Clase Proteínas-Ácidos Nucleicos Martes 29 de Agosto en la Mañana

Señores, se nos quedó algo en el tintero muy importante, necesario que lo discutamos y
tiene relación con lo siguiente: en esta diapositiva yo les presento dos proteínas muy
importantes. Una de ellas es la …quimiotripsina) que corresponde a una enzima digestiva
…. Y la otra es la … que también es una proteasa. Las dos son proteasas, es decir, lo que
hacen es hidrolizar enlaces peptidicos. Tanto la quimiotripsina como la … en el lugar en el
cual ellas realizan su funcion, en este caso el sitio activo (enzimas), se registran residuos de
serina, una histidina y el ácido aspártico. Ustedes pueden ver aquí el número que tienen
ellos en la secuencia. Y si ustedes se dan el trabajo de mirar atentamente esto, pueden darse
cuenta de que el plegamiento y los elementos de la estructura secundaria de esta proteina,
son diferentes al plegamiento y los elementos de la estructura secundaria de la otra
proteina. Pero pueden darse cuenta aquí, y darse cuenta acá que donde está el sitio activo de
cada proteína, que en ESTE sitio activo se da esto. Esto se conoce como la “triada
catalitica”. Y ambos a pesar de que no tienen una secuencia idéntica y un plegamiento
diferente en el sitio activo tienen los aminoácidos que corresponden, donde corresponden y
como corresponden. Es decir, tienen lo que denominan los enzimólogos, la “geometría
perfecta” en el sitio activo. Que les estoy diciendo yo? Que nosotros podemos tener
diferentes secuencias con diferentes plegamientos pero la “misma funcion”. Mientras
nosotros mantengamos la geometría y la composición del sitio activo, nosotros mantenemos
la funcion.

Pregunta : No se entiende absolutamente nada (12:30 aprox)

Claro, es la misma geometría.

Sigue la pregunta y no se sigue entendiendo

Esto es solo para mostrarles que tan importante es esto del sitio activo o biológico. Esto se
cumple en el sitio de unión del antígeno, en el sitio activo de una enzima, en el sitio del
ligando de un receptor, etc..

Fíjense en esta enzima, la fosfofructoquinasa, ella recibe esta molécula que uds deben
conocer, aquí esta como ATP, y aquí en medio hay un azúcar fosfato, esta enzima cataliza
este tipo de reacción, y les tiene que llamar la atención cómo este sustrato que está aca, está
mantenido en su posición por una serie de Puentes de Hidrógeno. Y aquí esta mostrada la
parte de arriba de este sitio, y la otra parte también está mantenida en esta posición por una
serie de PH, es decir los sustratos en los sitios que deben reaccionar no están tirados. No,
están perfectamente alineados. Y de este alineamento, depende la actividad biológica.
Cuando uds vean más adelante enzimas van a darse cuenta un poco más de esto. Acá les
muestro otra proteina en las cuales todo lo que esta con rojo corresponde a una proteína, lo
que esta con azul corresponde a otra. Lo que se ha hecho es cambiar un aminoácido, que
normalmente en la proteina es asparragina por un acido aspartico. El acido aspartico es el
acido de la asparragina, es decir teníamos un CONH2 y lo cambiamos a COOH. Y fijense
los cambios que se inducen. Este cambio no se hizo en el sitio activo. Fijense los cambios
que se inducen en estas otras zonas, en el resto hay cambios que son minimos y podrian
darse por el efecto de movilidad, pero fijense los cambios que hay, es decir, mutaciones
puntuales pueden distorsionar bastante el plegamiento de una proteina.

Pregunta: Aquí cambio la función? Y el sitio activo?

R. Claro, se alteró la función. No se cambio directamente el sitio activo pero se distorsionó.

Preg : No se entiende

En el anterior , uno es ADP y el otro es fructosa-6-fosfato.

Quiero rápidamente contarles ahora un poco ahora, cómo es que uno investiga las
proteínas, ya que estoy seguro que el 80% de uds quiere investigar en proteínas porque las
proteínas la llevan ahora.

Lo primero que tengo que contarles, que, desde siempre que uno quiere investigar algo, lo
primero que debe hacer es “tener un modelo”, un modelo biológico, que es una
representación mas sencilla de lo que queremos investigar. Como uds saben, es difícil
conseguirse voluntarios humanos con los que se pudiesen hacer experimentos. Por lo tanto
el hombre ha tenido una serie de modelos biologicos, y estos modelos biologicos, hay de
todos tipos.

Uno que nunca se arratona, es este ratón, a diferencia de la rata que es tremendamente mas
grande, es uno de los modelos biologicos mayormente usados en fisiologia y farmacología.
Pero si uno no está interesado en modelos biologicos animales, puede tambien tener
modelos biologicos vegetales y la arabidopsis es el tubo de ensayo de la gente que trabaja
en bioquímica vegetal. Estos MB son complicados, tenemos MB más pequeños como el
pez cebra que yo diria que en los ultimos 5 años ha sido la vedette en todo lo relacionado
con desarrollo embrionario, y la que uds conocen, famosa, la mosca del vinagre, la
drosophila melaganaste (melanogaster), todo el desarrollo de la genetica se ha producido
por esta mosca. Hay laboratorios grandes solo para entender esta mosca, entre 15-20
personas especializadas en estudiar la mosca. Junto con el pez cebra, este gusano redondo,
ha sido también muy utilizado, por la transparencia que este tiene y asi seguir algunos
cambios.

Pero cada uno de estos sistemas son tremendamente organizados, con muchas celulas y a
veces es difícil de llevar. Pero hay sistemas mas sencillos como las levaduras, que tb son
modelos eucarioticos pero son mas sencillos del punto de vista del numero de celulas o de
las funciones. Otro elemento tremendamente importante, son los virus y por supuesto
nuestra nunca bien ponderada , la Escherichia Coli. Y dentro de la E.C., uds se acuerdan de
esta diapositiva, que aproximadamente el 15% del porcentaje del peso seco de la EC son
proteinas y lo que uds quieren hacer en este instante es purificar UNA de estas 4288
proteinas.

Pregunta (No se entiende) 22:40 aprox

R. Porque resulta que se conoce el genoma completo de la EC, y a partir de eso, se conocen
todas las proteínas que codifican sus genes.

Bueno, nosotros queremos entonces, a partir de esta celula que esta aca, purificar esta
proteina. Tenemos dos grandes problemas. Las proteinas, cada una de ellas, es una pequeña
parte, y ademas las proteinas cuando uno las saca de este medio estable, las proteínas se
comportan como moléculas relativamente inestables.

Antes de empezar a purificar una proteina, tenemos que ver para que la queremos. Porque
de acuerdo al tipo de analisis que nosotros queramos hacer y sabiendo que es lo que
queremos de la proteína, sabremos cuanto de la proteina necesitamos tener. Fijense que
ademas de eso, dependiendo del estudio que yo quiero hacer, yo no se si necesito la
proteina totalmente pura. Si yo voy a hacer estudios farmacologicos, necesito una pureza
mayor al 99%. Ahora por otro lado, voy a ver cómo se comporta la proteina si le pongo un
casete de los tres, mozart, etc… , bueno , dependiendo de eso, es el grado de pureza que yo
necesito.

Los bioquimicos han desarrollado metodologías, para poder separar una proteína de otra
por medio de una serie de propiedades. Es decir, si necesitamos la propiedad de solubilidad,
ocuparemos algunas sales y sólo precipitarán algunas proteínas y otras no. O nosotros
usaremos las cargas, mediante la cromatografía de intercambio ionico, y separaremos
nuestras proteinas de las otras. Tal como lo vieron uds, muchas proteinas pueden compartir
algunas de estas propiedades, por lo tanto es casi imposible, explotando solo una de estas
propiedades, pueda yo tener la proteína completamente pura. No obstante , en algunos
casos si se da. Nosotros estamos desarrollando un proyecto en el cual utilizamos la
precipitación del calor. Se toma una bacteria y se le extrae el resto en solución y esa
solución la calentamos a 56°. El 95% de las proteinas precipita, porque se denatura, se
centrifuga y nuestra proteína es la proteina mayoritaria.

Lo que nosotros tenemos que hacer es tratar de optimizar cada una de estas
etapas(muestra). De captura, de purificación primaria y otra de purificación fina. Cada una
de estas etapas esta optimizando una de estas caracteristicas. Por ej. La de captura, uno lo
puede hacer rapidamente y tiene una alta capacidad. Entonces uno va buscando la
metodología para optimizar alguna caracteristica, y esta pirámide (pirámide de la eficencia
de la purificación) debe tener el mayor volumen posible. Para que les quede claro, si yo
quiero aumentar la pureza, tengo que aumentar el numero de pasos. Y cada una de estas
capas que yo estoy logrando, debe hacer que aumente la pureza. El trabajo del bq se reduce
a tratar de optimizar que metodo son los que me producen esta pendiente optima. Para ello
el protocolo mas sencillo cuando se purifica una proteina es este: (diapositiva)

Preparar el extracto celular (sean bacterias o tejidos)

Clarificarlo (significa sacar los restos celulares)
Eliminar los ac nucleicos (ellos le dan mayor viscosidad a la solucion y además son
cargados negativos y ellos pueden absorber muchas proteinas sobre ellos)
Precipitación con sales
Tecnicas cromatográficas
En la etapa de extracción, lo mas normal que se hacia durante muchos años, era que a partir
del organo del cual ibamos a obtener la proteina (proteina hepatica), lo primero era
conseguirse un voluntario para sacar extractos de hígado.

No escribí lo relacionado a conseguir muestras de hígado, porque creo que no lo

preguntará.

Después de que tiene el extracto homogeneizado, uno va separando los diferentes

organelos, valiendose que cada uno de ellos puede separarlos del resto de acuerdo a su
masa. Entonces se hace una centrifugacion diferencial y se van sacando diferentes
fracciones celulares.

*Si uds revisan algunos libros, se habla de citoplasma y el citosol. El citosol es una fraccion
que solo existe cuando uno hace una centrifugación diferencial y se refiere a la fraccion
soluble cuando se centrifuga sobre 100.000 veces la aceleración de gravedad. Fijense que
las celulas no tienen citosol, tienen citoplasma.

Lo que uno puede obtener es que mediante esta aceleración de gravedad uno separa las
particulas mas densas de las menos densas. Si uno hace esto mismo, pero en vez de tener
una solucion de la misma densidad, lo que crea es un gradiente de densidades, lo que va a
lograr es que cada una de estas fracciones celulares migre donde alcanza su misma
densidad y asi uno puede separar las fracciones.

Pregunta: No se entiende

R. Esto se llama centrifugación zonal o en gradiente de densidad

Fijense que si uno pone un extracto celular aca y tiene este gradiente, uno podria separar
distintos organelos fácilmente porque cada uno tiene una densidad diferente y eso ha
permitido el desarrollo de la bioquímica.

Cada una de las cromatografías se basan en diferentes procesos. Todas estas que estan hacia
aca se llaman de absorción y las otras de filtración. Estas de filtración se basan en que hay
un soporte que mediante la interaccion de la proteina con el soporte uno puede lograr
separarlas del resto. Lo importnate en esto, es que uno tiene un soporte (solido) y uno
mediante esta construccion que se llama una columna y mediante una fase movil donde esta
la proteina, empieza a hacer migrar la proteina por medio de estas fases, y generan
interacciones. De acuerdo a estas interacciones, favorables o no, con el soporte, uno va a
empezar a separar cada una de las proteinas que tiene un comportamiento similar con estas
fases. SI uno esta habladno de intercambio ionico, lo que uno tiene aquí dentro, son
particulas cargadas (resinas de cargas positivas y negativas). Entonces se ponen las
proteinas, cada una con carga neta diferente por su punto isoelectrico, y va a interaccionar
mas o menos con estas particulas. Por supuesto las que no interaccionan con las particulas,
van a ser arrastradas por la fase movil y salen rapidamente. Las que interaccionan
medianamente, van a ser arrastradas más lentamente. Y las que no interaccionan, van a
quedar atrapadas. Si yo quiero soltarlas, lo que hago es cambiar el pH.
Pero mas que cambiar el pH, se cambia la fuerza ionica del medio, porque los cambios de
pH pueden denaturar la proteina. Se le pone una alta concentración de sales para cambiar la
fuerza ionica del medio, para que pierda la fuerza con que interaccionan los polos + y -,
entonces son fácilmente arrastradas.

Otro ejemplo, es la cromatografía de filtración en gel o filtración molecular. En este caso, el

soporte tiene canaliculos de diferentes tamaños, entonces las proteinas, algunas van a poder
entrar en estos canaliculos (mas pequeñas) y las mas grandes no podran entrar. Entonces
cuando se empieza a eluir, las moléculas grandes son arrastradas rapidamente porque no
entraron a ningun canaliculo, las medianas vienen después y las pequeñas (que entran a
cuanto canaliculo tienen) quedan atrapadas y salen tardiamente. Entonces saco proteinas de
alto peso molecular, después de medio peso molecular y luego de bajo peso molecular.

Ahora, cuando los bq pensaron un poquito más, se dieron cuenta que uno podia explotar la
propiedad mas importante que tienen las proteinas (funcion biologica). Entonces si ello
eran capaces de pegar a un material inerte una molécula que fuera reconocida
específicamente por mi proteina, esta proteina iba a quedar retenida (ligando especifico
unido covalentemente a la resina que es la matriz inerte). Entonces eluyen las que no tienen
especificidad por el ligando. Para soltar la proteína, se necesita una solución con el ligando
solo. Esta cromatografía se denomina de “afinidad” es tremendamente resolutiva para
separar proteinas. Pero muchas veces hay problemas, cuando la proteina es una enzima, y
actua sobre el ligando, al cabo de unas 2 o 3 purificaciones habrá degradado esta molécula
y no se podría efectuar este método.

(Los polimeros inertes pueden ser celulosa, polidextranos)

Lo que uno tiene que hacer entonces es, de alguna manera, hacer lo que esta esquematizado
en esta tabla de purificación, es decir, ir pasando por una sucesion de pasos, tratando de
mantener la funcion biologica lo mas alto posible. A la vez que la cantidad de proteina va a
ir disminuyendo (al sacar las proteinas contaminantes). Lo que ustedes ven aca, que cuanto
de la proteina que hay, son mi proteina en cuestion, es decir cuanta actividad biologica
tengo por cada mg de proteina. Y si uds se fijan, este parámetro que se llama actividad
especifica, tiene que ir aumentando. Si se pierde actividad especifica, significa que algún
paso de la purificación está malo y se debe cambiar por algun otro tipo de tecnología.
Cuando uno está haciendo estas metodologías, hay una tecnica que les ayuda montones, la
electroforesis, y lo que uno hace, es hacer migrar las proteinas en un soporte. Esto es un
tipo de gel sometido a un campo electrico. Cada una de las proteinas con carga van a migrar
en el campo electrico (gel) y lo que uno obtiene al final de esto, después de haber teñido las
proteinas, es una separacion de cada una, donde cada una de estas bandas, representa a una
familia de proteinas que tienen esta propiedad. Y si yo hago esto con proteinas para las
cuales yo conozco perfectamente su tamaño puedo, mediante esta graficación, conocer el
tamaño de mi proteína. Habiamos visto que nosotros podiamos tambien hacer lo que se
llama un electroenfoque. Este EE es muy similar al anterior, con la unica diferencia , que
antes de cargar mi muestra, establezco un “gradiente de pH” y esto se logra con unas
sustancias que se denominan “anfolitos” (mezcla de acidos di y tricarboxilicos) y cada uno
de estos migra y deja un pH diferente a lo largo del gel. Por lo tanto si yo pongo la solucion
de proteinas y aplico una diferencia de potencial, las proteinas van a migrar hacia el punto
del gel donde alcanzan su punto isoeléctrico. Si yo después corto el gel en rebanadas muy
finas y voy midiendo el pH, puedo saber exactamente el pI de cada una de estas proteinas.

Pregunta: Se podrían denaturar las proteinas?

R. Si yo hago esto, lo hago a un pH determinado y efectivamente están denaturadas. En el

caso de la electroforesis, todas las proteinas están denaturadas.

Hay una combinación de las dos cosas, que se llama electroforesis bidimensional, donde
primero se hace el electroenfoque y luego utilizo este gel y lo extiendo para hacer una
electroforesis normal y lo que obtengo son cada una de estas manchitas que corresponden a
una proteina y estan separadas primero en esta dimension (por pI) y en esta dimensión por
tamaño. Significa que varias pueden tener el mismo pI pero diferente tamaño, y viceversa.
Muchas veces , se necesita saber de todas esas proteínas, cuál es MI proteína. Se utiliza un
anticuerpo específico para la proteína. Hago una electroforesis tal cual, y después transfiero
estas bandas de proteinas de este gel al papel. Esta es una membrana de celulosa altamente
absorbible, por lo tanto las proteinas que queden aca no van a difundir libremente. Después
de que tengo las proteinas en la membrana, las hago reaccionar con un anticuerpo
especifico para la proteina. Después que yo ya reconoci mi proteina, lo que hago, es utilizar
un segundo anticuerpo que reconozca el primero. La caracteristica de este anticuerpo es que
esta unido covalentemente con una enzima, esta actua y marca de cierto color la proteína en
el papel. Este estudio se llama Western Blot.

Una de las dos tecnicas que permiten tener información sobre la estructura de una proteina
es la difracción de rayos x de cristales de proteina. Se hacen cristales de la proteina a
estudiar, se exponen a los rayos x y se puede observar lo que se ve aquí (diapo), y a partir
de este espectro de difracción lo que yo tengo que usar es la información que tiene que ver
con la posición de cada una de estas manchitas y la intensidad de ellas y mediante algunas
funciones matematicas lo que yo hago finalmente es poder reconstruir la posición de cada
uno de los atomos de la proteina. Esto es engorroso y difícil, pero en algunos casos, cuando
algunas proteinas en las cuales la secuencia es muy parecida a otra con estructuras
resueltas, lo que yo puedo hacer es el “modelaje molecular”, es decir armar un modelo
basado en el alineamento a partir de la secuencia conocida. En otras palabras, lo que yo
hago es forzar mi secuencia para que adquiera este plegamiento.

¿Cual es el interes de tener la estructura 3d de una proteina?

Es que hay un sinnumero de estudios e información que yo puedo obtener. Por ejemplo
puedo sacar informacion de la estructura cuaternaria y el plegamiento (función que
cumple). Puedo tratar de ver cuales son los residuos más expuestos, el sitio activo, etc…
Buscar bases moleculares para estudiar la función o disfunción de las proteínas.
 ÁCIDOS NUCLEICOS

En 1868, Friedrich Miescher, estudiando sus pacientes, encontró que el material

nuclear contenía fósforo, el cual era posible precipitar y lo llamo “nucleína” (hoy conocida
como “nucleoproteína”).
En 1899, Atan, logró separar ácidos nucleicos de proteínas. A estas alturas, no se
sabía que exactamente transmitía la herencia de los progenitores a los descendientes
(proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, etc.).
En 1900 se logra encontrar las bases púricas y pirimídicas y azúcar. En esta época
se postuló que el ADN era un tetranucleótido y que su objetivo biológico era ser un
depósito de fosfato. Luego se dieron cuenta de que en realidad es un polímero, postulando
que sería un polímero del tetranucleótido mencionado anteriormente, repitiéndose éste una
y otra vez en la cadena.
Watson y Crick, demostraron el apareamiento de Citosina-Guanina y Adenina-
Timina, que dan lugar a que siempre que haya timina, se encuentre adenina y su proporción
siempre sería 1; lo mismo con la Guanina y la Citosina.
Roslyn Franklin realizaba difracciones (?) de Rayos X de fibras de ADN y tenia un
estudio que demostraba que si se tomaba una fibra de ADN, existían ciertos patrones
repetitivos. Con los estudios de Roslyn Franklin, Watson y Crick lograron postular su
modelo de la doble hélice del ADN.

Cada nucleótido consta de una base nitrogenada, una azúcar y un grupo fosfato.
Las bases nitrogenadas: derivadas ya sea de anillos púricos o pirimídicos,
encontradas en el ADN (Adenina, Timina, Citosina, Guanina) y en el ARN (Adenina,
Uracilo, Citosina, Guanina). Existen algunas bases modificadas que pueden contener por
ejemplo, un metilo, etilo, hidroximetilo, etc.
Los azúcares: otra parte importante de los ácidos nucleicos. Existen dos tipos, la
ribosa y la desoxirribosa (no tiene el –OH en la posición 2). El –OH en la posición 2 es lo
que permite que cuando se forma la cadena, esta se hidrolice; en cambio, al no encontrarse
el –OH, la cadena no se hidroliza, lo que causa que el ADN sea más estable que el ARN.
Grupo fosfato: parte esencial de un ácido nucleico. El grupo fosfato no siempre se
encuentra en el mismo carbono, sino que en algunos casos el fosfato une dos azucares,
formando un compuesto denominado cíclico.

Los polinucleótidos son cadenas lineales de nucleótidos unidos entre sí. Se tiene
que en la cadena, por nomenclatura, comienza en el extremo 5’ con un grupo fosfato y
termina en 3’ con un grupo –OH.
Se enlazan mayormente por enlaces sencillos, los cuales tienen libre rotación. En
los casos en que se encuentra un componente cíclico, la libre rotación se ve restringida,
pero existe de todas formas. La base, conectada al azúcar también tiene libre rotación.
Entonces, a diferencia de las proteínas, los polinucleótidos presentan libre rotación a lo
largo de toda la cadena, lo que le da una gran libertad conformacional.

El ADN forma doble hélice. La cadena azúcar-fosfato-azúcar-fosfato es la que tiene

libre rotación alrededor de todos sus enlaces. A partir de estas cadenas se proyectan las
bases nitrogenadas, las que establecen interacciones con la otra cadena. Por lo tanto, esta
interacción le restringe la movilidad, relacionada a la libre rotación, a la cadena. Esta
restricción se debe a que las bases establecen puentes de hidrógeno con las de la cadena
vecina.
Las bases nitrogenadas no se encuentran tan paralelas, sino que presentan cierta
torsión. A raíz de esto, es posible encontrar otras conformaciones de la hélice en el ADN.
En la Conformación A se forma la doble hélice y el apareamiento, pero las bases no
están paralelas entre ellas o perpendiculares al eje de la hélice, sino más bien inclinadas. El
paso (?) de la hélice es diferente, el número de pares de bases es diferente.
Así como encontramos la Conformación A es posible encontrar muchas otras, como
la Conformación Z, a la que se le ha atribuido importancia en la regulación de la expresión
de genes. Pero la más aceptable y en la que se espera encontrar siempre el ADN es la
Conformación B.
La A y la Z son conformaciones en las que es posible encontrar ciertas zonas de la
cadena. Se han descrito por lo menos 48 conformaciones diferentes, y cada una se ha
descrito en base a pequeños fragmentos de ADN, con secuencias bien particulares.

¿Qué hace que el ADN varié en estas conformaciones?

Si se tiene el azúcar en la conformación 3’-exo (Conformación B), los grupos
fosfatos unidos a ella, se distancian por 6,46Å. Si se cambia la conformación del azúcar a
2’-exo (Conformación A), los fosfatos se encuentran a 5,64Å. Para este cambio solo se
necesita una fluctuación térmica, la que lleva a que los fosfatos se acerquen.
La Conformación A es preferida por los ARN. La ribosa tiende a tomar esta
Conformación. Los ARN raramente se encuentran en doble hélice, pero cuando sucede
(durante la transcripción, al unirse a una hebra de ADN), la cadena tiene una alta
probabilidad de tomar la Conformación A.

Las bases nitrogenadas tienen ciertos fenómenos de tautomerias (?), en donde hay
equilibrios entre las forma amino y la forma imino o entre la forma keto y la forma enol.
Entre las formas imino y enol, no es posible que exista el apareamiento como
sucede entre las formas amino y keto.
Las bases nitrogenadas no solo se aparean como A-T y C-G, sino que existe un
sinnúmero de apareamientos, como triadas o en triángulo, de a cuatro, etc. se pueden
encontrar diferentes formas libres en zonas de la cadena, como loops, protuberancias,
horquilla, nudos, etc. el ARN también tiende a formar estos bucles o anillos, incluso es
más posible encontrarlos en el ARN que en el ADN.
Se pueden incluso formar zonas con triple hélice, en lugares en que exista un trozo
de cadena con solo bases púricas y otro con solo bases pirimídicas. Este triplete se ha
encontrado en algunas zonas del ARNt (de transferencia).
Se dan también de cuatro hebras, cuando hay cuatro bases de Guanina que se
emprensan y se estabilizan entre ellas. Este cuarteto de Guaninas se ha encontrado en los
genomas de varios virus.