SINDROME ANTIFOSFOLIPIDICO

RESIDENCIA HOSPITAL ALVAREZ 2006

DEFINICION
El sndrome antifosfolipdico es una enfermedad sistmica autoinmune caracterizada por la combinacin de trombosis arterial y/o venosa, prdidas fetales recurrentes y presencia de anticuerpos antifosfolpidos a ttulo moderado a elevado.

Especificidad antignica
2GPI protrombina

Alloanticuerpos Sfilis / HIV / HCV / ..

Y Y Y Y
Autoanticuerpos SAF / Lepra

Y Y

EC EC

tPA Plasmin Plg

PAI-1

Plat

TM EPCR TM EPCR PC T PC T

PS APC PS APC PS PS Plat

PT PT 2GPI

aPL aPL
PT PT T T T T Va Xa Plat

Plat

AnnA5

TFPI

Xa

AT AT

VIIa TF TF EC

Forastiero et al, Current Rheumatol Reviews 2005

ANTICUERPOS ANTIFOSFOLPIDOS
Familia heterognea de inmunoglobulinas que reaccionan contra una protena unida al fosfolpido Son autoAc que prolongan los test de coagulacin dependientes de fosfolpidos.
Los ACA no presentan reactividad contra cardiolipina, sino contra la 2GPI unida a fosfolpidos
Galli et al, Lancet 1990 McNeil et al, PNAS 1990 Matsuura et al, Lancet 1990

La actividad de LA requiere los cofactores proteicos 2GPI o protrombina

Oosting et al, Thromb Haemost 1992 Bevers et al, Thromb Haemost 1991

B2 GPI
Protena con 326 AA, PM:54.2 kd Gen :17q23-24 Es una apolipoproteina Producida por el hgado y la placenta. Concentracin plasmtica:200mg/dl Circula libre y unida a lpidos . Posee V dominios Dominio V: cargas positiva (mltiples Lisinas),se une a los FL cargados Negativamente, tambin es clivado por la plasmina. Incrementos: edad, sexo masculino, Fumadores, hiperlipidemias, infeccin Crnica y aguda (RFA) .

FISIOPATOLOGIA
EC EC
Up-regulation of adhesion molecules E-sel, VCAM-1, ECAM-1

2GPI

Enhance secretion of cytokines

Increase monocyte adhesion to EC Enhance tissue factor expression

Stimulate the procoagulant activity of EC and monocytes

FISIOPATOLOGIA

Ann V IIa
Xa-Va Xa-Va

Bicapa Lipdica

Bicapa Lipdica Cofactor Proteico

Y Y

Y Y

Formacion de Fibrina

aFL

FISIOPATOLOGIA

Interaccin con el sistema Protena C/S

Los anticuerpos a IgG inhiben la degradacin del FVa porque estn dirigidos contra los complejos PC-PL y otro contra PS-PL. La PC es target de los aFL al formar complejos con los fosfolpidos aninicos y 2GPI produciendo disfuncin de la PC.

Interferencia con el sistema fibrinoltico

El estado de hipofibrinolisis es debido a los niveles incrementados de PAI-1. Presencia de Ac anti-tPA. La 2GPI se une y protege al tPA de la inhibicin por el PAI-1 , los autoAc anti2GPI suprimen este efecto protector llevando a un estado de hipofibrinolisis.

Criterios revisados para el SAF - Sydney 2004

JTH 2005

Clnica
Trombosis vascular Uno o ms episodios de trombosis arterial y/o venosa en cualquier rgano o tejido, confirmada por estudios de imgenes o histopatolgicos (a excepcin de trombosis venosa superficial). Clasificar a los pacientes con SAF con presencia o ausencia de factores de riesgo adicionales como: Pacientes con un primer episodio de IAM o stroke > 55 aos (hombres) o > 65 aos (mujeres) en presencia de cualquier factor de riesgo para enfermedad cardiovascular. Pacientes con neoplasias y pacientes con otros factores importantes de riesgo de trombosis (inmovilizacin prolongada, etc). Las trombofilias congnitas tambin deben ser consideradas.

Criterios revisados para el SAF Sydney 2004

JTH 2005

Clnica
Morbilidad obsttrica A) Uno o ms MFIU (>10 semanas de gestacin) de fetos morfolgicamente normales documentado por ultrasonido o por examen directo del feto, o B) Uno o ms nacimientos prematuros (<34 semanas de gestacin) de neonatos morfolgicamente normales debido a eclampsia o preeclampsia severa o insuficiencia placentaria severa (peso de placenta <10 percentilo y/o infartos placentarios afectando >20% de la placenta), o C) Tres o ms abortos tempranos (<10 semanas de gestacin) excluyendo causas maternas anatmicas u hormonales y causas cromosmicas paternas y maternas Se recomienda clasificar en los estudios clnicos a los pacientes en los tipos A, B o C

Criterios revisados para el SAF - Sydney 2004

JTH 2005

Laboratorio
ACA (IgG y/o IgM), ttulo moderado o alto (>40 GPL o MPL, o >99 percentilo), en al menos 2 oportunidades separadas ms de 12 semanas, por ELISA estandarizado para medir ACA dependientes de 2GPI Anticoagulante lpico (AL), en al menos 2 oportunidades separadas ms de 12 semanas (ISTH guidelines,1995) Anti- 2GPI (IgG y/o IgM), (>99 percentilo) en al menos 2 oportunidades separadas ms de 12 semanas, por ELISA estandarizado Categorizar pacientes de acuerdo al tipo de aFL presente: I cualquier combinacin de aFL IIa slo AL IIb slo ACA IIc slo anti- 2GPI

Criterios revisados para el SAF Sydney 2004

JTH 2005

Define SAF: 1 criterio clnico + 1 criterio de laboratorio Estudiar aFL al menos 12 semanas despus del episodio clnico No diagnosticar SAF en el caso de encontrar aFL positivos si la manifestacin clnica ocurri hace ms de 5 aos Se desaconseja el uso del trmino SAF secundario y se propone por ejemplo SAF asociado a LES

Criterios revisados para el SAF Sydney 2004

JTH 2005 No son criterios clnicos de SAF Enfermedad valvular cardiaca asociada a aFL Livedo reticularis asociada a FL Trombocitopenia asociada a aFL (<100 x 109/l) Nefropata asociada a aFL No son criterios de laboratorio de SAF ACA-IgA anti- 2-GPI -IgA aPS (anti-fosfatidilserina) aPE (anti-fosfatidiletanolamina) anti-PT anti-PS/PT

Actividad de Anticoagulante Lpico

Ensayos De Coagulacin

Un resultado POSITIVO es criterio de laboratorio para definir SAF

Presencia de Anticuerpos Anticardiolipina

Ensayos Inmunolgicos

Estudio de Anticoagulante Lpico

Test de Screening Estudio de Mezclas. Test Confirmatorio.

Condiciones de la muestra
Falso negativo: Plasma pobre en plaquetas. Las plaquetas podran aportar los fosfolpidos Filtrando (poro : 0,22 micras). Centrifugando 2 veces a 1500 g 15 minutos. Falso positivo: plasmas envejecidos baja la actividad de los factores (usar plasmas frescos).

ESQUEMA DE LAS PRUEBAS IN VITRO

TEST DE

SCREENING

APTT dRVVT Tpo de Protrombina diluda (dPT ) KCT Tpo de Textarin Tpo de Taipan

Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT)

Mide el tiempo de coagulacin en presencia de tromboplastina parcial (fuente de fosfolpidos), un activador y calcio. Evala la va intrnseca. Detecta la deficiencia de factores y presencia de inhibidores especficos y no especficos (como AL). Valor de Referencia: 35-45 seg

Tiempo de Veneno de Vbora Russell Diluido (dRVVT)

El veneno posee una enzima que activa al factor X Los FL estn diluidos lo que determina la velocidad de reaccin (muy alta sensibilidad) Es independiente de: sistema del contacto deficiencia de factor IX, VIII inhibidor adquirido de factor VIII. Es sensible a la deficiencia de factor II, V, X,fibringeno. Variabilidad la concentracin del veneno, depende de la distribucin geogrfica, del hbitat, del estado hormonal, la alimentacin

Test de protrombina diluido o Prueba de Inhibicin de la tromboplastina tisular

Es una prueba con FL diluidos, que lo hace muy sensible al AL. TTI : (P/N) con tromboplastina diluida (P/N) con tromboplastina sin diluir TTI < 1.2 Normal 1.2 -1.3 Dudoso > 1.30 Anormal Se altera en presencia de heparina y en presencia de inhibidor de V. No se altera en presencia de inhibidor de VIII.

Estudios de mezclas
P/N: 1:1 o
P N

1:4 (mas sensibles a inhibidores dbiles)

CORRIGE DEFICIT DE FACTORES

NO CORRIGE

PRESENCIA DE INHIBIDORES

IR:

(P+N) - N P

> 0.15

Test Confirmatorio
Prueba de neutralizacin con lisados de plaquetas (APTT, dRVVT, dPT) Alta concentracin de fosfolpidos. Prueba de neutralizacin con fosfolpidos hexagonales. TTI (con lisado de plaquetas)

PNP-APTT
El lisado plaquetario proporciona un exceso de fosfolpidos que reaccionan con los Ac neutralizndolos acortando el tiempo del test de coagulacin. El lisado puede ser in house (250-300 x 103/ L) o comercial. El PNP-APTT debe acortarse 7 o mas segundos con respecto al basal para considerarlo Positivo. Falsos positivos: Presencia de heparina (factor plaquetario que contiene el lisado neutraliza la heparina) y presencia de inhibidor de factor V( el factor V plaquetario)

Fosfolpidos hexagonales
El AL se une preferentemente a los fosfolpidos de configuracin hexagonal ( fosfatidiletanolamina en solucin acuosa) Se realiza: T1 : Paciente + Buffer T T2 : Paciente + FL hex T < 8 seg. NEGATIVO T > o = 8 seg. POSITIVO Alta especificidad: Negativo en inhibidor de VIII, V y XI Alta sensibilidad: prueba confirmatoria positiva en inhibidores dbiles

Anticardiolipinas (ACA)
Se trabaja con suero en lugar de plasma Se miden por ELISA, los isotipos IgG e IgM Mtodo estandarizado: dependiente de 2GPI. Se utilizan estndares de calibracin, control positivo y negativo Los resultados se expresan en unidades estndares para cada Ig uGPL o uMPL : Actividad de unin a Cardiolipina de 1 g/ml de ACA purificado de un suero estndar Negativo : < 15 uGPL / < 20 uMPL Positivo bajo: 15 - 40 uGPL/ 20 40 uMPL Positivo moderado : 40 80 uGPL /uMPL Positivo alto : >80 uGPL/uMPL

Anticuerpos anti-2GPI
Se detectan por ELISA que mide Ac dirigidos contra protenas sin presencia de FL Las placas estn irradiadas lo que aumenta la concentracin antignica. Los grados de positividad son definidos arbitrariamente dependiendo si el ensayo es in house o comercial.

Estudio interlaboratorio de los ensayos para anticuerpos antifosfolpidos(2002)

Realizado por el Comit de Sndrome Antifosfolpido del Grupo Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis

Objetivos: Conocer la metodologa utilizada por cada laboratorio para evaluar el AL y ACA, mediante una encuesta. Evaluar los resultados de ACA informados en una serie de sueros enviados a cada laboratorio participante.

Resultados:
Preanaltica: El 100% realiza doble centrifugacin, sin embargo el 54% utiliza muestras congeladas. Pruebas de deteccin: El 85% usa mas de 2 ensayos diferentes para AL, el 15% usa solo 2.Predominando el APTT( sensibilidad reconocida para AL PTT-LA), el dRVVT (casero o comercial), el dPT (tromboplastina recombinante humano) y el KCT. Ensayos de correccin: El 85% usa pool de plasmas normales para APTT y dRVVT, el 96% en proporcin 1:1. Ensayos de confirmacin: PNP con lisado plaquetario casero para APTT(77%), para dRVVT(62%) y dPT(23%), neutralizacin con FL hexagonales del APTT(50%), prueba de alta concentracin de FL del dRVVT(46%) y comparacin del tiempo de protrombina con el reactivo estndar con el dPT (TTI) solo el 39%.

Ensayos para ACA: El 100% utiliza ELISA, 79% utilizan equipos comerciales, el resto un mtodo desarrollado en el laboratorio. El 96% usa curva de calibracin en cada ensayo. Todos evalan IgG e IgM.

En cuanto a los resultados de las muestras remitidas los grados de concordancia para cada muestra oscilaron entre 14-95 % para ACA- IgG entre 10-90% para ACA-IgM

Al agrupar los datos en resultados positivos y negativos: El consenso mejoraba significativamente pero la concordancia entre diferentes laboratorios no era OPTIMA.

Distribucin de los datos informados por los 20 laboratorios participantes

aCL-IgG
200 150

aCL-IgM
250 200 uMPL 150 100 50 0

uGPL

100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Muestra

10 11 12

Muestra

Valor promedio de referencia (in house method)

Causas probables: Heterogeneidad de los ACA inter- e intra-pacientes Diferencias en las condiciones del ELISA (in house-kit comercial) No evaluacin del pegado inespecfico para ACA-IgM Uso de distintos calibradores Diferentes puntos de corte para resultados positivos y negativos Diferentes rangos de positividad para definir los ttulos

Recomendaciones del foro Europeo de estandarizacin

Usar calibradores y controles basados en anticuerpos monoclonales. Usar unidades arbitrarias para los resultados. Hacer cada test por duplicado. Usar el valor de cut-off determinado por cada laboratorio con al menos 30-50 muestras normales(97-99 percentilo).

Muestras recibidas a travs de la red de hematologa en el perodo 2003-2005

Se recibieron 769 muestras para estudio de trombofilia, inhibidor lpico, anticardiolipinas y homocistenas
Distribucin por hospital
8,5% 0,8% 2,2%

17,7%

ALVAREZ FERNANDEZ IREP PENNA PIROVANO RIVADAVIA SARDA TORNU

27,2% 7,8% 0,9% 33,0% 2,0%

OTROS

Con solicitud de estudio de inhibidor lpico y ACA

Se procesaron 306 muestras 238 eran mujeres (77 %) 68 hombres (23%). La edad media fue de 43 aos en un rango de 16 a 91 aos Se encontraron 86 muestras positivas (28%)

Distribucin segun solicitud

25 20 15 10 5 0 S diag in A V C perd fetales A utoinm unes neurolgicos A bortos y/o T rom bosis S nt O tros 23 21 17 13 9 6 11 %

ACA ttulo > 40

Distribucin de Resultados Positivos

35 30 25 20 15 10 5 0 33

20 15 10 5 0

16 13

2 1 IL solo IL + ACA AMBAS

18 12

16 7
IGM

IGG

1 IL solo IGM IL + ACA AMBAS IGG

13%

13%

IL Positivos(n:30) 23%

17% 17% 17% Autoinmunes SAF(Abortos y/o Tromb). Enf. Hansen Pioderma gangrenoso y otras Control IL KPTT Prolongado Sin Diagnstico

Muestras con Solicitud de ACA

Total de muestras recibidas:313
Total de positivos : 80 pacientes Ttulo > 40 : 22 pacientes

Distribucin de ACA

250 200 150 100 50 0 Con Enf. Auto Sin Enf.Auto 62 34 46 171 Negativos Positivos

DIAGNOSTICO DE ANTICOAGULANTE LUPICO

PROCEDIMIENTOS DE DETECCION APTT+ dRVVT +TTI Anormal TIEMPO DE TROMBINA Normal IDENTIFICACION DE UN INHIBIDOR Estudios de Mezclas Corrige No corrige INHIBIDOR Anormal Neutralizacin de heparina

Correccin Heparina

No correccin Ensayo de Fibrinogeno

Def. de Factores

PROCEDIMIENTOS CONFIRMATORIOS

PRUEBA DE NEUTRALIZACION CON PLAQUETAS PRUEBA DE NEUTRALIZACION CON FL HEXAGONALES CORRECCION NO CORRECCION

ANTICOAGULANTE LUPICO

INHIBIDOR ESPECIFICO