TCNICAS HISTOLGICAS

La histologa se define como la rama de las ciencias morfolgicas, que se encarga del estudio de las clulas, tejidos y rganos. Para poder realizar tal estudio se cuenta con un instrumento especial: EL MICROSCOPIO, el cual puede ser ptico, electrnico, de contraste de fases, campo oscuro, de fluorescencia, de interferencia. Para poder observar un tejido a travs de l, la muestra debe ser procesada bajo una serie de requisitos de preparacin, los cuales dependern del microscopio a utilizar, luego: EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS DESTINADOS A OBTENER LAS PREPARACIONES HISTOLGICAS SE DENOMINA: TCNICAS HISTOLGICAS, Y LA CIENCIA ESTUDIA LOS FUNDAMENTOS TCNICOS Y LA SECUENCIA DE MANIPULACIONES NECESARIAS PARA LLEVAR A CABO EL ANLISIS DE LOS TEJIDOS DE LOS SERES VIVOS SE LLAMA HISTOTECNOLOGIA. Segn la procedencia de los tejidos y la finalidad de su estudio, podemos distinguir entre material histolgico y material anatomopatolgico; el primero es todo tejido obtenido de un individuo animal sano, con la finalidad de estudiar su estructura y composicin normal, mientras que el segundo se trata de muestras provenientes de individuos animales enfermos, con la finalidad de diagnosticar el proceso patolgico que presenta. Para poder llevar a cabo este estudio microscpico, las muestras pueden ser observadas mediante: Examen Inmediato al fresco Examen Mediato Postmorten. Se entiende por examen inmediato, al fresco estudio citohistolgico vital, aquel estudio citolgico y histolgico que se realiza sobre clulas tejidos vivos sin que estos hayan sido separados del ser que los contiene, ejemplo la observacin de la micro circulacin sangunea sobre un lecho capilar traslcido, debido a su dificultad se efecta muy pocas veces. Hay autores que utilizan el trmino de Estudios Supravitales; los cuales consisten en el estudio de las clulas tejidos an vivos pero separados del organismo del que proceden, ejemplo de esto tenemos en el estudio de la gota gruesa y la tcnica en medios de cultivo. Otro tipo de estudio inmediato es aquel en el cual se toma la muestra (tejido liquido corporal) y se coloque entre una lmina porta y cubre objetos y se observa al microscopio, las estructuras all detalladas dependen de las diferencias entre los ndices de fraccin de los diferentes componentes celulares, lo cual nos permite tener una idea somera y rpida de los elementos constituyentes de la muestra y presencia no de los agentes patgenos,

sin embargo estos mtodos tienen limitaciones: la limitada capacidad para detallar estructuras y las preparaciones son poco duraderas. Podemos concluir aqu con la definicin de Vialleton: Por examen inmediato se entiende la observacin microscpica de elementos anatmicos, hecha directamente sobre elementos vivos al menos en estado lo ms prximo posible al que presenten durante la visa El examen Mediato Postmorten, para algunos autores postvitales, es aquel mtodo en el cual se somete al tejido a una serie de procedimientos complejos con la finalidad de detallar las estructuras celulares y tisulares, es el llamado mtodo de cortes. Se entiende por biopsias a una porcin de tejido obtenido de un individuo vivo para su estudio anatomopatolgico mientras que extensin citolgica o frotis: Es el conjunto de clulas procedentes de un tejido y extendidas sobre un porta objetos, cuando se obtienen este conjunto de clulas de un tejido sobre porta objetos producto del contacto directo de este con la superficie de corte de rgano sin que sea preciso el raspado o exfoliacin previa del mismo, hablamos que la preparacin as obtenida se llama impronta. ETAPAS PARA OBTENER PREPARACIONES HISTOLGICAS PARA M.O. 1.- Obtencin del material: Es importante que toda muestra a estudiar debe ser descrita exhaustivamente donde se seale: dimensiones, peso, color, forma, presencia o no de lesiones (descripcin de la misma) relacin con estructuras vecinas, consistencia, presencia de formaciones qusticas, hemorragia necrosis. Luego debe realizarse un buen muestreo es decir seleccionar las reas ms representativas de las mismas y dichas muestras deben de tener un espesor no mayor de 3-5 milmetros, para facilitar la fijacin y la impregnacin con parafina y un largo y ancho que permite ser colocado en la lmina porta objetos. 2.- FIJACIN: La vida es un proceso dinmico por el que el organismo completa su ciclo biolgico y muerte es un nivel metablico a partir del cual las clulas no son capaces de recuperar sus funciones vitales (punto de no retorno). Dentro del conjunto de fenmenos que se llevan a cabo despus del punto de no retorno, deben sealar al proceso de autlisis al proceso auto digestin enzimtica que se lleva a cabo luego del punto de no retorno por la ruptura de la membrana lsosomial, con la siguiente salida del contenido lisosomial al citoplasma. Se extiende por putrefaccin, el efecto ejercido por agentes txicos y enzimas bacterianas sobre los tejidos, que actan junto con la autlisis y llevan a la destruccin total de la clula.

Se denomina Fijacin Tisular, al proceso mediante el cual se interrumpe se impide la degradacin tisular (autlisis y putrefaccin). Luego de la manera ms simple, podemos decir que la fijacin significa conferir estabilidad a los tejidos, sin embargo la mejor definicin es la da por Lynch en 1972: LA FIJACIN ES EL PROCESO MEDIANTE EL CUAL SE LE CONFIERE ESTABILIDAD Y PRESERVA LOS ELEMENTOS CONSTITUTIVOS DE LA CLULA Y POR TANTO DE LOS TEJIDOS, EN CUANTO A SU ESTRUCTURA FSICA Y PARCIALMENTE EN SU ESTADO QUMICO PROPSITOS DE LA FIJACIN a.- Prevenir detener la autlisis. b.- Prevenir la composicin bacteriana putrefaccin. c.- Coagular el tejido, para evitar la prdida de sustancia. d.- Fortalece y protege los tejidos contra los defectos deletreos de los diferentes pasos de la preparacin del tejido. e.- Deja a los tejidos en condiciones que permitan diferenciar estructuras mediante tinciones y coloraciones especiales. Se entiende por fijador a toda una sustancia que permita la conservacin del tejido tanto a nivel fsico (macro y micro) como qumico de la clula. Conservador es toda sustancia en la que puede permanecer el tejido por tiempo prolongado, sin que sucedan modificaciones en su estructura. CLASIFICACIN DE LOS AGENTES FIJADORES Se clasifican de manera general en dos grupos: a.- Fijadores por mtodos fsicos: Fro y Calor. b.- Fijadores por mtodos qumicos: Coagulantes, No coagulantes, mixtos. La fijacin por mtodos fsicos son de la eleccin para la realizacin de estudios morfolgicos funcionales, en los que se requiere contenido enzimtico, la clave de este mtodo (Fro), es que la congelacin sea rpida ya que el enfriamiento lento forma microcristales intratisulares de hielo. Los fijadores por mtodos qumicos se clasifican dependiendo del mtodo de accin sobre las protenas. Coagulantes: son los que se combinan con las protenas para hacer un compuesto insoluble. Ej. cido Tricloroactico, cido Pierco, Cloruro de Mercurio y las que desnaturalizan a las protenas. Ej. Alcohol Absoluto.

No coagulantes: actan mediante la polimerizacin de las protenas, es decir mediante la formacin de complejos de adiccin, creando enlaces entre las molculas de protenas. Ej. Formalina y cido actico. Mixtos: renen ambas caractersticas. Ej. Solucin Actica de Zenker, solucin frmica de Zenker, solucin de Carnoy y liquido de Bouin.

Cada fijador tiene un perodo de tiempo mnimo para llevar a cabo la fijacin. Este perodo viene condicionado por varios factores, as como: pH, temperatura, modo de accin densidad del tejido y espesor del espcimen. La influencia del pH y la temperatura varia con cada fijador. Con respecto al espesor de la muestra, se dice en general que la mayora de las veces una fijacin inadecuada es producto del excesivo grosor de la pieza, debiendo colocarse la misma en un volumen de fijador igual a 20 veces el volumen de la muestra. FIJADORES MS COMUNES FORMALDEHDO-FORMALINA-FORMOL: (Gas Slida) Es el fijador ms frecuente utilizado por su costo y su calidad que es bastante aceptable. Esta solucin produce cido frmico durante su almacenamiento por lo que se recomienda neutralizarla con magnesio carbonato de calcio ms satisfactoriamente con la adicin de sales buffer. No es recomendable utilizarla en solucin concentrada y es necesario diluirla en solucin salina (fisiolgica) en soluciones salinas buffer en una proporcin de 10 partes de formalina y 90 partes del diluyente, es decir el 10%. Es de accin lenta a temperatura ambiente, penetra a razn de 1 cms por hora. Fija bien el material a nivel ptico y tiene la desventaja de producir precipitado formlico. Liquido de Bouin: es un buen fijador en general, es un preparado de formol con cido prico, es costoso, de accin rpida permite un buen detalle nuclear y es recomendable para la fijacin de tejidos que sern sometidos a coloraciones tricrmicas, no se recomienda dejar el material mucho tiempo en fijacin ya que lo reseca y endurece. Lavado Post-fijacin: es el aclarado que se realiza a la muestra despus de la fijacin para eliminar el exceso de fijador y evitar el precipitado del mismo as como evitar la incompatibilidad entre el fijador y el elemento a utilizar en el paso siguiente del procesamiento de la muestra. 4.- Deshidratacin:

Para poder cortar los tejidos en secciones de 5 micras de espesor, hay que conferirle rigidez, lo cual se logra mediante dos mtodos: a. El ms rpido que es mediante la congelacin de la muestra para lo cual se necesita el paso N 2 (fijacin). b. El que sustituye todo el agua del tejido por una sustancia rgida como la parafina, la celoidina las resinas. En general los medios de inclusin no son hidrosolubles, por lo que se necesitara eliminar el agua del tejido mediante la deshidratacin del mismo, para lo cual se pasa la muestra en 7 alcoholes de concentraciones crecientes, hasta que el agua sea remplazada por el alcohol. Este paso debe producirse poca ninguna retraccin del tejido. La buena deshidratacin depende de la buena calidad del alcohol, de la adecuada concentracin del mismo, as como del tiempo de permanencia en cada uno de los alcoholes que por lo general no debe ser menor de 1 hora cada uno. Las condiciones esenciales de un buen agente deshidratante son: a. No debe alterar las estructuras tisulares. b. Debe perder mezclarse con el reactivo intermedio aclarante. El alcohol preferido para deshidratacin es el alcohol etlico absoluto, otros deshidratantes son: Alcohol metlico, acetona (aumenta mucho la fragilidad del tejido), alcohol butlico (es miscible con la parafina por lo que se puede prescindir del agente aclarante),etc. 5.- CLARIFICACIN O DESALCOHOLINIZACIN: Su finalidad no es como su nombre lo indica, el hacer transparente al tejido no en este caso en particular, se necesita de una sustancia que sea soluble con la parafina y el alcohol. La parafina es una sustancia insoluble en agua y poco soluble en alcohol, de aqu que se utilice una sustancia intermedia miscible con el alcohol y la parafina. Se utilizan 3 Xiloles, una hora en cada uno previo pasaje por una solucin de Alcohol Xilol. Sustancias clarificantes: Xilol: buen clarificante, de accin rpida, endurece poco los tejidos (sino permanece largos periodos). Tolueno: buen clarificante produce menos retraccin y endurecimiento que el xilol. Cloroformo: es ideal para SNC y los ganglios. No produce retraccin ni endurecimiento, pero es muy caro. Nota: Los buenos agentes aclarantes deben eliminar pronto el alcohol y aclarar rpidamente el tejido sin endurecimiento del mismo.

6.- IMPREGNACIN:

Este paso tiene `por objeto rellenar por completo los espacios intra y extracelulares inicialmente llenos de agua, con parafina para as proporcionar a la muestra homogeneidad y dureza que favorezcan la obtencin de secciones finas de calidad, sin provocar distorsin y sin alterar las relaciones especiales del tejido y de los elementos celulares. Se dan dos baos de parafina de 45 minutos cada uno. 7.- INCLUSIN: Consiste en la obtencin de un bloque slido que permita obtener cortes finos y conserve la muestra por tiempo prolongado. Medios de Inclusin: a. b. c. d. Parafina: es el ms frecuente utilizado. Celoidina. Doble inclusin Parafina- Celoidina. Resinas: se utilizan cuando se desean realizar cortes muy finos menores a 2 micras.

8.- CORTE Y MONTAJE: Se lleva a cabo los micrtomos. Se practican secciones de 4-6 micras de espesor, luego se colocan los cortes en el bao de mara de flotacin el cual nos va a permitir estirar los cortes (agua a 60 con gelatina o albmina de huevo); los cortes se montan en los portaobjetos y se colocan en la estufa a 60 y 70 durante a 20 a 30 minutos. En la estufa se elimina el exceso de parafina y simultneamente el corte se adhiere a la lmina.

9.- COLORACIN: Coloracin de rutina con H-E: Batera: Dos xiloles. Tres alcoholes. Hematoxilina de Meyer o Harris. Agua cida o amoniacal: Para la hematoxilina de Harris y agua sola para llevar la Hematoxilina de Meyer. (Diferenciacin) Eosina. Tres alcoholes. Tres xiloles.

a. Xiloles: Sirven para desparafinar o eliminar el resto de parafina que est dentro del material. b. Alcoholes: Se utilizan de manera decreciente para hidratar la muestra, ya que los colorantes son elementos hidrosolubles. c. Agua: Se debe lavar la muestra para eliminar el exceso de alcohol y terminar de hidratarla. Por otra parte acta como mordiente para las hematoxilinas de alumbre y simultneamente prepara el material para la hematoxilina coloree mejor. d. Hematoxilina: Colorante nuclear bsico, colorea el ncleo porque tiene afinidad por las estructuras cidas. e. Diferenciacin: Proceso mediante el cual la Hematoxilina reafirma su coloracin y se elimina la misma del resto del tejido. Primero se pasa por agua para eliminar el exceso de colorante. Nota: Cuando la Hematoxilina utilizada es la Meyer solamente utilizamos agua, pero cuando se usa la de Harris (que son las dos ms utilizadas), primero se usa y luego agua cida, en este caso ambos pasos (agua sola y agua cida) eliminan el exceso de colorante: seguidamente se lava con agua amoniacal, para evitar que siga actuando la Hematoxilina y por ltimo nuevamente se lava con agua solamente. Se usa cheques la coloracin nuclear al microscopio, los cuales deben estar teidos de azul violeta. f. Eosina: Colorante citoplasmtico, cido. Colorea el citoplasma de rosado. g. Alcoholes: Tres alcoholes de manera creciente, que nos permite eliminar el exceso de eosina y simultneamente deshidratar la muestra. h. Xiloles: Tres xiloles, los cuales cumplen la funcin de aclaracin, fijacin del colorante y lo prepara para montar el corte con el blsamo preservador. i. Colocacin de cubreobjetos: Se coloca el blsamo y el cubreobjetos. Conceptos: Colorante: Toda sustancia que tie, producto de su capacidad de fijarse cambiarse con una estructura celular y adems tiene la capacidad de absorber una determinada longitud de onda de la luz. Coloracin: Es la incorporacin del colorante al tejido,. Impregnacin: Se utiliza este trmino para definir el precipitado de una sal por ejemplo Nitrato de Plata, sobre algn elemento del tejido. Ortocromacia: Cuando el componente tisular toma el mismo color que el colorante .

Metacromasia: Cuando el componente tisular producto de su constitucin de su distribucin de cargas polares, toma un color diferente al del colorante. Alocromasia: Cuando el tejido toma diferentes tonalidades, debido a la presencia de diferentes agentes tintoriales. Coloracin especifica: Se basa en la identificacin de diferentes elementos producto de reacciones qumicas conocidas. Es la base de la Histoqumica. Coloracin directa: Cuando un tejido en presencia de soluciones simples toma color. Mordiente: Es la sustancia que tiene afinidad por el colorante y por un componente tisular, actuando como intermediario entre el colorante y el tejido. Coloracin indirecta: Es aquella que necesita de la presencia de un mordiente para llevarse a cabo. Coloracin cido: Es aquel colorante capaz de formar una unin salina con un grupo tisular cargado positivamente, de aqu que el colorante est cargado negativamente Ej. Eosina, Orange G, Floxina. Colorante bsico: Es aquel colorante capaz de formar una unin salina con un grupo tisular cargado negativamente, es decir el colorante est cargado positivamente, Ej. Hematoxilina, Fucsina bsica, Azul de Tolouidina, Azul de Metileno. Acidofilia: Es la capacidad que tiene un componente tisular de combinarse con un colorante cido. Basofilia: Es la capacidad que tiene un componente tisular de cambiarse con un colorante bsico. Diferenciacin: Es la eliminacin selectiva del colorante, generalmente s el colorante es bsico se logra con una solucin cida y viceversa.

COLORANTES HABITUALES ESPECIALES Dada la necesidad de estudiar una o varias estructuras en un corte histolgico, se crean las coloraciones tri-tetra pentacromticas, las cuales

se hacen sobre la base del uso de 3-4-5 colorantes diferentes, los cuales son capaces de diferenciar el mismo nmero de elementos. Otros tipos de coloraciones especiales son las utilizadas para identificar elementos como grasas, glucgeno microorganismos patgenos. Tricrmico de Gomori: Es especifico para las mucinas sulfatadas, se utiliza para la identificacin de fibras colgenas. Resultados: Ncleos: Azul negruzco / Negros (Hematoxilina frrica) Fibras musculares, Fibrina citoplasma: Rojo (Cromotopo 2 R) colgeno, Cartlago, Mucina y Membranas basales: verde (verde rpido). Tricrmico de Van Gieson: Es un mtodo til y sencillo, se utiliza para la identificacin de fibras colgenas. Resultados: Ncleos: Negros (Hematoxilina Frrica) Citoplasma: Amarillo (cido Picrico) Colgeno: Rojo (Fucsina cida) Tricrmico de Mallory: Se utiliza para la identificacin de tejido conjuntivo. Resultados: Ncleos rojo (Azocarmn G) citoplasma, fibras musculares: Naranja rojizo (Naranja G) Colgeno: Azul (Azul Anilina) Coloraciones para Hongos: Los hongos son microorganismos vegetales que pueden causar enfermedades en determinadas condiciones y de acuerdo a su morfologa se clasifican en: Hifas (filamentos), esporas y filamentos con esporas. La coloracin ms frecuente utilizada es el mtodo de Grocott. Resultados: Hongos: Negro Tincin de fondo: Verde plido Mucina gris: