Sesin 23 Mtodos de biologa molecular Nelson Fuentes Vamos a revisar algunos aspectos relacionados con el estudio celular desde

un punto de vista molecular, es decir, algunas tecnologas que se han desarrollado para poder determinar cual es la forma, la funcin, la ubicacin, etc. de las molculas que constituyen a los seres vivos.. Mientras ms detalles se conocen de los aspectos de cada parte de la naturaleza, con mayor fundamento se puede intervenir en ella. Mientras ms se conocen las cosas, uds. pueden modificarlas y pueden mejorarlas. Algo que uds. deben utilizar en el laboratorio y que es de uso bastante comn y amplio dentro de la biologa molecular es la Electroforesis. La electroforesis es una tcnica que podemos definir como la utilizacin de electricidad para la separacin de diferentes molculas. De que se trata? segn este dibujo (muestra una diapositiva) se trata de colocar en un sistema elctrico, en una diferencia de potencial establecida entre estos electrodos, una molcula, de manera que a travs de esta diferencia de potencial se produzca una corriente elctrica que circula por un buffer, un gel y otro buffer. Estos buffers estn en contacto con los electrodos para mejorar el flujo de corriente. La muestra que nosotros queremos separar se pone en esta superficie que es un gel. Hay dos tipos de geles de uso generalizado: para protenas y para ADN. Para las protenas se utiliza un gel de poliacrilamida, que es un gel bastante til, con el cual se puede jugar con su concentracin y de acuerdo a su concentracin se pueden separar molculas de diferentes tamaos. Los cidos Nucleicos se separar en geles de Agarosa. La idea general del gel es colocar una matriz a travs de la cual vayan pasando las molculas y separndolas segn sus caractersticas. Al pasar estas molculas por entre medio de las partculas del gel, se filtran segn su tamao. Como son de tamao diverso, las molculas de menor tamao van a pasar mas rpido que las de mayor tamao.

Entonces podemos lograr una separacin de acuerdo a esta propiedad. (Tamao) Ahora si nosotros ponemos otras condiciones en la electroforesis, podemos separar por carga elctrica. Por ejemplo, si es que mantenemos la carga natural de las molculas vamos a tener molculas negativas y positivas. Al establecer la diferencia de potencial, las molculas negativas van a ir hacia el nodo y las positivas se van a mantener arriba porque vana tender a irse al ctodo. Pero el uso generalizado de la electroforesis es para separar molculas de acuerdo a tamao y peso. Lo que ocurre entonces es que de acuerdo a la concentracin que tengamos en el gel, vamos a poder separar molculas de menor o mayor tamao. Si el gel es muy concentrado, van a haber muchas molculas de gel en la matriz, entonces a a las molculas grandes les va a costar mucho moverse entre tanta molcula del gel, por lo tanto las molculas grandes se van a quedar todas juntas y no vamos a ser capaces de separarlas y solamente vamos a poder pasar directamente las molculas pequeas. Si colocamos a la vez un gel muy diluido, que tenga muy pocas molculas en la matriz del gel, todas las molculas pequeas van a encontrar un gran espacio, todas van a pasar y ninguna va a quedar en la matriz. Entonces de acuerdo al tamao de las molculas que queramos pasar, vamos a tener que adecuar la concentracin del gel. Si queremos separar molculas grandes vamos a tener que usar un gel bastante diluido. Si la mayora de las molculas son pequeas, tendremos que usar un gel un poco ms concentrado. Entonces, vamos a lograr que las molculas se ubiquen en un gradiente dentro de esa matriz o gel. Todo eso separado por la diferencia de potencial elctrico. Que se hace para poder realizar una electroforesis? Primero que nada, con el objeto de aprovechar la caracterstica de tamao o peso, lo que hacemos es denaturar la protena o ADN, es decir, sacarlo de su estructura terciaria o cuaternaria que tienen porque, en ese aspecto, muchas protenas podran ser parecidas, pero cuando se desenrollan son diferentes. Entonces, lo que se hace con ciertos

reactivos como el dodesil sulfato de sodio (SDS), el B-mercaptoetanol (o ditiotreitol) es denaturar la protena, es decir, romper su estructura cuaternaria, terciaria o secundaria y dejar solamente la cadena de aminocidos lineal en el caso de la protena. Adems el SDS al pegarse a las molculas de protena establece una carga negativa en toda la superficie de la protena, de esta forma, todas las molculas quedan cargadas negativamente. De esta manera, no vamos a tener el problema de algunas molculas se queden arriba, porque ahora todas van a tener la misma carga. (Negativa) y ahora la nica diferencia va a estar en el tamao de las molculas. De manera que nos queda al final un gel como este: (muestra diapositiva) nosotros colocamos aqu arriba en el posillo del gel, la muestra que es una mezcla de protenas proveniente de un tejido, bacteria, protozoos, vegetales, etc. Esta muestra, apropiadamente tratada, van a colocarla en el gel, despus de agregarles SDS, se hace correr y las diferentes protenas se van separando de acuerdo a su peso. Esto, que esta en mayor cantidad no significa que la molcula sea mas grande, sino que hay mas cantidad de esta protena. En cuanto al tamao, esta es ms o menos 38000 y esta otra es 15000, la cantidad, la intensidad de la marca (en el gel despus de la electroforesis) implica cantidad de protenas. Significa que esta protena es mucho ms abundante en este tejido que cualquiera de las otras. La posicin nos indica el tamao. Cmo sabemos los tamaos? Corriendo en forma paralela las muestras que nosotros queramos medir, y muestras de peso conocido que se llaman STANDARD. Entonces nosotros comparamos las bandas de nuestra muestra con la del Standard y as podemos aproximar el peso. Bueno la idea de la electroforesis, por una parte, es poder determinar cuantas protenas hay en una muestra, que peso tienen. Pero muchas veces nosotros queremos saber si existe o no determinada protena en una muestra. En un tejido determinado queremos saber, por ejemplo, si existe miosina y cuanta miosina hay en ese tejido. Para eso se realiza una electroforesis y se obtiene un gel con las muestras correspondientes. Ahora nosotros no sabemos cual de todas esas bandas corresponde a la miosina ni sabemos cuanto de esa miosina hay. Tenemos una idea aproximada de acuerdo al grosor de la banda solamente. Entonces, se hace una Hibridacin. Para esto se hace un procedimiento llamado Blooting y es la transferencia de las protenas que hay en el gel a un papel de nitrocelulosa. La idea es poner en contacto el gel con el papel de nitrocelulosa, que es como un papel filtro. Se corta del mismo tamao del gel y se coloca encima, y la idea es hacer pasar a travs del sistema un buffer. Entonces, el buffer pasa a travs del gel y llega al papel de nitrocelulosa, arrastra a las protenas, sacndolas del gel y dejndolas en el papel. Entonces, al final de esta transferencia, de esta forma o en forma elctrica, lo que ocurre es lo siguiente: en el papel de nitrocelulosa quedan todas las bandas, y el gel queda limpio. La transferencia se hace para poder manipular estas bandas, ya que estando en el gel no se puede manipular porque el gel es muy blando y se puede romper. Una vez con las bandas en el papel, se realiza la hibridacin. En este caso, nosotros queremos

reconocer miosina, para lo cual ponemos el papel en un recipiente que contiene anti-miosina. La anti-miosina se va a unir solamente a la miosina, por lo cual, nos va a indicar en que banda se encuentra la miosina. Nosotros debemos ser capaces de unir esta anti-miosina a un sistema coloreado para poder visualizar, ya que, las protenas no son visibles. Entonces, podra ser un fluorforo, un sistema de enzimas o radioactividad. Con cualquiera de estos sistemas de marcacin vamos a ser capaces de identificar la miosina en las bandas que estn en el papel de nitrocelulosa. Esto que se ve ac (muestra diapositiva) es un procedimiento de preparacin de protenas llamado Cromatografa.

Esto se conoce como Cromatografa de capa fina o en papel (muestra diapositiva) se colocan las muestras en estos puntos y este papel se es de capa fina, se coloca una matriz en la superficie de un vidrio, entonces, en la superficie del vidrio queda una capa muy delgada de la matriz que podra ser del grosor del papel o menos quizs. Entonces, el papel se pone dentro de un recipiente que contiene buffer. Por capilaridad este buffer comienza a subir por el papel y al pasar por la mezcla de protenas comienza a arrastrarlas hacia arriba y al final encontramos diferentes manchas en el papel, ya que, las protenas fueron teidas de diferentes colores. Cul es el principio de cromatografa en general? Se trata de poner una matriz y a travs de esa matriz hacer pasar, con la ayuda de un solvente, una mezcla de molculas. Esta mezcla de molculas indica que son diferentes y por lo tanto pasan en forma diferente a travs de esta matriz. Unas se demoran ms que otra, por lo tanto, podemos separar una molcula de la otra. Ahora aprovechando las diferentes propiedades de las molculas nosotros podemos usar matriz que tenga carga elctrica y de esta manera podemos separar de acuerdo a la carga de la molcula. Esta matriz puede ser negativa o positiva. Al pasar la mezcla por la matriz aquellas molculas que estn cargadas negativamente se vana a pegar a las molculas de la matriz y aquellas que sean positivas van a ser rechazadas y vana a pasar rpidamente y van a salir de la columna. Luego que se haya limpiado esta columna y hayan pasado todas las molculas positivas, lo que hacemos es agregar un buffer para romper la unin entre las molculas de la matriz con las molculas negativas. As las molculas negativas bajan por la columna y se reciben en un tubo. Este procedimiento se llama Cromatografa de intercambio inico. El otro principio es aprovechar el tamao de la molcula. Como hay molculas de diferente tamao, deben pasar por un camino ms largo las pequeas y por uno ms cortos las ms grandes. De esta manera vamos a tener que en diferentes tiempos vamos a poder recoger molculas de

Existe una columna de vidrio la cual contiene una sustancia blanca llamada matriz que tiene cierta afinidad con la mezcla que se pone en la parte superior de esta matriz. Al colocar la muestra, esta queda en la parte superior de la columna, al agregarle buffer para que la muestra pase por la columna, nosotros vamos separando diferentes fracciones. Uds. ven que al principio del proceso hay una sustancia coloreada y luego hay una incolora y la tercera es coloreada tambin. La primera sustancia que pasa por la columna es coloreada y se recibe en un matraz. La segunda sustancia es incolora y tambin se recibe en un matraz. Y la tercera sustancia es coloreada y tambin es recibida en un matraz al terminar de pasar por la columna. De esta manera, al pasar las molculas por esta columna, obtenemos diferentes conjuntos de protenas en los diferentes matraces.

diferentes tamaos. Esto se debe a que las molculas de la matriz tienen orificios tiene pequeas pasadas en su interior por las cuales pueden pasar solamente molculas pequeas. Existen partculas con diferentes dimetros de este camino que tienen estas partculas (partculas de la matriz) entonces con eso podemos separar molculas de distinto tamao. A esto le llamamos Cromatografa de filtracin. Por ltimo tenemos un procedimiento muy parecido a la hibridacin que hicimos en el papel de nitrocelulosa. Aqu lo que se hace es colocar un anticuerpo en las partculas de la matriz, entonces, al agregar la mezcla de protenas quedaran pegadas las protenas con su respectivo anticuerpo en las partculas de la matriz y las que no tienen afinidad con el anticuerpo caern por la columna. Una vez que pasen todas las protenas que no tenan afinidad con el anticuerpo, se agrega un buffer para romper la unin del anticuerpo con la protena y se recibe en un tubo. Esto se llama Cromatografa por afinidad. (Muestra un grafico que demuestra el progreso de la secuenciacin de genes con el transcurso de los aos) Micro Arrays (micro arreglo)

Ha tenido un gran aumento en cuanto a su uso, ya que es un tcnica importe y que por eso la he elegido para describirla dentro de esta clase. El micro arreglo es una separacin y reconocimiento de genes en forma especifica para determinado tejido o determinado organismo. Bsicamente se trata de una tarjeta muy delgada y pequea, la

cual, tiene muchos orificios pequeos en cuales caben algunos microlitros y ah se producen algunas reacciones que vamos a describir. Se trata de, por ejemplo, comparar cidos nucleicos, como ADN y ARN de determinados organismos, como ejemplo (muestra diapositiva) el ARN de un ratn que ha sido tratado de una manera y se compara con el ratn control. Y lo primero que hay que hacer es aislar el ADN o ARN, marcarlo con una molcula fluorescente para poder visualizarlo y luego hacer la reaccin correspondiente para ver los resultados de acuerdo a la cantidad que ustedes pueden ver, comparacin del color, por lo tanto, nosotros podemos saber cuanto y si hay o no determinado cido nucleico. El principio de esto es lo siguiente: en cada posillo de esta placa se colocan oligos (trozos de ADN) que tiene una secuencia conocida. Y esta secuencia es complementaria a aquel ADN que queremos reconocer, por ejemplo, si nosotros sacamos de este ratn esta molcula y nosotros queremos saber si existe en este ratn ese gen, para eso pegamos entonces en el fondo del posillo la secuencia complementaria a este ADN, es decir, AATTCGT, porque sabemos que esto es la secuencia complementaria de TTAAGCA, nosotros queremos averiguar si en este ADN existe esta secuencia o no, si es que al ratn que se trat, hubo alguna modificacin de esta secuencia. Extraemos el ADN de la muestra y la colocamos en este posillo y junto con eso ponemos todos los reactivos para que haya reaccin entre las molculas. Entonces, tendr que haber una polimerasa, nucletidos para que estas dos molculas se puedan unir. Si en este ADN existe la secuencia complementaria se va a producir la reaccin y molcula se va a pegar al oligo. Una vez que se realice la reaccin nosotros limpiamos los posillos. Si hay reaccin, esta molcula va a quedar pegada, si no hay reaccin cuando se lave la molcula va a salir y solamente va a quedar pegado el oligo y no va a quedar la molcula marcada. Despus de esta reaccin se observa entonces esta tarjeta y ah es donde aparecen lo colores. De acuerdo a donde uds. pusieron las muestras van a aparecer los colores. En toda esta tarjeta se ponen diferentes muestras, por ejemplo, si queremos saber si hay un determinado gen que sea un gen que provoque la aparicin de tumores, nosotros lo que podemos hacer es sacar muestras de un organismos de diferentes tejidos y queremos saber si hay un gen

que produce tumor, y no sabemos en que tejido es, sacamos todos los tejidos, tejido muscular, nervioso, etc. Y los colocamos en estos diferente posillos, hacemos la reaccin que describimos, luego lo ponemos en un sistema de microscopia fluorescente y vamos a ver los colores. Donde haya reaccin significa que se qued pegado el ADN. Donde no hay color significa que el ADN no reaccion con el oligo. Por lo tanto no existe esa secuencia. Si esa secuencia es de un gen que produce tumor y no aparece en los posillos significa que este tejido prcticamente no lo tiene, pero si aparece el color como en este otro significa que este tejido si tiene este gen, por lo tanto el tumor podra en algn momento aparecer en este tejido. Esa es la utilizacin de los micro arreglos. Tambin se puede utilizar como en este caso que mostramos aqu (muestra diapositiva) para identificar la presencia de un virus, el caso de la hepatitis. Uds. sacan muestras y hacen la reaccin y buscan en el micro arreglo si es que hay o no reaccin, si es que hay o no la secuencia del virus que esta produciendo esa afeccin. Ratones transgnicos Son ratones a los cuales se les inyecta un gen que nosotros queremos saber como funciona, donde se ubica, en que clulas produce o no protena, y para eso existen dos variaciones de inyeccin. Una es inyectar el gen en el ADN del blastocito en la etapa del desarrollo del ratn de manera que este ADN se va a integrar en algunas clulas. Una vez que se produce el desarrollo del ratn estas clulas van a dar origen a esta parte del ratn, a esta o a esta (muestra diapositiva). Estas otras clulas que no tienen el gen van a formar el resto del organismo, entonces cuando se produzca el desarrollo total de este ratn van a ver algunas zonas donde va a estar este ADN. Las clulas que se originaron de ac, los tejidos, organismos, etc. van a tener este ADN pero las que se originaron de estas otras clulas no lo van a tener. Por lo tanto, el ratn es un ratn dimerico por tiene algunas clulas con el gen y otras sin el gen. Realizando algunos cruzamientos se puede lograr finalmente tener distribuido el gen en todo el organismo de este animal. Lo otro que es un poco ms simple, es poner el gen en el cigoto y con esto todas las clulas del

organismo tendrn el gen porque se coloco en una clula inicial. Por lo tanto, todas las divisiones siguientes van a dar clulas que ya tienen el gen. Lo complementario a esto son los ratones knock out. Los ratones knock out son los que se realiza un proceso opuesto, en vez de agregar un gen, se saca un gen, cuando se esta desarrollando el ratn se extrae un gen determinado. Entonces, el desarrollo de este individuo es sin ese gen, por lo tanto, se dice que ese individuo est knock out para ese gen o protena. De esta manera se puede estudiar en este individuo el efecto que tendra esta protena o cual es el efecto que produce la ausencia de esta protena. El uso de las enzimas de restriccin ha sido uno de los factores claves en el desarrollo de la biologa molecular. La manipulacin que se ha podido hacer con todos los genes, el reconocimiento de nuestros genes, no se habra podido hacer si no se hubieran descubierto las enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin son protenas que se producen especficamente en las bacterias. Las bacterias tiene la capacidad de producir estas encimas que son capaces de digerir el ADN en sitios especficos. Dependiendo de la encima que se trate va a ser el lugar donde corte este ADN. Los ejemplos aparecen en este cuadro (muestra diapositiva) las encimas se nombran por el nombre especifico de la bacteria y el numero que se coloca a continuacin es el numero de la protena que se ha aislado de esta bacteria. Por ejemplo, EcoRI significa Esherichia coli de la sepa R y es la primera encima que se prepar. Entonces, lo interesante de esto es que cada encima corta en diferentes regiones dependiendo de la secuencia del ADN. Por ejemplo, la EcoRI corta entre la G y la A (guanina y adenina) siempre y cuando al secuencia sea GAATTC. Si es que la secuencia es esa la encima corta. Conociendo la secuencia del ADN pueden buscar la encima apropiada. Cada encima va a tener su secuencia para el corte. Hay dos tipos de cortes con estas encimas. Una que es la que les acabo de nombrar la EcoRI GAATTC, el corte es entre la G y la A, entonces lo que resulta despus de este corte es que una hebra es ms corta que la otra y el otro trozo

queda tambin con una hebra ms corta que la otra. Por lo tanto, cada trozo al encontrar la cadena complementaria a ella va a ser muy fcil que reaccionen. Lo que resulta de corte con estas encimas es lo que se llaman extremos pegajosos. Porque es muy fcil que estos trozos de ADN de nuevo se unan. EcoRI GAATTC CTTAAG

insulina humana, porque tienen el gen para la insulina humana, entonces, nosotros vamos a tomar estas bacterias, le vamos a romper la membrana con una encima que se llama lisozima. Cuando salga el contenido citoplasmtico tendremos la insulina. Este contenido lo pasamos por una columna cromatogrfica que tenga antiinsulina y vamos a lograr en un tubo la insulina humana pura. De esta manera estamos produciendo la protena de una especie, el homosapiens, en una clula de otra especie. Esto es lo que se llama insulina recombinante. Reaccin de polimerasa en cadena.

En cambio la encima HpaI corta los dos trozos a la misma altura, por lo tanto, lo que queda es algo as: HpaI GTTAAC CAATTG

Entonces, son molculas que si se encuentran no van a reaccionar, porque no tienen la interaccin entre las dos bases complementarias, entonces, lo que hay que hacer es agregar las bases complementarias de manera que el extremo se haga pegajoso. Por lo tanto la unin entre estos trozos es ms difcil. Estos extremos se llaman extremos romos. Con la ayuda de estas encimas es posible hacer una gran cantidad de trabajos, entre ellos, este trabajo de insertar trozos de ADN en un plsmido. Las bacterias en general tienen su ADN en un cromosoma y adems tienen ADN circular que se llaman plsmidos. Se pueden tomar estos plsmidos y sacarlos de la bacteria y tratarlos con una encima como la EcoRI y si este plsmido tiene la secuencia GAATTC, la EcoRI va a cortar y al cortar saca el trozo de ADN dejndonos un extremo pegajoso. De manera que si nosotros traemos un trozo de ADN de otra parte, por ejemplo, podemos tomar la insulina humana y le colocamos en los extremos la secuencia correspondiente, sea, AATG. En consecuencia, se puede pegar, con los extremos de este plsmido. Ahora este trozo de ADN humano forma parte del plsmido y cuando nosotros pongamos nuevamente el plsmido en la bacteria, la bacteria no va a tener ningn problema en reconocerlo. Lo reconoce como propio. Por lo tanto, todas estas clulas bacterianas va a tener en su citoplasma

La idea es que con pequeas muestras de cidos nucleicos nosotros podamos producir cantidades suficientes como para poder trabajar con este ADN. El hecho de producir un ADN, por ejemplo, de clulas sacadas de la mucosa bucal. Uno no puede sacar grandes muestras de mucosa bucal, porque, se rompera el tejido, pero se pueden sacar unas pocas clulas. Al tener pocas clulas tenemos poco ADN con el cual trabajar. Entonces, el procedimiento de la PCR se utiliza para obtener grandes muestras de ADN a partir de una pequea. Esto se aprovecha de una encima que se descubri en extremfilos que es la TAQ polimerasa. La TAQ polimerasa soporta altas temperaturas, porque el termfilo se encuentra en lugares donde la temperatura es muy alta, en fuentes termales donde la temperatura supera los 80C. Por lo tanto, sus encimas no son denaturadas por la temperatura. La PCR se realiza en una maquina que se llama Termociclador que es una mquina que nos permite variar la temperatura rpidamente, por ejemplo de 94C a 54C, en algunos segundos. Luego subimos la temperatura a 62C. De esta manera se pueden lograr estas reacciones. Para poder hacer la PCR necesitamos, adems de la

TAQ polimerasa, oligos, nucletidos para que se pueda generar el nuevo ADN y necesitamos buffer, sea un medio adecuado para que funcione la encima. A 94C las hebras de ADN se separan. Al bajar la temperatura a 54C permitimos que lo oligos ingresen a las dos cadenas que estn separadas Cul es la razn de usar oligos? Cuando nosotros sacamos el ADN de una clula nosotros tenemos cadenas de ADN muy largas, pero nosotros no queremos replicar toda esa cadena, sino que queremos, por ejemplo, encontrar el gen de la miosina, entonces, como slo queremos replicar el sector donde esta el gen de la miosina ponemos los oligos a los extremos y replicamos un trozo ms corto de ADN. A los 54C, entonces, ingresa el oligo a cada extremo limitando la hebra de ADN. Enseguida, se sube la temperatura a 62C, la TAQ polimeraza comienza a complementar el resto de los nucletidos. Todo esto ocurre en un ciclo que dura 3 minutos con 45 segundos, en este tiempo se produce el doble de molculas de ADN de las que haba. Esto se repite varias veces de manera que en 35 ciclos se van a producir 34 millones de copias, por lo tanto, si nosotros tenamos 10 molculas, vamos a tener 340 millones de molculas en 1 hora con 45 minutos. Por ltimo, este mismo procedimiento de PCR, podemos utilizarlo para algo que es muy importante que es la secuencia de ADN. Esto persigue obtener la secuencia de ADN de todas las especies. En este momento las ltimas especies que se conoce su secuencia son el ratn, el chimpanc, la drosophila, etc. Consiste en un procedimiento parecido a la PCR. Se coloca el ADN a 94C para separar el ADN en dos hebras, luego se baja la temperatura a 50C para que ingresen los Primers, porque no se puede hacer la secuencia completa del ADN de una sola vez. Lo que hay que hacer es lograr trozo de ADN y en esos trozos se realiza la secuencia. Luego se sube la temperatura a 60C para que ingresen los nucletidos. Ahora aqu hay algo diferente a la PCR. En la PCR se ponen DNTP, es decir, nucletidos comunes, a los cuales les falta un oxgeno. DNTP significa Deoxi timina, citosina, etc.; por el hidrato de carbono que poseen que es una desoxirribosa, ya que, contiene un solo OH en comparacin con la ribosa. La idea ahora es agregar un DDNTP sea un di-deoxi un nucletido que contenga un hidrato de carbono sin

ningn OH, por lo tanto, cuando ingrese a la cadena, por ejemplo una adenina, no va a tener el oxgeno, entonces, cuando venga el siguiente nucletido no va a tener con que reaccionar, porque no hay oxgeno y la reaccin se va a detener ah.

Entonces, se ponen DNTP con DDNTP, entonces los DNTP ingresan y se unen con el nucletido complementario hasta que ingresa un DDNTP que no tiene el oxgeno. El siguiente nucletido que venga no va a encontrar oxgeno y no se va a poder ligar. Ah termina la reaccin. Por lo tanto, se van a formar molculas de distintos tamaos dependiendo de los lugares donde ingresen DDNTP. Como esto es al azar, van a ir ingresando cuando puedan, entonces, se forman muchas molculas de diferentes tamaos. Si ponemos esto en un gel, el gel empieza a correr y se empiezan a separar las molculas por su tamao y como tenemos molculas de diferente tamao van ubicndose trocitos pequeos primero y sucesivamente mas grandes. Si esto lo hacemos correr en un sistema automtico van a correr en el gel saliendo los ms pequeos primeros y despus los ms grandes, si esto lo ordenamos (muestra una diapositiva) vamos a saber despus que los verdes son citocinas, las azules guaninas, etc. As podemos ver cual es la secuencia del ADN.