UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA

FIT 5806 - BIOTECNOLOGIA

APOSTILA (v.5)

Rubens Onofre Nodari

Doutor em Gentica (UCDavis-CA), Prof. Titular do Dep. de Fitotecnia, Centro de Cincias Agrrias, Universidade Federal de Santa Catarina, C. Postal 476, Florianpolis, SC, 88040-900, e-mail: nodari@mbox1.ufsc.br

e Miguel Pedro Guerra

Doutor em Cincias (USP), Prof. Titular do Dep. de Fitotecnia, Centro de Cincias Agrrias, Universidade Federal de Santa Catarina, C. Postal 476, Florianpolis, SC, 88040-900, e-mail:guerra@cca.ufsc.br

Florianpolis, maio de 2000

Tpicos PARTE 1 Apresentao I-Introduo s macromolculas: protenas e cidos nucleicos 1.1-Protenas 1.2-cidos nucleicos II-Replicao III-Transcrio IV-Traduo V-Mutao e reparo VI-Metilao VII-Regulao gnica PARTE 2 -Marcadores genticos 1-Marcadores morfolgicos 2-Marcadores protenas de sementes 3-Isoenzimas 4-RFLPs 5-RAPDs 6-Minissatlites 7-Microssatlites 8-AFLPs 9-SCAR 10-Anlise comparativa 11-Aplicaes dos marcadores moleculares 12-Bibliografia PARTE 3 1-Introduo 2-Transformao de plantas 3-Diferenas entre os mtodos de melhoramento convencionais e biotecnolgicos 4-Oportunidades 5-Evoluo do cultivo de plantas transgnicas 6-Limitaes 7-Biossegurana- Regulamentao 8-Determinao de risco 9-O caso da soja transgnica resistente ao herbicida glifosate 10-Implicaes econmicas 11-Percepo pblica PARTE 4 1-Direitos de proteo e patentes 2-Lei de proteo das cultivares 3-Lei dos acessos 4- Biodiversidade, Biotecnologia e Agricultura PARTE 5 Biotica Bibliografia

Pgina 3 4 4 5 11 12 14 15 16 16 21 21 21 21 25 27 28 29 29 31 32 32 36 41 41 42 44 45 46 47 49 50 52 53

APRESENTAO Esta apostila rene contedos bsicos de biologia celular e molecular e suas decorrentes aplicaes biotecnolgicas e outras tcnicas de uso frequente como marcadores moleculares e plantas transgnicas visando conhecer, conservar e melhorar a diversidade gentica existente. O objetivo desta apostila proporcionar ao estudante um conjunto de informaes bsicas e as aplicaes de algumas biotecnologias. Este conjunto de informaes se constitui no ponto de partida para estudos mais aprofundados. A biotecnologia em seu sentido mais amplo compreende a manipulao de microorganismos, plantas e animais, objetivando a obteno de processos e produtos de interesse. Desta maneira, toda atividade que envolva a aplicao dos conhecimentos de fisiologia, bioqumica e gentica, considerada como tcnica biotecnolgica. Em seu senso mais restrito a biotecnologia compreende a associao de tcnicas mais sofisticadas de biologia molecular e celular, engenharia gentica e manipulaes celulares in vitro. Para o CNPq, biotecnologia pode ser conceituada como a utilizao de sistemas celulares para a obteno de produtos e desenvolvimento de processos. A FAO (1989) conceitua biotecnologia como a aplicao dos princpios cientficos e de engenharia para o processamento de materiais por agentes biolgicos proporcionando produtos ou servios. Fernandes (1987) conceitua como o uso das tcnicas de regenerao in vitro e do DNA recombinante. As primeiras atitudes do governo brasileiro em relao s biotecnologias tiveram inicio em meados da dcada de 1980, quando tanto o CNPq quanto o MCT iniciaram o apoio formao de recursos humanos. Atualmente, o volume de recursos, o nmero de bolsas e o nmero de pesquisadores que trabalham com as biotecnologias na rea agrcola e florestal atingem valores inferiores a 10% em relao s demais reas de C&T no pais. Contudo, cada vez maior o nmero de pessoas envolvidas com as biotecnologias, as quais passam a ser utilizadas nas diversas disciplinas da rea biolgica. No estado de So Paulo, a FAPESP, a agncia de fomento a pesquisa do estado de So Paulo, financiou um projeto para o sequenciamento da bactria Xyllela fastidiosa, o agente causador da doena denominada de amarelinho em citrus. Outros programas de pesquisa em biotecnologia de plantas esto em progresso em caf, cacau, soja, milho, trigo e outras espcies de importncia econmica. A clonagem de mamferos, obtidas em 1997, desencadeou uma discusso no s no seio da comunidade cientfica, mas tambm em toda a sociedade sobre as implicaes do poder das biotecnologias. Em 1998, um grupo de4 pesquisadores da Coria do Sul advoga o feito de ter clonado um embrio humano. Toma corpo ento a Biotica, que discute o modo de ser (tica) da vida. A biotica pergunta-se sobre a legitimidade dos projetos de efeitos biotecnolgicos. Vrios agrnomos j esto desenvolvendo atividades na gerao de processos e produtos, utilizando estas tcnicas biotecnolgias. O mercado tende a uma expanso nos prximos anos. Alm dos conhecimentos tcnicos necessrios ao desempenho profissional, o Engenheiro Agrnomo tem um importante papel na discusso das questes relacionadas com as biotecnologias com a sociedade. A liberao da soja transgnica em setembro de 1998, resistente ao herbicida glifosate, constitui-se num marco da agricultura e exige que os profissionais formados tenham o conhecimento tcnico e cientfico no s para o correto manuseio destes organismos como tambm para participar das decises a respeito das mesmas. Miguel Pedro Guerra e Rubens Onofre Nodari

PARTE 1 I-INTRODUO S MACROMOLCULAS: PROTENAS E CIDOS NUCLEICOS 1.1-PROTENAS Ligaes peptdicas entre as pequenas molculas formam molculas grandes, as protenas. Protenas so cadeias de aminocidos (aa). A estrutura bsica composta de um esqueleto e de grupos laterais. Uma srie repetida de ligaes peptdicas entre o carbono de um aa e o nitrognio de outro aa formam o esqueleto, enquanto as ramificaes deste esqueleto so os aa. Devido a natureza da ligao peptdica, uma das extremidades da protena H2N, denominada de N-terminal, e na outra extremidade encontra-se COOH, que chamada de carboxi-terminal. Existem cerca de 20 aa, cada um com sua forma e constituio qumica caracterstica. Dependendo da composio, as protenas podem ter carga positiva, neutra ou negativa. Os aa lisina, arginina e histidina contribuem com carga positiva (denominados de bsicos) enquanto que o cido asprtico e o cido glutmico so carregados negativamente (denominados de cidos). Os demais 15 aa so neutros com relao a carga eltrica. Destes, os polares so: serina, treonina, tirosina, triptofano, asparigina, glutamina e cistena. Os demais apresentam propriedades hidrofbicas (no polar): alanina, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina e valina. Tais propriedades (polaridade e a hidrofobia) tambm so incorporadas s protenas. Os tipos de aa includos e principalmente a sua sequncia determinam a conformao tridimensional e portanto, as propriedades de todas as protenas. O tamanho de uma protena pode variar de alguns poucos at 30.000 aa. Trinta ou 40 aa so suficientes para proporcionar uma conformao terciria. A estabilidade das protenas representa um equilbrio entre a sua sntese e a sua degradao. Existe um processo contnuo de reposio (turnover) que pode ser caracterizado quando se conhece a meia-vida das protenas, ou seja o tempo necessrio para a renovao da metade da sua concentrao. A meia-vida das protenas pode variar de minutos a mais de 20 horas e sua degradao catalisada por enzimas proteolticas. Exemplos: protenas com Nterminal arginina - 2 min; lisina, leucina e fenilalanina - 3 min; prolina - 7 min; tirosina e glutamina - 10 min. Na maioria das vezes as protenas para exercerem suas funes devem sofrer modificaes, como fosforilao, glicosilao ou metilao. No processo de fosforilao adicionado protena um grupo fosfato pelas kinases, tonando-se fosfoprotenas. A metilao ou acetilao consiste na incorporao de um metil ou acetil protena pelas metilases ou acetilases, respectivamente. A incorporao de carboidratos numa cadeia protica denomina-se glicosilao, origina as molculas denominadas de glicoprotenas. Enzima a denominao de uma protena quanto esta apresenta a habilidade de acelerar uma reao fazendo ou quebrando uma ligao (covalente) especfica. Para o exerccio desta funo, as protenas devem apresentar a conformao terciria ou quaternria. A conformao quaternria na realidade a agregao de duas ou mais sub-unidades, que nesta condio proporcionam a funo catalisadora uma protena enzima. Exemplo: Rubisco ou ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase se torna uma enzima quando oito sub-unidades se agrupam, quatro delas codificadas por genes nucleares e as outras quatro por genes do cloroplasto. A Rubisco responsvel pela incluso de CO2 numa cadeia de carbono (1 etapa no ciclo de Calvin). Tratando-se de enzimas, nem todos os aa participam da reao cataltica. Existe um stio ativo responsvel pela catlise. Este stio ativo ento um conjunto de aa

denominado de motivo ou domain. A domain pode ser entendida como a unidade funcional de uma protena, um regio relativamente independente da protena. Nas interaes com outras protenas ou cidos nucleicos apenas uma parte da protena, o motivo (ou domain), responsvel pela funo. Quando diferentes protenas desempenham funes semelhantes, constituem uma famlia de protenas. A mesma seqncia formadora de uma determinada domain pode se encontrada em vrias protenas de espcies diferentes. Aparentemente, durante a evoluo a domain se moveu dentro da sequncia linear de aminocidos sem perder sua funo e especificidade de ligao. Estas domains variam quanto ao nmero de aa: 18 no Colgeno, mais de 250 aa Fibrinognio. Freqentemente, as domains podem se repetir (at mais de 30) numa mesma protena, neste caso denominadas de motivo (motif) sendo que nem todas as repeties so exatamente idnticas. Estas duplicaes provavelmente so devido a existncia de elementos mveis ou transformao. As duplicaes tm provocado a elongao de muitas protenas. Estimativas admitem a existncia de mais de 50 mil tipos de protenas numa espcie eucariota. As primeiras tcnicas de separao de macromolculas, foram desenvolvidas na dcada de 40. Nesta poca foi desenvolvido os sistemas de cromatografia que permitem a separao das fraes polares das no polares com base na solubilidade das diferentes molculas. De acordo com este princpio, um solvente no polar move-se carregando solutos com ele. As substncias migram a diferentes distncias de acordo com a sua solubilidade no solvente. Atualmente existem uma dezena de diferentes tcnicas de cromatografia, que possibilitam inclusive a identificao de molculas presentes numa mistura. Nos anos 80 foi descoberto que algumas doenas (desordens degenerativas) poderiam ser causadas por agentes infecciosos formados apenas por protenas. Estas protenas foram denominados de prons ('proteinaceous infections particles'). O pron uma forma alterada da protena PrP que normalmente est presente no crebro de vertebrados. Estas desordens degenerativas ocorrem com freqncia em animais e muito raro na espcie humana. O sequenciamento de protenas uma tcnica, desenvolvida por (Sanger, 1950), com a finalidade de conhecer a seqncia dos aa numa protena. As implicaes desta descoberta so inmeras. A mais importante se relaciona com a sade humana, pois a tcnica permitiu a identificao de inmeras doenas. Mutaes a nvel de DNA podem provocar a substituio de um aa por outro numa determinada posio da seqncia de uma protena e dependendo da posio a protena perde sua funo, causando ento uma doena. Outra conseqncia foi a possibilidade de inferncia da seqncia de bases a nvel de DNA que codifica para as protenas sequenciadas. Isto permitiu o isolamento e a clonagem dos primeiros genes. Mais tarde, o prprio Sanger desenvolveu um mtodo de sequenciamento de DNA. Por esta contribuio cincia, Sanger foi agraciado com um segundo prmio Nobel.

1.2-CIDOS NUCLEICOS 1.2.1-cido desoxirribonucleico - DNA As molculas de DNA tm estrutura em forma de dupla hlice, semelhante a de uma escada retorcida. Cada fita formada por uma seqncia de nucleotdeos (dNTP). Cada dNTP composto de uma base nitrogenada ligadas a uma molcula de acar (desoxirribose) e um grupo fosfato. As bases nitrogenadas ligadas a desoxirribose so quatro: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Uma ligao fosfodister unindo o grupo fosfato de um dNTP e o acar desoxirribose de outro dNTP forma o esqueleto da fita (strand), como se fosse uma das laterais da escada. A outra fita (ou a outra lateral da escada) formada da mesma maneira, mas

com orientao da ligao fosfodister contrria, o que impe a caracterstica de antiparalelismo as duas fitas. Cada fita tem uma orientao (5'-3') em funo da natureza da ligao fosfodister entre o carbono 3' e o 5' da desoxirribose, sendo que um nucleotdeo s pode ser includo na cadeia atravs da ligao do fosfato com o carbono 3'OH da desorribose. Por isto, a orientao da cadeia 5'-3', pois haver sempre o carbono 3' numa das extremidade da fita. Mais do que isto, estas duas fitas so complementares j que quando existir adenina de um lado, somente timina encontrada na mesma posio na outra fita. O mesmo acontece com citosina e guanina. So estes os dois nicos tipos complementao de bases nitrogenadas possveis no DNA. Como conseqncia o nmero de adeninas ser igual ao nmero de timinas num organismo. O mesmo vale para C e G. Entretanto a quantidade de purinas (A e G) caracterstica de cada espcie. Assim a proporo entre A e G de 0,7 em Bacillus, 1,56 no homem e 1,7 em Saccharomyces cereviseae. Isto conhecido como regra de Chargaff. Entre as bases nitrogenadas existem pontes de hidrognio, duas entre A e T e trs entre C e G. Tais pontes juntamente com outras foras, mantm as duas fitas unidas. Cada par de base anlogo a um degrau desta escada. O DNA funciona como um modelo para a sntese de novas fitas de DNA. O DNA a molcula responsvel pelo armazenamento e perpetuao do cdigo gentico. Apesar da ocorrncia de 3 tipos de DNAs ('A', 'Z', 'B'), aparentemente desempenham a mesma funo. A prova definitiva de que o DNA a molcula repositrio do cdigo gentico foi obtida em 1952 por Hershey e Chase. Experimentalmente adicionou-se 32P numa colnia de bactrias infectadas por vrus, neste caso o fsforo radioativo foi incorporado no DNA, j que pouco ou quase nenhum fsforo encontrado nas protenas. Num experimento paralelo, foi feita a adio do istopo 35S, que pode marcar radioativamente as protenas, j que estas tm enxofre, mas no marca o DNA, pois este no contm enxofre. Como s o 32P foi detectado nas prognies dos vrus, conclui-se que o DNA passava de gerao a gerao. Na realidade, oito anos antes, outros trs cientistas (Avery, MacLead e McCarty) haviam postulado que o agente transformador (possivelmente o DNA) era destrudo pela desorribonuclease pancretica que por sua vez no afetava as protenas. A quantidade de DNA pode variar de 103 a 1013 nucleotdeos. Esta quantidade de DNA por clula haplide denominada de valor C. So aproximadamente 3 bilhes de pares de bases no ncleo de cada clula humana. Entretanto podem ser apenas 5387 no vrus x174. A maioria das plantas tem uma quantidade de DNA que varia entre 109 a 1011. Nos mamferos existem de 109 a 1010 pares de bases; j alguns peixes ou anfbios podem ter at 1013 pares de bases. muito DNA para pouca funo (paradoxo do valor C). Enquanto nos procariotos praticamente quase todo o DNA carrega informaes necessrias para a sntese de protenas e RNAs, a maior parte da seqncia de bases dos eucariotos no codifica para produto algum. Assim apenas 3% (aproximadamente) do genoma humano formado por genes (estimados em mais de 50 mil) sendo que a funo do restante ainda no est suficientemente compreendida. A maior parte deste DNA sem funo conhecida composto por seqncias repetidas, de onde se originou o nome de DNA repetitivo (selfish, nos anos 80). Quando esticado uma molcula de DNA de qualquer clula humana mediria 1,80 m e teria a espessura de um trilionsimo de um centmetro (1 micrmetro = 1 milsimo de milmetro). Uma clula humana no comportaria tal estrutura. Dentro de uma clula as molculas de DNA esto ligadas a protenas e so retorcidas ou enroladas (supercoil). Quando completamente compactadas so possveis de serem visualizadas no microscpio tico e recebem a denominao de cromossomos. A compactao pode alcanar um fator de 7000 vezes. Vrus e

bactrias contm apenas um cromossomo. J os eucariotos (fungos, plantas, animais) tm dois ou mais cromossomos que em geral, variam de tamanho. Genoma e gene A seqncia de pares de bases que formam o DNA pode ser chamado de genoma. A forma do genoma pode ser circular como nos vrus, bactrias, mitocndria, cloroplasto e plasmdeos ou linear como nos cromossomos dos organismos eucariotos e alguns procariotos. O genoma da maioria absoluta dos organismos de DNA. Poucos vrus so de RNA, como Influenza, HIV, TMV, poliomielite. A grande maioria tambm apresenta fita dupla. Exceo a alguns vrus como (x174, M13 e f1, cujos genomas so constitudos de apenas uma fita de DNA. As caractersticas de um indivduo como a cor dos olhos ou da pele so determinadas por um conjunto limitado de pares de bases contidas no DNA (ou no RNA, como j mencionado, trecho este, denominado de gene. O conceito de gene evoluiu tanto quanto a biologia. Uma das primeiras observaes sobre o tema foi feita por Leonardo da Vinci. Observando a cor dos filhos de mulheres brancas com homens pretos, ele sugeriu que a semente da me tinha o mesmo vigor que a do pai (Wallace, 1992). Mas foi Mendel em 1865 quem utilizou pela primeira vez a expresso fator para os componentes hereditrios parentais responsveis pelas caractersticas nas prognies. S mais tarde (1908), Johannsen sugeriu o termo gene para designar os fatores hereditrios. Por gene entende-se a unidade de herana. Contudo, os diferentes textos de gentica apresentam diferentes conceitos para gene. Segundo a maioria dos autores, o principal atributo do gene sua relao com a protena que codifica. Neste caso, define-se gene como sendo um segmento de DNA, que atravs da intermediao de uma molcula mensageira de RNA, responsvel pela especificao de uma cadeia peptdica (Wallace, 1992). Entretanto, outros geneticistas incluem, alm das protenas, os RNAs como produtos gnicos. Neste caso, a definio de gene um segmento de DNA responsvel pela produo de um produto difusvel (Lewin, 1994). Como um significativo grupo de RNAs exerce funes outras que a de mensageiro, como por exemplo a regulao gnica, o segundo conceito de gene mais realista. Por se tratar de uma sequncia de DNA, um gene pode ocorrer sob mais que uma alternativa ou alelo. Desta forma, basta uma alterao na sequncia de bases que cause uma mudana no produto, para que se configure uma alternativa (alelo) diferente. Para simplicidade, normalmente utiliza-se um modelo bsico de um gene com dois possveis alelos, j que a maioria dos seres vivos so diplides, portanto, carregam dois alelos (um em cada cromossomo homlogo) para o mesmo gene. Mas na realidade, um gene pode ter muitas alternativas. Evidentemente que num indivduo diplide s ocorrem uma ou duas formas no mximo. Mas diferentes indivduos podem apresentar formas allicas diferentes uns dos outros. Um dos exemplo mais conhecido trata-se do tipo sanguneo, sendo que numa populao de indivduos podem ser encontrados quatro diferentes alelos. Sequenciamento de cidos nucleicos O sequenciamento consiste na identificao ordenada dos nucleotdeos que compem um fragmento de DNA ou RNA. Existem duas tcnicas que so utilizadas normalmente em laboratrios. Por outro lado, nos ltimos anos foram desenvolvidos equipamentos sequenciadores de alta velocidade e que esto sendo utilizados no sequenciamento de espcies procariotas (bactrias) e eucariotas (fungos, vegetais e animais, incluindo Homo sapiens. Conhecer a sequncia de bases dos genomas das espcies tem sido um dos objetivos dos bilogos. A sequncia completa de vrios vrus j conhecida h bastante tempo, devido ao fato do pequeno nmero de nucleotdeos participantes de seus genomas. Em 1995 foi finalizado

o sequenciamento do genoma das duas primeiras bactrias pelo 'The Institute for Genomic Research' (TIGR http://www.tigr.org/tdb/): Haemophilus influenzae e Mycoplasma genitalium. A primeira delas, que causa a inflamao no ouvido, tem aproximadamente 1,8 milho de pares de bases e aproximadamente 1700 genes. A segunda que apenas 570 genes, est associada s infees reprodutivas. O sequenciamento do organismo deve contribuir para o desenvolvimento de vacinas ou outras estratgias de combate a doena causada por aquela bactria. Alm disso, o sequenciamento do Saccharomyces cerevisae, iniciado em 1989, foi concludo em junho de 1996, resultante de um projeto feito em parceria por um grupo de pesquisadores de vrios pases europeus. Esta levedura, alm de ser utilizada como modelo gentico para estudos em espcies eucariotas, utilizada na produo de bebidas fermentadas. O sequenciamento desta levedura um marco histrico, pois foi o primeiro organismo eucarioto a ter seus genes totalmente inventariados. Brevemente, sero conhecidas a maioria das sequncias de nucleotdeos de vrias espcies vegetais e animais de importncia econmica e cientfica.

Tabela 1. Nmero de genes e tamanho do genoma de espcies parcial ou totalmente sequenciadas. Espcie Em milhes de pares de Nmero de genes bases Eubacteria 0,580 482* Mycoplasma genitalium 0,910 853* Borrelia burgdorferi 1,042 894* Chlamydia trachomatis 1,138 1.041* Treponema pallidum 1,111 834* Rickettsia prowazekii 1,551 1.512* Aquifex aeolicus 1,677 1.590* Helicobacter pylori 1,641 1654* Campylobacter jejuni 1,830 1.740* Haemophilus influenzae 2,679 2.656* Xylella fastidiosa 2,184 2.121 Neisseria meningitidis Z2491 2,272 2.158 Neisseria meningitidis A MC58 3,284 3.187* Deinococcus radiodurans 4,214 4.100* Bacillus subtilis 4,639 4.307* Escherichia coli Archaea Archaeoglobus fulgidus 2,178 2.436* Eukarya 12,5 6.034* Saccharomyces cerevisae 97 19.099* Caenorhabditis elegans 120 21.000** Arabidopsis thaliana 180 13.600** Drosofhila melonogaster 430 30.000** Oryza sativa 760 30.000 Sorghum bicolor 2.000 30.000** Zea mays 3.000 100.000** Homo sapiens 16.000 30.000 Triticum aestivum 30.000 ? ** Plamodium falciparum

*J sequenciados (Science 270, 276, 277, 281, 282, 286, 287; Nature 387, 390,391, 392, 396,397, 400, 403, 404); ** Sequenciados parcialmente.

O principal projeto no Brasil nesta rea o sequenciamento da bactria Xyllela fastidiosa que causa uma doena no citrus chamada de amarelinho. O referido projeto foi iniciado em 1997 e tem um oramento de 14 milhes de dlares, financiado pela FAPESP, que a Fundao de Amparo a Pesquisa do Estado de So Paulo. O nmero de espcies j totalmente sequenciadas cresce ano a ano e vrias espcies vegetais e animais esto sendo sequenciadas, entre elas, arroz, milho, soja, boi e porco. Enquanto nos procariotos, a densidade mdia de genes de 1 gene a cada 1000 pb aproximadamente, nos eucariotos de 1 gene a cada 2000 pb nas leveduras, 1 gene em 5000 pb nos nematides e 1 gene a cada 4800 pb em Arabidopsis. A maior quantidade de DNA pode ser parcialmente explicada pelo fato de que, nos eucariotos a parte regulatria dos genes muito maior que nos procariotos. Alm disso, nos eucariotos existem sequncias repetidas, que so ausentes nos procariotos. Embora se saiba o nmero de genes dos organismos sequenciados, ainda no se conhece as funes de 40 a 60% dos genes, dependendo da espcie. O conhecimento da sequncia de bases de um genoma permite aos bilogos o entendimento do funcionamento dos organismos, as funes dos genes, que tipo, tamanho, quantidade e caractersticas das protenas formadas. A maior parte das espcies de bactrias j sequenciadas causam doenas espcie humana. A razo principal para se conhecer sua sequncia relaciona-se com a possibilidade do seu controle, via desenvolvimento de vacinas ou outros medicamentos. As plantas so a base da vida na terra. Contudo, pouco se conhece de seu genoma. O genoma das angiospermas altamente varivel, mas ainda praticamente desconhecido. Desconhecemos tambm o nmero de espcies e o nmero de genes em cada espcie. Na verdade, ainda no conhecido o nmero de cromossomos de mais de 70% das espcies vegetais. O valor C de DNA s conhecido em 1% das espcies. Desta forma, o projeto genoma de fundamental importncia para o aprofundamento do conhecimento das plantas, domesticadas ou no. O sequenciamento completo do genoma humano (estimado em 3 bilhes de pares de bases) dever revolucionar a medicina e poder auxiliar na cura para as mais de 3000 doenas hereditrias que atingem a raa humana. Iniciado em 1985, o sequenciamento do genoma humano que rene cientistas e laboratrios dos Estados Unidos, Canad, Japo, Inglaterra, Frana, Rssia, Itlia, Austrlia e Brasil entre outros, dever ser completado bem antes da data prevista (2005). Em fins de 1999, j havia sido sequenciado, aproximadamente 10% do genoma. Quando ficar pronto, o arquivo necessrio ao armazenamento das informaes dever ser equivalente a 200 listas telefnicas com mil pginas cada uma. O GenBank (USA) e o DNA Database (Japo) j dispem de informaes de mapeamento e sequenciamento de mais de 2500 diferentes organismos. Mapas fsico e de ligao tm sido divulgados a cada ano com maior resoluo. Tais mapas facilitaro a clonagem de genes humanos, como aqueles envolvidos com as doenas, a obesidade, etc. Introns e exons Foi descoberto nos anos 70 a presena de seqncias presentes no DNA mas no no RNA mensageiro, produto da transcrio do DNA. Tais seqncias foram denominadas de introns (intervening sequences) e esto intercaladas com os exons (expressed sequences), que so as regies codificadoras dos genes. A remoo dos introns feita por enzimas e faz parte do

processamento que sofre o pr-mRNA antes de sair do ncleo. A presena de introns ou sequncias intervenientes sugere uma maior oportunidade para recombinaes e maior acmulo de mutaes. Introns so comuns nos eucariotos e raramente encontrado nos procariotos. Quando o intron que faz o processamento, ele se regenera no final do processo. Neste caso, o intron seria uma enzima, proporcionando ao RNA a funo de catlise. Nas bactrias ainda no foram detectados introns. Uma das hiptese de que as bactrias perderam os introns durante a evoluo. Neste caso os introns teriam se originado no incio da vida. Outra hiptese admite que os introns surgiram com os eucariotos. Na realidade, ainda no se sabe exatamente como os introns surgiram, nem tampouco se apareceram logo no incio da vida ou surgiram mais recentemente. Embora tenham caractersticas similares, os introns so muito diversos quanto ao tamanho, processamento e funes. Certos introns, em especial os do chamado grupo I, comuns em genomas de organelas celulares (como a mitocndria) e em alguns genes do ncleo (como o rRNA), apresentam caractersticas especiais. Eles prprios realizam sua remoo do pr-mRNA (autocatlise) e ligam os exons, fenmeno denominado self-splicing. Alguns introns desse grupo so elementos mveis (transposons), capazes de se transferir em cruzamentos genticos para alelos que no os continham, pelo processo denominado homing, iniciado com o corte do DNA por uma endonuclease, enzima codificada pelo prprio intron. Outros introns do grupo I codificam cofatores proticos, como as maturases. So poucos os casos conhecidos em que um mesmo produto desse tipo de intron realiza ambas as funes - de endonuclease e de maturase. J so conhecidos casos de transferncia de introns do grupo I entre indivduos da mesma espcie (transferncia vertical). Nesse caso, um intron passa de um alelo para outro que no o continha. Tambm j foi constatado que introns desse grupo presentes no genoma das mitocndrias podem passar de uma espcie para outra (transferncia horizontal, ou lateral), mas dentro do mesmo filo. A transferncia lateral, entre organismos que no se acasalam sexualmente, foi objeto de profundo estudo de Yangrae Cho e colaboradores, publicado em novembro de 1998. O estudo envolveu um intron do grupo I do genoma mitocondrial de plantas vasculares, bastante conhecido e localizado no gene cox1 da erva Peperomia polybotrya, que teria sido adquirido de um fungo, por transferncia lateral. Analisando o DNA de 335 plantas de diferentes gneros, os autores verificaram que esse intron est amplamente disseminado nos genes cox1 das angiospermas. O intron estudado est presente em 48 gneros diferentes, a partir de 32 eventos independentes de transferncia lateral. A concluso sobre as transferncias baseia-se em trs pontos principais: a presena constante do gene cox1 e espordica do intron, a incongruncia entre as filogenias (histrias evolucionrias) das espcies e dos introns e a co-converso (Coconverso quando parte das extremidades de um segmento de DNA 3 a 18 pb -, aps o processo de recombinao/reparo, convertida sequncia do DNA doador ou invasor. Assim, o DNA da espcie recipiente parcialmente degradado e uma nova sequncia sintetizada com base no molde do DNA da espcie doadora. Desta forma, a converso deixa um rastro, pois a sequncia original alterada.) das seqncias prximas do local de insero do intron. O primeiro ponto indica que o gene cox1 se disseminou com alta freqncia e manteve-se nas espcies que o receberam, enquanto o intron foi perdido na maioria dos casos. O segundo demonstra que a transferncia independe do grau de parentesco entre as diferentes plantas. E o ltimo -- a divergncia gentica das regies que flanqueiam a insero do intron -- revela que a transferncia se d via recombinao/reparo e catalisada por uma endonuclease. Esse processo, conhecido como homing, exatamente o que esse tipo de intron promove.

Os resultados geram vrias preocupaes. Entre as dvidas principais esto a causa da extraordinria invaso desse intron, os passos do processo de transferncia em nvel celular e o caminho evolutivo da disperso do intron do grupo I do gene cox1 entre as angiospermas. Entre as implicaes, a mais importante est ligada freqncia com que o DNA transferido de uma espcie a outra. A transmisso planta a planta requer acasalamento sexual ou a ajuda de vetores (vrus, bactrias, insetos e outros). A questo bastante atual, j que muitas plantas transgnicas esto sendo liberadas para cultivo. O trabalho de Cho e colegas demonstra claramente que a transferncia horizontal ocorre e mais freqente do que se imagina. Isso torna imperativo estudar o fluxo gnico entre plantas transgnicas e espcies afins, antes de sua liberao para cultivo, para testar a possibilidade de uma irradiao de genes, que podem ser desejveis em uma espcie mas completamente indesejveis em outras. A probabilidade desta irradiao aumenta com o aumento do cultivo destas plantas, principalmente no sistema de monocultura. Num dado momento, um mesmo gene poder estar presente em milhes de plantas, aumentando o risco da transferncia horizontal.

1.2.2-cido ribonucleico - RNA Apesar de ser tambm um cido nucleco, o RNA tm muitas diferenas em relao ao DNA. Em primeiro lugar, todos os RNAs so formados por apenas uma fita. Entretanto, pode apresentar uma configurao denominada de secundria, quando ocorre o pareamento entre bases complementares. Ao invs de desoxirribose como no DNA, o acar do RNA uma ribose (uma oxidrila a mais em relao a desoxirribose do DNA). A terceira principal diferena a presena de uracil (U) ao invs de timina (T). Podem ocorrer pelo menos quatro tipos de RNA: mRNA (1-3%), rRNA (>90%), tRNA (1-2%) e sRNA (?%), denominados de mensageiro, ribossomal, transportador e small RNAs, respectivamente. Cada um deles desempenha funes especficas. Dentro do ltimo grupo, so includos um grande grupo de RNAs, muitos dos quais ainda sem funo conhecida. Outros esto envolvidos na regulao gnica. Alm das funes de mensageiro entre o DNA e os ribossomos, formador dos ribossomos, e transportador de aminocidos, os RNAs podem ainda desempenhar a funo de catlise e de regulao gnica. A funo de catlise (at ento exclusividade das protenas) foi descoberta na dcada passada e os RNAs que tm esta habilidade, as ribozimas, realizam a separao do RNA transcrito em vrias partes, fenmeno que se chama de splicing. O autoprocessamento do RNA no idntico catlise enzimtica executada pelas protenas. Numa reao enzimtica, a protena se envolve mas liberada intacta ao final do processo. No caso do autoprocessamento, o pr-RNA se processa a si prprio, sem a presena de enzimas, mas no se regenera no fim do processo. Portanto, o pr-RNA no uma enzima, mas tem a propriedade de catlise. Alm disso, foi verificado experimentalmente que o RNA tem a capacidade de retirar bases de um segmento de RNA e adicion-las em outro, demonstrando a capacidade de sintetizar algo semelhante a si prprio. mRNA Resultam da transcrio de um gene. So os RNA mensageiros (mRNA), aqueles que sero decodificados pelos ribossomos e contm informaes para a produo de uma protena. O tamanho dos mRNAs varivel, dependendo do nmero de bases contidas no gene transcrito. Como contm uma mensagem, diz-se que existe uma colinearidade entre as bases do mRNA e a sequncia de aminocidos da protena resultante de sua decodificao. O tempo de vida de

um mRNA muito pequeno. Na maioria dos procariotos a meia vida de um mRNA no ultrapassa 2 minutos. J nos eucariotos, alguns mRNAs duram algumas horas.

rRNA O RNA ribossomal (rRNA) tambm resultante da transcrio de genes de uma regio do DNA, neste caso denominada de rDNA. O produto da transcrio no decodificada, pois os prprios RNAs produzidos juntamente com protenas vo formar os ribossomos e executar a funo especfica, que a produo de protenas. Participam da formao do ribossomo de um procarioto trs rRNAs: o 5S rRNA com 120 nucleotdeos, o 16S rRNA com 1542 nucleotdeos e o 23S rRNA com 2904 nucleotdeos. Nos eucariotos, estes rRNAs so um pouco maiores e designados de o 5S rRNA, o 18S rRNA e o 28S rRNA. Entretanto, nem todos os eucariotos tm os rRNAs do mesmo tamanho. tRNA Denominada de adaptadores por Francis Crick, o tRNA (RNA transportador) um RNA que tem a funo especfica de transportar os aminocidos at o ribossomo durante a sntese de uma protena. So molculas relativamente pequenas, contendo de 73 a 93 nucleotdeos. Dos cidos nucleicos conhecidos, o tRNA o nico que apresenta algumas bases que no A, C, G e T. Numa clula existem pelo menos tantos tRNAs quanto so os aminocidos, e estes esto ligados ao tRNA na extremidade 3'OH. A estrutura tridimensional de um tRNA assemelha-se a uma folha de trevo, contendo numa das alas (loop ou hairpin) o anticodon, que uma seqncia de trs bases. Outros RNAs Existem outros RNAs, muitos deles transcritos e que permanecem no ncleo da clula sem funo aparente (hnRNA). Outros RNAs, de cadeia curta, chamados de snRNA, esto envolvidos na regulao gnica. Mais recentemente, descobriu-se que alguns RNAs podem se deslocar de suas clulas e desempenhar uma atividade em outra clula, provavelmente regulatria.

1.2.3-cido peptdeo nucleico (PNA) Esta nova molcula, criada em 1991 em laboratrio, tm as quatro bases nitrogenadas do DNA ou RNA ligadas ao esqueleto de uma protena. Este novo composto sinttico alm de ser mais estvel nas clulas que o DNA e o RNA, se liga naturalmente a estes com uma intensidade 50 a 100 vezes mais forte que os prprios cidos nucleicos naturais o fazem entre si. Quando se liga ao DNA, forma uma estrutura de trs fitas. Isto permite o uso destas molculas na terapia gnica, pois pode provocar a indisponibilidade daquela regio genmica ser acessada por enzimas e protenas. Neste caso, poderia ser utilizado um PNA para se ligar a um gene defeituoso que, ento, deixaria de expressar uma protena defeituosa. Os PNAs podem procurar e se ligar a outra fita com seqncia complementar de bases, estratgia similar ao antisenso. O PNA construdo ligando-se cada base nitrogenada a um peptdeo ao invs de um acar e um grupo fosfato. Como a cadeia de peptdeos tm carga eltrica neutra, os PNAs apresentam uma grande capacidade de ligao, eliminando a repulso criada pela carga eltrica negativa devido a presena dos grupos fosfatos presentes no DNA e RNA. Alm disso, os PNAs

podem atacar genes invadindo a dupla hlice, algo que DNA e RNA no conseguem. Mais ainda, a qumica de peptdeos simples e mais barata que sintetizar cidos nucleicos. Este produto da biotecnologia poder ser aplicado na sade humana. O principal argumento da utilizao dos PNAs em diagnstico, decorre do fato da grande afinidade com o alvo; quanto maior a afinidade, maior a possibilidade de ligao com seqncias especficas e consequentemente, a sua marcao. Mas como a molcula artificial, ainda no se conhece ainda a sua toxicidade.

1.2.4-cidos nucleicos e a origem da vida Como capaz de armazenar o cdigo gentico em alguns vrus, tem a funo cataltica e de regulao gnica, o RNA passou a ser admitido (hiptese) como a provvel molcula que poderia ter originado a vida a partir do 'caldo primitivo'. Esta teoria tem recebido contribuies cientficas por uma grande quantidade de cientistas do mundo inteiro. Duplicando RNAs semelhantes como os RNAs ribossomais e participando da produo das protenas, o RNA um forte candidato a ser a estrutura do primeiro ser vivo na face da Terra. A funo cataltica, entendida aqui como sendo a capacidade de quebrar e ligar outros RNAs, j foi comprovada. H tambm resultados de pesquisa que atribuem ao RNA a capacidade de editorao, um sistema simplificado do sistema de reparo do DNA. Os vrus que possuem RNA como material gentico necessitam da enzima transcriptase reversa para produzir DNA e ento se replicarem. Quando se provar que o RNA tem ou teve capacidade de autoduplicao, ser dado um passo importante favorvel a hiptese do 'Mundo do RNA'. Nenhuma outra molcula teria a capacidade e a versatilidade de desempenhar tantas funes como o RNA no 'caldo primitivo'. Outra hiptese considera uma molcula mais simples, precursora do RNA, composta de um cido nucleico ligado a peptdeos (denominada de PNA). Alguns cientistas no concordam com estas hipteses por considerarem que as molculas de RNA so muito complexas para ter tido origem no ambiente primitivo terrestre, onde s havia gua, gs carbnico, nitrognio e radiao ultravioleta. Alm disso, no 'caldo primitivo' deveriam existir substncias muitos txicas. Em contrapartida, admitem que sob as condies primitivas, a estrutura cristalogrfica dos minerais seria capaz de reduzir dixido de carbono para formar aldedos e a partir destes se formariam acares e molculas orgnicas essenciais. A transferncia de eltrons de uma molcula outra poderia ter contribudo para as transformaes metablicas. Recentemente, cientistas obtiveram molculas de RNA mais complexas quando utilizaram uma mistura de pequenas molculas de RNA sob condies de altas temperaturas, situao que deve ter ocorrido na poca do surgimento da vida. Outra possibilidade da origem da vida seria via metablitos secundrios. Tais metablitos, no atual estgio evolutivo considerados secundrios, teriam sido relevantes no perodo prbitico como integrantes do metabolismo primrio responsvel pela sntese dos cidos ncleicos e traduo e replicao. De qualquer forma, a hiptese de maior consenso a de que o RNA teria sido o primeiro material gentico sobre o qual a evoluo agiu, resultando numa quantidade enorme de formas de vida que se conhecem atualmente.

II-REPLICAO (Replication) O DNA funciona como um modelo para a sntese de novas fitas de DNA de maneira semiconservativa, ou seja, cada uma das duas molculas filhas tem uma fita da molcula me e outra recm sintetizada. A replicao ocorre bidirecionalmente a partir de uma (procariotos) ou

vrias (eucariotos) origens. A replicao precisa (alta fidelidade), ou seja, a maioria dos erros so corrigidos. Cabe a replicao o desafio maior de perpetuar, com alta fidelidade, um genoma e ao mesmo tempo permitir erros que originam a variabilidade necessria para a evoluo. A origem de replicao uma regio do DNA que contm uma seqncia de bases especfica. Nas bactrias s existe uma destas seqncias. A rigor, a replicao completa do cromossomo de uma bactria depende da iniciao nesta seqncia. Neste caso, dito que as bactrias tem apenas um replicon. Replicon a unidade de DNA no qual a replicao ocorre a partir de uma origem. J os eucariotos, por terem genomas bem maiores que as bactrias e mais de um cromossomo, tm vrias origens de replicao. Nas leveduras (ex: Saccharomyces cerevisiae) existem pelo menos umas 500 origens de replicao, denominadas de ARS (Autonomously Replicating Sequences); ou seja, 500 replicons. Na Drosophila melanogaster existem cerca de 3.500 replicons. J na Vicia faba estima-se a presena de pelo menos 35.000 replicons. As origens de replicao dos eucariotos so ativados em diferentes tempos durante o perodo de replicao do ciclo celular (fase S da mitose). Estas origens de replicao esto espaadas em mdia de 50 a 100 kb. A velocidade de replicao em Escherichia coli, a bactria residente no intestino de todas as pessoas, chega alcanar 50.000 bases por minuto. Nos eucariotos, o movimento do garfo de replicao pelo menos 10 vezes mais lento. Os vrus apresentam um modo de replicao especfico denominado de crculo rolando (rolling circle). Um vez iniciada a replicao, o genoma circular vai sendo replicado indefinidamente. Posteriormente uma enzima produzida pelo prprio genoma viral, corta a longa cadeia produzida em partes iguais, cada uma contendo uma cpia do genoma do vrus, a ser subseqentemente encapsulada. Mais de 20 enzimas atuam diretamente no processo de replicao das bactrias. As principais protenas envolvidas e sua funo na replicao so apresentadas abaixo: toposisomerases - desenovelam o DNA helicases - separam as duas fitas Single strand binding proteins (SSB) - protegem o DNA na forma de fita simples Primase - adiciona os primers ou iniciadores DNA polimerase III - polimeriza, i.., adiciona os dNTP no sentido 5'-3' DNA polimerase I - substitui os iniciadores de RNA por bases do DNA; tambm tem a funo de reparo ligase - une os dNTP de dois fragmentos. Nos procariotos, alm destas duas polimerases, existe uma terceira, a DNA polimerase II, cuja funo ainda desconhecida. Das trs, somente a DNA Pol I apresenta a funo de edio ou seja, de correo dos possveis erros de replicao. A DNA Pol I formada por vrias subunidades. O agrupamento de algumas delas forma o que se conhece por fragmento Klenow, utilizado para replicao do DNA in vitro. Este fragmento no tem a habilidade de edio como a enzima completa, pode ser comprado de vrios fornecedores e usado em laboratrios. A DNA Pol III formada por sete sub-unidades ou polipetdeos. Nos eucariotos tambm existem trs polimerases. Duas delas atuam no ncleo, sendo que a DNA Pol teria a mesma funo que a DNA pol III dos procariotos. A DNA Pol teria a funo de reparo. A terceira polimerase (DNA Pol ) especfica para a replicao do genoma das mitocndrias. A replicao dos genomas dos retrovrus, que so codificados por RNA, feita pela transcritpase reversa (RT), o que pode produzir inmeros variantes. O conhecimento da natureza molecular destes vrus permite a criao de estratgias para combat-los. Molculas ribozimas

de RNA, foram engenheiradas e podem ser introduzidas nos hospedeiros para procurar e destruir o genoma do HIV, cortando-os em dois. O avano no conhecimento cientfico sobre a replicao foi de fundamental importncia no desenvolvimento da reao da polimerizao em cadeia (PCR), uma das tcnicas moleculares mais utilizadas no momento. III-TRANSCRIO (Transcription) Transcrio o processo pelo qual uma regio do DNA transcrita resultando num RNA. Existem dois grandes grupos de RNAs: (i) os RNA mensageiros (mRNA), aqueles que sero decodificados pelos ribossomos e contm informaes para a produo de uma protena e (ii) o outro grupo de RNAs, formado pela transcrio de determinadas regies genmicas e que permanecem como RNA para executar uma funo especfica. Entre eles esto o transportador (tRNA), o ribossomal (rRNA) que juntamente com protenas forma os ribossomos e outros RNAs (snRNA, hnRNA, etc.) com funo na regulao gnica ou desconhecida. A regio (segmento) do DNA transcrita a parte estrutural do gene. A transcrio nos procariotos feita pela RNA polimerase. Numa E. coli podem existir at 3.000 cpias dela. Esta enzima usa o DNA como molde e sintetiza uma cadeia de nucleotdeos de RNA complementar ao molde. Aparentemente no h conferncia do produto transcrito. Se no DNA esto A, C, G e T, vai aparecer no mRNA U, G, C e A, respectivamente. A exemplo da replicao, a transcrio ocorre na direo 5'-3'. Seis peptdeos ou sub-unidades fazem parte da RNA pol ('2). A rigor o fator tem a habilidade de reconhecer o promotor, que a regio 5', situada imediatamente anterior ao incio da parte codificadora (ou estrutural) do gene. Posteriormente, juntam-se ao fator s os demais peptdeos quando ento a RNA Pol inicia o processo de transcrio. Vrios fatores de transcrio (pequenos polipeptdeos), os TFs, atuam no incio, durante a elongao e no trmino da transcrio. O fator de fundamental importncia. Quando um vrus entra numa clula hospedeira, um fator do vrus transcrito e agora os outros cinco peptdeos da RNA Pol ficam a disposio do fator do vrus, que reconhece to somente os genes do vrus. Desta forma, em pouco tempo os vrus conseguem expressar seus genes no hospedeiro e se replicando a uma velocidade impressionante, atingem milhes de cpias. Afetam drasticamente o organismo hospedeiro porque tambm reprimem a produo de protenas deste. O promotor das bactrias formado por duas seqncias localizadas nas posies -10 e -35 (regio 5') da base codificante +1 do gene. Nestas regies, normalmente so encontradas as seqncias (consenso) TATAAT (denominada de TATA box ou Pribnow box) e TTGACA (CAAT box), respectivamente. Nos eucariotos, a regio regulatria dos genes bem mais complexa. Em alguns casos, podem ser encontrados vrios elementos que controlam ou afetam a transcrio. Entre eles esto o promotor, o enhancer e elementos como o GLE, o MRE, etc. Os enhancers so seqncias de DNA que esto muito distantes dos genes e so compostas de seqncias muitas vezes repetidas. Os elementos, so sequncias de DNA, que so alvos de ligao para protenas especificas, que constituem o que se chama de fatores de transcrio (TF). Os fatores de transcrio podem aumentar dramaticamente a taxa de transcrio de um gene nos organismos eucariotos. Alm do promotor outras regies podem acelerar a taxa de transcrio como os enhancers e os terminadores. Os terminadores so seqncias que a RNA Pol identifica como o fim da regio de DNA codificadora ou de um gene. Existem algumas diferenas entre eucariotos e procariotos com relao a transcrio. Em primeiro lugar existem trs RNA polimerases ao invs de uma. A RNA Pol I s transcreve o rDNA (sequncia de DNA que codifica o rRNA). A RNA pol II transcreve os genes que codificam

para protenas, produzindo ento mRNAs. Os demais RNAs (tRNA, snRNA e a 5 S rRNA) so transcritos pelo RNA pol III. Nos procariotos, os ribossomos identificam os mRNAs porque estes apresentam uma seqncia denominada de Shine-Dalgarno que includa antes das bases codificadoras, complementar a uma regio do componente 16 S rRNA. Por sua vez os mRNAs dos eucariotos apresentam uma estrutura denominada de quepe (Cap) resultante de uma ligao 5'-5' entre duas guaninas ou entre G e A. Aps a transcrio, ao mRNA adicionado uma longa cauda de adeninas, o que se convencionou denominar de poli-A. Esta caracterstica dos eucariotos permite a separao dos mRNAs dos demais RNAs, o que normalmente pode ser feito em laboratrio. Nos procariotos, a cauda de adenina bem reduzida. Uma quarta diferena entre procariotos e eucariotos relaciona-se com o processamento do pr-mRNA nas clulas eucariotas. Nestas, aps a transcrio, so removidos os introns do pr-mRNA. S ento, este RNA se desloca para o citoplasma e recebe a denominao de mRNA.

IV-TRADUO (Translation) Traduo o processo de decodificao do mRNA nos ribossomos resultando na formao de um peptdeo. Na maioria dos casos as protenas so formadas por apenas um peptdeo. Para a produo de um peptdeo in vitro so necessrios o mRNA, os ribossomos, os tRNAs, os amino cidos, fatores da traduo e energia. Os ribossomos dos procariotos so formados por duas sub-unidades: a grande, chamada de 50 S, constituda por dois rRNAs, o 23 S rRNA e o 5 S rRNA, e por 34 protenas; a pequena, chamada de 30 S, constituda pela unidade 16 S rRNA e por 21 protenas. Dependendo da fase, uma bactria pode ter aproximadamente 5.000 ribossomos, o que representa 25% da massa celular. Os tRNAs so os RNAs transportadores, tambm chamados de adaptadores, que transportam os amino cidos do meio at os ribossomos para serem incorporados cadeia peptdica. Uma enzima, encarregada de carregar o amino cido especfico na extremidade 3'OH do tRNA, com base no seu anticodon. Existem mais de 20 tRNAs, pois na maioria dos casos, mais de um codon codifica para um mesmo amino cido. O processo de traduo (5'-3') inicia quando a sub-unidade pequena do ribossomo reconhece a seqncia lder do mRNA. Em seguida o primeiro codon (um conjunto de 3 bases) lido e geralmente codifica para metionina. Um tRNA traz o amino cido correspondente ao codon lido. Sucessivamente os codons vo sendo lidos e os amino cidos correspondentes incorporados ao peptdeo nascente pela enzima peptidil transferase. A velocidade da traduo chega a 40 amino cidos por segundo. Qualquer um dos codons de terminao UAG, UAA ou UGA, significa o fim do peptdeo, cuja interpretao feita pelos ribossomos. Nos procariotos, algumas mensagens so policistrnicas. Nos procariotos a traduo simultnea transcrio. Mais ainda, um mesmo mRNA pode ser traduzido por dezenas de ribossomos enfileirados, o que resulta num nmero elevado de cpias repetidas de uma protena a partir de uma nica molcula mensageira. O cdigo gentico est estruturado em codons (trincas), cada um com trs bases. A probabilidade de associar trs bases independentemente da ordem e natureza de 64. Trs codons so de terminao. Os outros 61 codificam os 20 amino cidos. Consequentemente, um mesmo amino cido pode ser codificado por mais de um codon. As principais caractersticas do cdigo gentico so: - estruturado em trinca de bases - no h sobreposio (uma base pertence a um e somente um codon)

- universal (refora a teoria da origem nica da vida); somente poucas diferenas com o cdigo gentico das mitocndrias - degenerativo (mais de um codon codificam para um mesmo amino cido) - o primeiro codon (das protenas) AUG ou GUG - h diferena ou preferncia de uso de diferentes codons de um mesmo amino cido - a hiptese de Wobble permite a no ocorrncia dos 61 tRNAs.

Tabela 2. Cdigo gentico do RNA mensageiro. Primeira Segunda base base U C A U UUU - Phe UCU - Ser UAU - Tyr UUC - Phe UCC - Ser UAC - Tyr UUA - Leu UCA - Ser UAA Stop UUG - Leu UCG - Ser UAG - Stop C CUU - Leu CCU - Pro CAU - His CUC - Leu CCC - Pro CAC - His CUA - Leu CCA - Pro CAA Gln CUG - Leu CCG - Pro CAG Gln A AUU - Ile ACU - Thr AAU Asn AUC - Ile ACC - Thr AAC Asn AUA - Ile ACA - Thr AAA Lys AUG - Met ACG - Thr AAG Lys G GUU - Val GCU - Ala GAU Asp GUC - Val GCC - Ala GAC - Asp GUA - Val GCA - Ala GAA Glu GUG - Val GCG - Ala GAG Glu

Terceira base G UGU Cys UGC Cys UGA Stop UGG Trp CGU - Arg CGC - Arg CGA - Arg CGG - Arg AGU - Ser AGC - Ser AGA - Arg AGG - Arg GGU - Gly GGC - Gly GGA - Gly GGG - Gly U C A G U C A G U C A G U C A G

O conhecimento do funcionamento desta fbrica permitiu a compreenso da ao dos antibiticos e o desenvolvimento de remdios para vrias doenas. Geralmente os antibiticos se ligam ao rRNA ou s protenas dos ribossomos, impedindo ou a leitura do mRNA, ou o emparelhamento do tRNA com o ribossomo ou impedindo outra atividade nos ribossomos. Como os ribossomos dos procariotos so diferentes dos eucariotos, um antibitico pode afetar o funcionamento da sub-unidade pequena (30 S) de uma bactria, sem contudo interferir no ribossomo da clula eucariota hospedeira, cujas sub-unidades tem rRNAs de diferentes tamanhos e seqncia.

V-MUTAO E REPARO Mutao uma modificao no DNA. Mutante o fentipo resultante da mutao. As mutaes so causadas por erros de replicao do DNA e alteraes do DNA por deleo, duplicao ou rearranjamentos causados por vrus, transposons, ao enzimtica ou processos fsicos e qumicos. A taxa mdia de mutao que ocorre naturalmente atinge 1x10-7. Agentes qumicos e fsicos (radiaes) so utilizados em laboratrio para aumentar esta taxa.

Uma mutao dita silenciosa quando o codon alterado, mas no muda o amino cido codificado e consequentemente, a cadeia peptdica. Ela neutra quando, mesmo alterando o amino cido, a protena permanece com a mesma funo. Aqui surge o conceito de polimorfismo a nvel molecular: diferentes gentipos com o mesmo ou diferentes fentipos. A mutao com o efeito mais crtico aquela que provoca a insero ou remoo de uma base (frameship). Como conseqncia, todos os codons localizados aps a mutao ficam alterados, ou seja, a cadeia se torna diferente do padro anterior. Mutaes ocorrem naturalmente. As mutaes mais comuns so aquelas de ponto, onde apenas uma base alterada. Outras mutaes com profundas implicaes no fentipo so aquelas decorrentes de delees, adies, inverses e transposies. preciso salientar que o prprio DNA tem mecanismos de produzir mutaes em si mesmo, independentemente do ambiente. Um deles atravs dos elementos mveis existentes no genoma: os transposons. Transposons so seqncias de DNA que se movem (pulam) de um lugar para outro no genoma. A transposio deixa duplicadas as bases imediatamente prximas desta seqncia (entre 5 e 9), alm de causar interrupes de outros genes quando neles se inserirem. Outras vezes, o transposon se duplica e a nova cpia se insere num outro ponto do genoma. Apesar de no serem ainda bem conhecidos, sabe-se que em alguns casos os transposons carregam genes de resistncia a antibiticos. Como eles afetam a evoluo, devem ter outras funes celulares ainda no descobertas. Uma deles poderia ser o controle do estresse celular. No entanto, eles tem sido tratados como 'genes egostas' porque eles s conseguem se replicar quando dentro do cromossomo, garantindo a sua prpria permanncia no genoma. Nos procariotos, os vrus podem se integrar ao genoma do hospedeiro, podendo causar duplicaes ou delees. Ou seja, existem causas naturais de produo de mutaes, responsveis pela propulso da evoluo. O nmero de mutaes que ocorre num organismo relativamente muito grande. Entretanto, os seres vivos dispem de vrios sistemas de reparo, que corrigem a maioria dos erros ocorridos. Outros erros, quando no corrigidos, podem causar enormes problemas tanto na sobrevivncia como na reproduo do organismo. Neste caso atua a seleo natural, ou eliminado este indivduo ou fazendo com que ele deixe um menor nmero de descendentes. O acmulo de mutaes em diferentes populaes pode provocar, a longo prazo (prazo em termos de evoluo), a diminuio da freqncia de cruzamentos com o conseqente incio da especiao, processo que pode culminar com a origem de uma nova espcie. A nvel de laboratrio, os agentes qumicos mais utilizados para induzir mutaes so: etil metil sulfanato (EMS), cido nitroso, etil metano e alguns agrotxicos ou defensivos. A ao dos agentes qumicos normalmente produz alterao de uma base qualquer. Exemplo: substituio de A por T. Muitos vegetais contm substncias que causam mutaes na espcie humana. Ex: nas frutas e legumes so encontradas as psoralenas (o limo contm quantidades elevadas), que tambm dimerizam duas timinas, se ocorrem lado a lado. Entre os agentes fsicos, os mais usados so as radiaes (UV, gama, etc.). Os agentes fsicos geralmente causam quebras e rearranjos de cromossomos. Especificamente a radiao UV causa a dimerizao de duas timinas se estiverem lado a lado. Durante a replicao, a DNA Pol no consegue ler este dmero, o que provoca a insero de duas bases quaisquer no lugar das timinas, se no houver reparo. Muitos problemas de pele so causados pela radiao UV. por isto que existe tanta preocupao com a diminuio da camada de oznio, pois este atua como uma barreira aos raios UV. A mutagnese direcionada permite a alterao de uma ou mais bases de uma seqncia de DNA qualquer. Inicialmente a seqncia de interesse inserida num vetor, como o vrus M13 que de fita simples. Posteriormente feito um primer (iniciador) num sintetizador de

oligonucleotdeos. Este primer complementar a um certo segmento da seqncia de interesse, mas contendo uma base diferente. Posteriormente, o restante da molcula duplicado. Resultado: a nova seqncia difere da original por uma base apenas. Esta seqncia pode ser avaliada in vitro ou in vivo. Pela tcnica da recombinao homloga, esta seqncia mutante pode substituir a seqncia normal de um organismo. Desta forma, avaliado o efeito de uma mutao in vivo. Foi desenvolvido por Ames, um teste para avaliar a capacidade mutagnica dos produtos qumicos utilizados, com base no tipo de mutao que os produtos provocam. Tais produtos qumicos so classificados quanto ao potencial de causar danos nas pessoas, dependendo do tipo de mutao e a freqncia que so causadas. Este teste associa a capacidade de ao mutagnica com a capacidade de causar cncer, pois estas duas esto estreitamente relacionadas. Outros tipos de testes tambm so utilizados para confirmar a periculosidade do produto. Com base nestes testes, a fabricao e a comercializao de muitos produtos qumicos j foram proibidas.

VI-METILAO Uma frao das citosinas no DNA de muitos organismos torna-se metilada (5mC) aps a replicao. Esta metilao no tem distribuio ao acaso. Algumas seqncias como as denominadas ilhas de CpG em animais, so raramente ou no metiladas. Enquanto algumas seqncias so metiladas em certas condies, como aquelas herdadas da me e no do pai, outras so sempre metiladas em todos os tecidos. Nas plantas e fungos as ilhas CpG so freqentemente metiladas pelas metilases, embora h evidncia de uma substancial quantidade delas no metiladas. Em fungos, a metilao atinge 1,5% das Citosinas e no ocorre somente de forma simtrica. Tanto o controle da metilao quanto sua funo nos eucariotos, ainda no so suficientemente compreendidos. A metilao tem sido correlacionada com reduo na atividade gnica, havendo evidncias de inibio da expresso de vrios genes. Em ratos, a reduo da metilao do DNA em 70%, resultante da mutao no gene metiltransferase do DNA, leva a morte os indivduos na embriognese. A hiptese levantada admite que as regies com bases metiladas dificilmente so transcritas. Neste caso, a morte dos ratos poderia ter sido provocada pela falta de protenas e/ou RNAs. A metilao tambm requerida para o comportamento normal dos cromossomos em Neurospora crassa. Sua necessidade foi comprovada, mas sua funo ainda no est totalmente esclarecida.

VII-REGULAO GNICA Na definio de Jacob e Monod (1961), gene uma seqncia de DNA que codifica para um produto difusvel. A regio regulatria do gene uma seqncia de DNA que no convertida em outra forma (como a regio codificadora) e que s funciona in situ. Alm disso, existem genes estruturais e genes reguladores de outros genes. O princpio bsico da regulao gnica a interao entre protenas regulatrias e certas regies (seqncias) do DNA. Assim, nos procariotos a regulao gnica chamada de negativa se um gene no se expressa caso o repressor, que uma protena, liga-se ao DNA na regio do promotor do gene. Para que o gene possa ser transcrito, h a necessidade de remover a protena repressora. Isto possvel, pela presena do indutor, para o qual a protena repressora tem muito mais afinidade que pela regio do DNA responsvel pela regulao do gene. O indutor ento, tem um efeito inativador sobre o repressor. Este tipo de regulao gnica

 o mais comum nos genes de organismos procariotos. No controle dito positivo, o mais frequente nos eucariotos, o gene ativado pela presena de um ativador. Em outras palavras, no controle negativo, a interao protena-DNA desliga o gene, enquanto no controle positivo, a interao liga o gene. O controle negativo bastante comum nas bactrias, onde a maioria dos genes estariam ligados (on) at que os repressores os desligariam (off). J o sistema positivo mais comum nos eucariotos, onde os genes estariam desligados at que os ativadores os ligariam. A rigor, existem cinco pontos de controle na regulao de um gene eucarioto: 1) na ativao de gene estrutural, 2) no incio da transcrio, 3) no processamento da transcrio, 4) no transporte para o citoplasma e 5) na traduo do mRNA. Na ativao de um gene estrutural, um gene regulado por uma seqncia no promotor e/ou no enhancer, as quais so reconhecidas por protenas especficas. Esta protena funciona como um fator de transcrio necessrio para o incio da transcrio atravs da RNA Pol. Protena ativa s disponvel sob condies quando o gene para ser expresso. In vitro possvel modular a regulao nos diversos pontos de controle. In vivo, a adio de determinados genes permitem o controle de um ou mais pontos de controle. Nos eucariotos ainda no se conhece profundamente a regulao gnica. Entretanto, vrios mecanismos j foram amplamente estudados. Em primeiro lugar, um grande nmero de genes so ativados em determinados tecidos e rgos e no em outros. Os genes denominados de Homeobox so os responsveis por este controle. J nas primeiras divises celulares do zigoto formado, os genes Homeobox se encarregam de marcar quais os genes que podero e quais os genes que no podero ser expressos num determinado tecido ou rgo. Outros genes dependem de um complexo sistema de eventos: sinal ambiental (temperatura, umidade, etc.) faz com que uma substncia seja produzida e/ou movida para as clulas. Este sinal qumico seria recebido por um receptor na clula, cujo complexo tem habilidade para penetrar no ncleo da clula e ativar um conjunto de genes de forma coordenada.