de calcio, rompe los fibrinopptidos A y B de la molcula de fibringeno, originando as los monmeros de fibrina; adems, la trombina activa el factor XIII que favorece el entrecruzamiento de estos monmeros, formando el cogulo. Debido a la accin proteoltica de la trombina sobre el fibringeno, que es soluble, al convertirlo en fibrina, que es insoluble, se genera esta sustancia viscosa que constituye el adhesivo de fibrina(1,2). La alternativa a la preparacin del gel de fibrina autlogo, que requera citar al paciente das antes de la intervencin, ha sido la obtencin de un plasma rico en plaquetas (PRP) mediante plasmafresis, minutos antes de la intervencin. El mtodo consiste en obtener 500 ml de sangre del paciente a travs de un catter a una velocidad de 50 ml/min la que es recepcionada en tubos citratados. Posteriormente se centrifuga la sangre a 5.600 rpm, obtenindose 3 fracciones, de menor a mayor densidad: plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma rico en plaquetas (PRP) y clulas rojas. El PPP y PRP se aspira y se lleva a otro recipiente para ser centrifugado nuevamente a 2.400 rpm obtenindose 2 fracciones: PPP y PRP. Este ltimo, se conserva hasta que se requiera su uso en la ciruga, momento en el cual se mezcla con cloruro clcico y trombina bovina, producindose en un intervalo de 5 a 30 segundos la coagulacin del PRP. Este cambio produce agregacin y desgranulacin plaquetaria, liberndose las protenas contenidas en su interior, entre ellas los factores de crecimiento; la preparacin tarda en total 45 minutos(4). El xito del gel de fibrina ha llevado a desarrollar una tcnica con la misma filosofa, con menores volmenes de sangre, que pueda ser utilizada en forma rutinaria incluso en la consulta ambulatoria. La estrategia se basa en la utilizacin de las plaquetas por las siguientes razones: Por un lado, funcionan como vehculo portador de factores de crecimiento y de otras protenas que desempean un papel importante en la biologa sea,
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como son la fibronectina y otras protenas adhesivas. Por otro lado, se controla la liberacin de estas protenas contenidas en los grnulos alfa de las plaquetas, sustancias que sern concentradas y depositadas en el lugar de la herida, exponiendo y orientando un concentrado fisiolgico de protenas que va a intervenir, acelerando y favoreciendo el proceso de reparacin y regeneracin. Entre otras encontramos las siguientes protenas: - PDGF: factor de crecimiento derivado de las plaquetas. - VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular. - TGF beta: factor de crecimiento transformado tipo beta. - EGF: factores de crecimiento epidrmico. - IGF-I: factores de crecimiento insulnico tipo I. La accin e interacciones de estos factores de crecimiento varan dependiendo del tipo de clula y de su grado de madurez(1,10). El TGF beta 1 promueve la sntesis de matriz extracelular e induce la expresin de receptores tipo beta para el PDGF. Junto a este ltimo, estimula la sntesis de colgeno tipo I, fibronectina y osteonectina as como la sedimentacin de la matriz extracelular y la quimiotaxis. Tambin disminuye la sntesis de metaloprotenas (que degradan la matriz extracelular) y del factor activador de plasmingeno, todo lo cual tiene como consecuencia una disminucin en la destruccin de la matriz de tejido conjuntivo. El TGF beta 1, al parecer, inhibe la formacin de osteoclastos, pero por otro lado, promueve la resorcin de hueso por un mecanismo dependiente de las prostaglandinas. Su accin es muy compleja, pero parece que es uno de los factores de conexin entre la reabsorcin y formacin sea(5,12). Los niveles plasmticos de EGF no son detectables, pero las plaquetas contienen cantidades importantes de este factor de crecimiento epidrmico. Tras la coagulacin, la concentracin de EGF en el suero es aproximadamente de 130 pmol/L, cantidad suficiente para inducir la mitosis y la migracin celular. Este hecho sugiere la participacin de EGF en las primeras fases de la reparacin, estimulando la migracin y divisin celular y aumentando la sntesis de protenas como la fibronectina(13) . El plasma contiene cantidades importantes de IGF-I, el que es sintetizado principalmente en el hgado. Tambin se encuentran cantidades importantes de este factor en las plaquetas. Una vez liberado por las plaquetas, el IGF-I es un potente agente

quimiotctico para las clulas vasculares endoteliales, provocando un aumento en la neovascularizacin de la herida. El IGFI tambin estimula la proliferacin y diferenciacin de osteoblastos y tiene mayor efecto combinado con otros factores de crecimiento. VEGF estimula la proliferacin celular en aquellos vasos sanguneos que han sido daados. De este modo se utilizan las plaquetas como fuente exgena de factores de crecimiento que, en algunos casos, refuerzan las concentraciones ya existentes en el hueso, y en otros actan en concierto con stos, estimulando la actividad de las clulas seas y clulas epiteliales. El cogulo de PRGF o cogulo blanco, funciona como vehculo natural de los factores de crecimiento y presenta muchas ventajas sobre otros diseos ms sofisticados. Como las plaquetas carecen de ncleo, sus posibilidades de sintetizar protenas son prcticamente inexistentes. Sin embargo, poseen protenas, entre ellas el fibringeno, que captan del plasma por un mecanismo de endocitosis. Este fenmeno utiliza un sistema canalicular conectado a la superficie e interrelaciona el medio plasmtico externo con los grnulos. Esta es la razn por la que las plaquetas contienen protenas plasmticas(1). Con tcnicas de microscopa electrnica se ha estudiado la cintica de la agregacin plaquetaria en el PRGF activado con cloruro clcico, pudindose observar cmo, cuando se activa el PRGF, las plaquetas cambian su forma y se van agregando desplazndose dentro del cogulo hasta agruparse por completo a los 30 minutos. Se ha visto que ocurren cambios no slo en la forma de las plaquetas, sino tambin en su contenido. A los 3 minutos se aprecian aisladas, esparcidas por el cogulo, pero ya se observa la formacin de pseudopodos y la centralizacin de los grnulos. Entre los 3 y los 10 minutos las plaquetas continan su activacin y se agregan. A los 30 minutos la morfologa del cogulo es completamente diferente. Las plaquetas se han agregado y permanecen fuertemente unidas, rodeadas de fibras de fibrina, se ha liberado el contenido de todos sus grnulos, observndose las plaquetas vacas y fibras gruesas de fibrina. Al cabo de una hora la estructura y morfologa del cogulo es muy regular y estable. A la hora y media las plaquetas estn vacas e incluso se puede observar la rotura de muchas de ellas(6).

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Tcnica de Obtencin del PRGF

Hasta 1995, todos los protocolos de obtencin de concentrados plaquetarios partan de cantidades muy elevadas de sangre y se realizaban en ambientes hospitalarios con equipos sofisticados de autotransfusin. Adems, exista una gran controversia, en Europa sobre todo, con el uso de trombina bovina, ya que se haba detectado anticuerpos anti trombina en pacientes tratados con los mtodos antes descritos(1). Se pens en la obtencin de un cogulo rico en factores de crecimiento mediante un mtodo sencillo y de fcil utilizacin incluso en la consulta ambulatoria. Se inicia entonces la optimizacin de un protocolo que permitiera utilizar esta fuente fisiolgica de factores de crecimiento que, adems del beneficio de la liberacin de stos, constituyera un elemento mecnico que permitiera consolidar los materiales de injerto y facilitara el cierre de la herida favoreciendo el postoperatorio(7). Se eligi como anticoagulante idneo para la extraccin de sangre el citrato sdico. Esta sal capta los iones calcio que se encuentran en la sangre y los neutraliza formando un compuesto qumico llamado quelato, impidiendo de esta forma, la coagulacin de la sangre. Adems, el citrato sdico no altera los receptores de membrana de las plaquetas y permite la reversibilidad del proceso al aadir calcio en forma de cloruro de calcio. La separacin del plasma se logra mediante centrifugacin suave, la cual permite concentrar las plaquetas que se encuentran ms prximas a los hemates. Las fracciones con mayor contenido de plaquetas son las que se encuentran inmediatamente por encima de la serie roja (0,1 cc. por encima de los hemates). Esta fraccin contiene un plasma 8 veces ms concentrado en plaquetas que la sangre perifrica. La siguiente fraccin contiene un plasma 4 veces ms concentrado(1).

Procedimiento de Obtencin del PRGF

Se realiza la extraccin de la sangre al paciente unos minutos antes de comenzar la ciruga. La cantidad depender del defecto a tratar. Por ejemplo, para una exodoncia, entre 20 y 30 cc. sern suficientes, mientras que para una elevacin de seno, bastarn 30 cc. La sangre se recepciona en tubos estriles con citrato sdico al 3,8% como anticoagulante. A pesar que el EDTA tiene un rendimiento mayor que el citrato, se ha visto por microscopa de luz, a las plaquetas rasgadas, rodeadas de abundantes restos celulares cuando se ha usado EDTA como anticoagulante. Se prefiere por tanto el Fosfato de Dextrosa Citratado (CDP), debido a que ste preserva la integridad de la membrana plaquetaria, hecho de vital importancia, ya que los factores de crecimiento son exocitados activamente. Durante este proceso ocurre la formacin de la molcula proteica y la formacin de su estructura terciaria, de cuya integridad depende su actividad y efectividad. En este mismo contexto, es importante considerar tambin, la velocidad de centrifugacin que va en relacin directa con la fuerza de gravedad (G), ya que se ha visto que una G excesiva, reduce dramticamente la cantidad de factores de crecimiento (11). Se centrifuga el plasma en una centrfuga digital que permita controlar los parmetros de tiempo y velocidad. El tiempo de centrifugacin ser de 8 minutos a 1.800 rpm (280 G), a temperatura ambiente. El plasma luego es separado mediante pipeteado muy meticuloso para no crear turbulencias en las fracciones obtenidas. Los primeros 500 microlitros (0,5 cc.) (fraccin 1) es un plasma pobre en plaquetas y por lo tanto pobre en factores de crecimiento. Los siguientes 500 microlitros (fraccin 2) correspondern a un plasma con un nmero de plaquetas similar al que tiene la sangre perifrica. La fraccin de plasma ms rico en plaquetas y factores de crecimiento (PRGF) son los 500 microlitros que se encuentran encima de la serie blanca (fraccin 3). Con una pipeta de 500 microlitros se aspira la fraccin 1 y se traslada a un tubo estril, previamente etiquetado, donde se reunir todo el PPGF, repitindose el proceso con todos los tubos procedentes de la centrifugacin. Con la misma pipeta (diferente punta estril), se aspira la fraccin 2 de todos los tubos y al igual que con la fraccin 1, se lleva a otro tubo estril etiquetado, que contendr entonces, un plasma con una concentracin de plaquetas similar a la de la sangre perifrica (PGF). Para la fraccin 3 se realiza un pipeteado ms cuidadoso, con una pipeta de 100 microlitros, para evitar las eventuales turbulencias que se puedan producir, y de este modo no aspirar los hemates ni la serie blanca. Se repite este proceso 5 veces, colectndose lo obtenido en un tercer tubo estril y etiquetado, el cual contendr el PRGF. El volumen de plasma que se obtiene tras la centrifugacin vara ligeramente de un individuo a otro, obtenindose volmenes diferentes de cada fraccin. Por lo tanto, se debe contar siempre desde la serie blanca hacia arriba, y de obtenerse ms plasma, ste ser PPGF, cuyo volumen puede variar entre 1 y 2 cc. As, si tenemos 4,5 cc de sangre, 1 cc. ser PRGF, 1 cc. de PGF y el resto PPGF. Lo importante es el concepto de que se comienza a pipetear desde arriba, pero la fraccin ms importante es la ltima. Otro detalle importante es que si despus de centrifugar se observara un tubo con plasma turbio, por la presencia de hemates, ste debe ser descartado, ya que esta pequea hemlisis se debe a una falla en el momento de extraer la sangre del paciente, por una mayor lesin de la pared vascular. Esta lesin ha provocado la liberacin de una gran cantidad de tromboplastina tisular, comenzando la formacin del cogulo.

Figura

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Activacin y Agregacin Plaquetaria

Una vez obtenido el PRGF, para provocar la formacin del cogulo se pueden emplear los siguientes protocolos: - Aadir 50 microlitros de cloruro clcico al 10% por cada cc. de PRGF. Luego de 5 a 8 minutos se obtendr el cogulo, tiempo que variar en relacin inversa al nmero de plaquetas. Para acelerar el proceso se puede elevar la temperatura del plasma a 37 C, antes de activarlo, disminuyendo de 2 a 3 minutos el tiempo de formacin del cogulo. - Si se va a mezclar el plasma con algn material de injerto, primero se aade el cloruro clcico y luego el injerto. Despus de 2 a 5 minutos se obtendr un agregado que contendr el injerto, con una consistencia gomosa fcil de manipular. Tambin se puede disminuir el tiempo de formacin aumentando a 37 C la temperatura(8). - Si se desea obtener un efecto barrera, se pueden mezclar 2 cc. de sulfato clcico con 1 cc. de PRGF para, luego de 5 minutos, obtener un material gomoso de fcil manipulacin. Este material adems posee propiedades osteoconductoras(1).

Obtencin de Fibrina Autloga

Al mezclar el PRGF con cloruro clcico se activa la trombina endgena y se transforma el fibringeno en fibrina. En un principio, se forma la malla de fibrina y se activan las plaquetas, las que inicialmente dispersas, poco a poco se van agregando unindose entre s, provocando cambios en su citoplasma para luego liberar el contenido de sus grnulos alfa. El cogulo recin formado es una verdadera esponja empapada en factores de crecimiento y otras citoquinas. Este cogulo, englobando o no un injerto, sigue experimentando cambios para finalmente retraerse. Este, ha eliminado parte de su contenido en factores de crecimiento, y ya presenta fibras gruesas de fibrina, bien organizadas. Esta ltima fase se puede catalizar manteniendo el cogulo a 37 C. El tapn de fibrina as obtenido puede servir como cierre en una exodoncia para proteger el cogulo de PRGF de ser aspirado o movilizado por la lengua. Tambin se puede obtener fibrina en forma de membrana biolgica que sirva para cubrir un injerto compactado con PRGF. El cogulo de fibrina tiene una consistencia tal, que casi permite ser suturado. Para la obtencin de fibrina podemos, obviamente, utilizar el PRGF, resultando una malla de gran volumen, pero tambin podemos utilizar las fracciones menos concentradas, con las que se obtienen, s, volmenes menores. Por ello, se deben conservar todas las fracciones de plasma obtenidas.

Aplicaciones Clnicas
El uso clnico del PRGF es muy variado y, cada vez, surgen nuevas e insospechadas aplicaciones en las cuales este recurso autlogo y econmico, soluciona problemas otrora imposibles de enfrentar con xito. Dentro de todas las aplicaciones clnicas, se mencionarn las utilizadas en el campo de la ciruga oral y maxilofacial, a saber: - Reconstruccin de rebordes alveolares atrficos. - Elevacin de seno maxilar. - Relleno de cavidades qusticas post quistectoma. - En exodoncias mltiples, para conservar la altura del reborde alveolar. - En defectos seos generados por la desinclusin de caninos o terceros molares. - En defectos seos periapicales, luego de una apicectoma, por ejemplo. - Regeneracin sea alrededor de implantes osteointegrados, rellenando el defecto inmediatamente luego de haber colocado el o los implantes. - En injertos seos en bloque, para rellenar la zona donante, estimulando su regeneracin y para cubrir y ayudar a remodelar el bloque a utilizar, compactndose las zonas limtrofes del injerto, evitando as los escalones seos(8). - Reconstruccin de grandes defectos seos post ciruga oncolgica(9) .

Bibliografa
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