HALĠÇ ÜNĠVERSĠTESĠ MOLEKÜLER BĠYOLOJĠ VE GENETĠK BÖLÜMÜ BIY 471 MOLEKÜLER BĠYOLOJĠ UYGULAMALARI–1 YRD. DOÇ. DR. M.

BAKĠ YOKEġ ASĠSTANLAR SEMĠN MERVE ALOĞLU ġENTÜRK KUTLUHAN ĠNCEKARA DENEY–2 POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU DENEY TARĠHĠ: 21.10.2008 RAPOR TESLĠM TARĠHĠ: 28.10.2008

Raporu Hazırlayan Öğrencinin; Adı-Soyadı: Bölümü: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Numarası ve Sınıfı:

Grup1 Hande Gülçin ÖZER, Tülin TAġCIOĞLU, Zeynep YILMAZ, Elif ERDEM, Adile KIVRAK,, Pınar KESKĠN

PCR ile belli bir bölgeyi çoğaltabilmek için hedef DNA’nın nükleotit dizisi bilinmelidir. YAPILAN ARAġTIRMA GĠBĠ KONULARLA ĠLGĠLĠ AÇIKLAYICI BĠLGĠLER YER ALMALI. DNA ve RNA molekülleri fosfat omurgası sebebiyle negatif yüklüdür (anyon) ve anoda doğru hareket ederler. TIMES NEW ROMAN. YAPILAN DENEYDE KULLANILAN TEKNĠK VEYA MALZEME. gliserol ise örneğin kuyucuklara çökmesini sağlar. PCR döngüsü:  Denatürasyon: DNA molekülünün yüksek sıcaklıkta denatüre edilmesi  Primerlerin DNA’ya bağlanması (annealing): primerlerin spesifik olarak hedef dizilere bağlanması  Uzama (extension): DNA polimerazın uygun tampon ve 4 dNTP varlığında primerin 3’ OH ucundan DNA zincirinin uzamasını sağlaması Art arda tekrarlanan denatürasyon. Molekül ağırlıklarına ve taĢıdıkları elektrik yüklerine göre moleküller jel üzerinde bantlar halinde ilerlerler ve bu ilerleme jel hazırlanırken içine katılan floresan özellikli EtBr’ün DNA’nın bazlarının arasına girmesi ve yükleme esnasında örneklere eklenen BPB gibi bir boyanın jel üzerinde renk (mavi) oluĢturmasıyla takip edilir. Yükleme tamponundaki BPB örneğin jel üzerinde yürürken gözlenmesini. 12 PUNTO ĠLE ĠKĠ YANA YASLANARAK HAZIRLANMALI. Üssel artıĢın nedeni.AMAÇ: Etanol presipitasyonu yöntemi kullanılarak izole edilen epitel hücresinden elde edilmiĢ DNA örneği ile PCR’ı gerçekleĢtirmek ve elde edilen sonuçları optimize etmek. PCR ile istenen gen parçasının klonlanması birkaç saat içinde tamamlanır. spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek enzimatik olarak sentezlenmesi iĢlemidir. ġEKĠL VE TABLOLARA NUMARA VE AÇIKLAMA YAZILMALI. ssDNA’ya bağlanacak primerlerin sentezi için kullanılır. DNA’NIN AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ Elektroforez tekniği moleküllerin sahip oldukları net elektrik yüklerinin bu moleküllerin bir elekriksel alan içindeki hareketlerini etkilemesi prensibine dayanır. primerlerin bağlanması ve dizinin sentezlenmesi evreleriyle DNA parçaları üssel olarak artar. GİRİŞ: POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU PCR.     PCR’ın temel bileĢenleri: DNA: Kalıp görevi görür. bir döngü sonunda sentezlenen ürünün ardıĢık döngüde primerler için kalıp görevi yapmasıdır. Nükleotitler: Yeni DNA ipliklerini sentezler. Primerler: Hedef DNA’ya özgündür. Tampon ve MgCl2: DNA polimerazın aktivitesi için gerekli iyonları (Mg+2) ve uygun pH’ı sağlar. 2 . PCR mekanizması: Çift iplikli bir DNA molekülünde iki oligonükleotit primerin bağlanması ve dizinin kopyalarının sentezlenmesi. Bu bilgi. Böylece her döngü DNA molekülü üzerinde istenen bölgenin 2 katına çıkarılması ile sonuçlanır.

25-30 döngü sonunda DNA miktarında ~106 kez artma olur. 3 .Şekil 1: PCR’ın bir döngüsü Şekil 2: Bir döngü 3-5 dk sürer ve pek çok kez tekrar edilir.

2 ml gliserol) EtBr 100 bp DNA marker Biyolojik Materyaller Etanol presipitasyonu ile izole edilen insan yanak içi epitel hücre DNA’sı MATERYAL. erlen ve plastik tabaklar Cihazlar Güç kaynağı UV Cihazı Minisantrifüj Agaroz Jel Elektroforezi. Kâğıt havlu Agaroz Jel Elektroforez Tankı ve Elektrotlar Metal çubuk. BURADA GÖRÜLDÜĞÜ GĠBĠ SINIFLANDIRILARAK YAZILMALI. Falkon tüp ve 0. MADDELER HALĠNDE VE GENĠġ ZAMAN KULLANILARAK YAZILMALI. tartım tabağı. 4 .2 ml’lik PCR tüpleri Portüp.7’lik Agaroz jel 10X DNA Yükleme Tamponu (25 mg BPB.MATERYAL: Laboratuar Gereçleri Mikro pipet ve pipet ucu (sarı ve beyaz) Ependorf.3). o o o o o o o o o DNA template (biyolojik materyal) 10x PCR buffer (100 mM Tris-HCl (pH=8. SAYFA NUMARASI EKLENMELĠ. Hassas Terazi Kimyasal Malzemeler PCR için. %1 SDS. Eldiven. METOT. 500 mM KCl) MgCl2 dNTP mix 16S-H primer 16S-L primer DMSO Taq polimeraz dH2O %0. ARADA ÇOK UZUN BOġLUKLAR OLMAYACAKSA AġAĞIDA OLDUĞU GĠBĠ YENĠ BAġLIK YENĠ SAYFA BAġINDAN BAġLAMALI.

5 = 11.0 1.5 = 4. 1D tüpleri için PCR reaksiyon içeriği DNA (µl) MgCl2 (µl) 1A 1. Master mix: 10x buffer : 2.0 2. 1H olarak kodlandı.METOT: 8 tane 25 µl’lik PCR reaksiyonu hazırlanmıĢtır: 1. ….0 1.0 B) 1E.5 2.5 = 0.5 = 9.0 0 Master mix (µl) 21 21 21 21 3.9 µl dH2O : 15.85 µl Tablo 1: 1A. 1H tüpleri için PCR reaksiyon içeriği DNA (µl) MgCl2 (µl) 1E 1.0 µl x 4.25 µl 16S-H primer : 1.0 0 Master mix (µl) 21 21 21 21 dH2O (µl) 2.0 µl x 4. 10x buffer : 2. 4. Her tüpe tablolarda verilen miktarlarda master mix eklendi.0 dH2O (µl) 2.0 µl dNTP mix : 1.0 1D 1.5 µl dNTP mix : 1. 1F. 1D tüpleri için.5 1F 1.5 µl x 4.3 µl x 4.5 = 9.  40 çevrim 5 .0 µl x 4.0 2. 2.0 1.0 µl 16S-L primer : 2.5 = 9. Tüpler PCR cihazına yerleĢtirilerek PCR programı uygulandı.0 1G 1.2 µl x 4. 1B.0 3.9 µl dH2O : 13. 1C.5 1B 1.0 1.0 µl x 4. 1C.250V’ta 15 dk yürütüldü ve UV cihazında incelendi. 1G.7’lik agaroz jele yüklendi.3 µl x 4. PCR tüplerinin kapakları marker kalem ile 1A.5 = 68. PCR programı: 2 sa 10 dk 94°C’de 2 dk 94°C’de 30 sn 50°C’de 30 sn 72°C’de 1 dk 72°C’de 5 dk 5.5 µl Taq polimeraz : 0.0 1C 1.5 kat artırılmıĢtır. 1B. Reaksiyon tamamlandıktan sonra PCR ürünlerinin 5 µl’si 1 µl yükleme boyası ile karıĢtırılarak %0.0 3. 1H tüpleri için.85 µl Tablo 2: 1E. Master mix: Master mix’ler pipetleme sırasında oluĢabilecek kayıplara karĢı 4 yerine 4.0 1H 1.0 µl x 4.0 0.5 = 4.0 µl Taq polimeraz : 0.5 µl 16S-L primer : 1.5 = 59.2 µl x 4.0 0. Her tüpe tablolarda verilen miktarlarda titrasyonu yapılacak kimyasallar kondu: B) 1A.5 = 11. 1F.0 µl x 4.5 µl x 4. 1B. 1G.25 µl 16S-H primer : 2.5 = 0.5 = 4.5 2.

► Cummings. F ve G örneklerinde smear gözlenmiĢtir. KĠMYA RAPORLARINDA SONUÇ VE TARTIġMA BÖLÜMLERĠ BĠR ARADA OLUP “SONUÇLAR” BAġLIĞI ALTINDA VERĠLECEKTĠR. Riece. Öner (çev) Genetik ve Evrim (6. Haliç Üniversitesi.altanlab. JB (2009). E. YALNIZCA GÖZLENEN SONUCA DAĠR BĠLGĠLER YER ALMALI. E. ► http://www. Biyoloji I Laboratuar Föyü. En altta tüm kuyucuklarda yükleme boyasının ilerlediği son nokta gözlenmektedir. BEKLENEN SONUÇ ALINMIġSA BUNUN NEYĠ ĠFADE ETTĠĞĠ DÜZGÜN CÜMLELERLE YAZILMALI. San Francisco: Benjamin Cummings Press. B. KĠġĠSEL YORUMLAR YERĠNE BĠLĠMSEL SEBEPLERDEN BAHSEDĠLMELĠ. D ve H örneklerinde bant gözlenmemektedir. A. Biyoloji (8. NA.SONUÇLAR: Şekil 3: Grup 1 için agaroz jelde PCR sonuç görüntüsü Marker 100 bp’lik olup yaklaĢık 1000 bp’e kadar açılarak ilerlemiĢtir. F ve G örneklerinde 800 bp civarında birer bant gözlenmiĢtir. TARTIŞMA: YAPILAN DENEY SONUNDA BEKLENMEYEN BĠR DURUM GÖRÜLMÜġSE NĠYE OLABĠLECEĞĠ. Klug. WS (2003). MA (2008). YORUMLAR TARTIġMAYA YAZILMALI. REFERANSLAR: ► Tüfekçi. HATANIN NEREDEN KAYNAKLANABĠLECEĞĠ. Ankara: Palme Yayıncılık. ► Campbell. MR. B. C.baskı). Genetik Kavramlar C.baskı) içinde (713-733).htm (EriĢim tarihi: 20 Ekim 2011) 6 .com/mikroskop_eliza.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful