Ciencias Exactas y Naturales - Ingenieras y Tecnologas Investigacin

Determinacin de cidos oleico y linoleico del suero sanguneo humano por HPLC de fase inversa*
Miguel A. Puttini**, Carlos M. Vuarant***, Julio Fournier, Claudia Lesa, Csar Huter, Juan Ruz Daz, Anala Romero

Para determinar si los cidos grasos constituyentes de los triacilglicridos, fosfolpidos y steres del colesterol influyen sobre los niveles de colesterol y triacilglicridos en sangre, y si stos, a su vez, se relacionan con las modificaciones estructurales de las LDL que se producen como consecuencia de la naturaleza de estos cidos grasos, fue necesario modificar y estandarizar el mtodo de Folch (1957), con el objeto de extraer los lpidos sanguneos, obtener los correspondientes steres metlicos y as poder resolver y cuantificar por HPLC en fase inversa. En este artculo se sealan los avances obtenidos en la cuantificacin de dos cidos grasos: cido oleico y cido linoleico, luego de que las muestras fueran tratadas por el mtodo de Folch, modificado por este equipo de trabajo, resaltndose las virtudes de la HPLC para su tratamiento.

Palabras clave: lipoprotenas - cidos grasos - steres metlicos

*) Artculo elaborado en el marco del proyecto de investigacin: Efectos de la composicin en cidos grasos de los lpidos del plasma humano sobre la fisicoqumica de las lipoprotenas, Facultad de Ciencias de la Alimentacin (UNER); remitido para publicacin en marzo 2003, aceptado en abril 2005. **) Docente investigador, director del equipo de investigacin, fallecido en julio 2003. ***) vuarantcm@fcal.uner.edu.ar Ciencia, Docencia y Tecnologa N 30, Ao XVI, mayo de 2005

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Determination of Oleic and Linoleic Acids from Human Blood Serum by Reverse-Phase HPLC*

Miguel A. Puttini**, Carlos M. Vuarant***, Julio Fournier, Claudia Lesa, Csar Huter, Juan Ruz Daz, Anala Romero In order to determine if the fatty acids that constitute triacylglycerides, phospholipids and esters of cholesterol, influence on cholesterol and triacylglycerides levels in blood, and if these, in turn, are related to structural modifications of LDLs that are produced as a consequence of the nature of these fatty acids, it was necessary to modify and standardize Folchs method (1957), with the aim of extracting blood lipids, obtaining the corresponding methyl esters, and thus solving and quantifying by reversephase HPLC. In this article we indicate the advancements obtained in the quantification of two fatty acids: oleic acid and linoleic acid, after the samples were treated by Folchs method, modified by this work team, highlighting the virtues of HPLC for its treatment.
Key words: lipoproteins - fatty acids - methyl esters

*) Article derived from the research project Effects of Fatty Acids of the Human Plasma Lipids Composition Upon the Lipoproteins Physical and Chemical Parameters, College of Food Sciences, UNER; submitted in March 2003 and accepted in April 2005. **) Professor and researcher, Director of the research team, died in July 2003. ***) vuarantcm@fcal.uner.edu.ar

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I. Introduccin Los lpidos: triacilgliceroles, colesterol, steres del colesterol, cidos grasos, fosfolpidos y esfingolpidos son insolubles en el medio acuoso biolgico; su unin a protenas especficas los mantiene en solucin o en suspensin como microemulsiones (Carey,1992). Las lipoprotenas del suero sanguneo humano son microemulsiones estables con una gran diversidad estructural, causada por diferencias en el contenido y clase de las protenas y lpidos que las constituyen. De acuerdo al mtodo utilizado para separarlas se clasifican segn su densidad, tamao o movilidad electrofortica. Se sabe que cada clase de lipoprotena est integrada por una poblacin de partculas semejantes pero no idnticas. La principal razn de esta heterogeneidad es que, en un momento dado y dentro de cada clase, se encuentran partculas en distintos estadios de procesamiento por los diferentes esquemas metablicos que controlan las interacciones de las lipoprotenas entre s y con los tejidos (Fenema, 1993). Las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas de las diferentes clases de lpidos se deben, en gran parte, a su composicin en cidos grasos; ya que stos constituyen un amplio rango de molculas de las cuales slo unas pocas se presentan en cantidades elevadas en la naturaleza (Pine,1993). La HPLC (High Performance Liquid Cromatografy) en fase inversa es una tcnica adecuada para la separacin y cuantificacin de los cidos grasos ms comnmente hallados; la fase estacionaria ms utilizada consiste en el grupo octadecilsilil (C18) covalentemente unido a partculas de silicagel. Los steres metlicos de los cidos grasos son los derivados ms frecuentemente usados en los anlisis por HPLC en fase inversa. Con esta tcnica, los esteres metlicos de los cidos grasos insaturados eluyen a la cabeza de los correspondientes cidos grasos saturados, y aproximadamente cada doble enlace reduce el tiempo de retencin por el equivalente de dos tomos de carbono (Nollet, 1996). La separacin de una mezcla de esteres metlicos de distintos cidos grasos se obtiene con una columna C18 de 250 mm de largo x 4 mm de dimetro interno y un tamao de partcula de 4 micrones, eluda isocrticamente con una fase mvil de acetonitrilo-agua (80:20, v/v). En
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las mismas condiciones pero reemplazando la columna recomendada por una C18 de 100 mm, se logr un resultado aceptable, lo que demuestra una vez ms las bondades de esta tcnica. II. Materiales y Metodologa Los materiales y equipos utilizados fueron: - Espectrofotmetro, Cromatgrafo lquido de Alta resolucin HewletPackard HP 1100 con Chemstation (software) para control del instrumento, adquisicin y procesado de datos. Detector VWD. Columna C18, 100 mm. de largo, dimetro interno: 4 mm., dimetro de partcula 4 micrones. Precolumna ODSC18 tamao de partcula 5 micras. Reactivos que se emplearon: - n-Hexano calidad cromatogrfica Licrhosolv Merck. - Metanol Fisher calidad HPLC. - Cloroformo -Merck, calidad ACS. - Acetonitrilo Fisher, calidad HPLC - Benceno, Fisher, calidad HPLC. - Sodio (Metlico), para preparacin de Metxido de Sodio. - Agua calidad HPLC - Testigos de Ac. Oleico, Ac. Linoleico, SUPELCO , pureza 99,9%. Se trabaj con muestras de suero sanguneo humano normal, obtenido de personas adultas jvenes de ambos sexos, con clnica y perfil lipdico normal. A todas ellas se les realiz un perfil lipdico, que incluy las determinaciones de Colesterol Total, Colesterol - LDL, Colesterol - HDL, Triacilgliceroles y Fosfolpidos, adems de las determinaciones de Acido rico y Glucosa en suero. Para la confiabilidad de los datos, cada uno de los mtodos analticos utilizados en HPLC fue validado segn el siguiente procedimiento: Reproductibilidad: mediante el procesado simultneo de triplicados de las mismas muestras, y utilizando los siguientes parmetros estadsticos:

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X =

i =1

Xi
S =

i =1

( X i X )2 N 1

CV =
X : media aritmtica. S : desviacin estndar CV : coeficiente de variacin.
_

S
_

100

Linealidad: se efectuaron las correspondientes curvas de calibrado para verificar la misma. Recuperacin: se agreg una cantidad conocida de analito estndar a las muestras, en el rango de linealidad determinada. Mtodo de control de calidad: estndar interno. Se tomaron como valores de referencia a los considerados en los mtodos validados, usados y corroborados segn el procedimiento anterior. II.1. Muestreo y extraccin de los lpidos del suero Las muestras se obtuvieron mediante la extraccin de sangre venosa, previo ayuno de doce horas, en cantidad de 10 ml. La sangre se dej coagular y se separ del suero antes de que transcurrieran dos horas; se conserv en heladera, a 2-7C.
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Como la tcnica descripta por Folch en 1957 trabajaba sobre una muestra slida con una concentracin proteica mayor a la que se nos presenta, se vio que modificando inicialmente la proporcin de cloroformo metanol (2+1) se poda acortar notoriamente el proceso de desnaturalizacin de la fraccin proteica, y que al extracto obtenido no era necesario agregarle ClK dado que tena ya una concentracin salina adecuada. Por otra parte, el tercer paso era necesario nicamente cuando no se lograba llevar a residuo seco, lo que mejor notablemente el tiempo de extraccin. De tal forma, se resolvi procesar las muestras segn la tcnica de extraccin de lpidos de Folch (1957) modificada por este equipo de trabajo, siguiendo el procedimiento que a continuacin se describe: Suero sanguneo: 1 ml + mezcla de Folch (cloroformo-metanol (2+1): 45 ml + agitar magnticamente 1 hora + agregar 8 ml de agua + homogeneizar + centrifugar 5' (min) a 2500 r.p.m. + extraer capa superior con pipeta y desecharla + agregar 20 ml de una mezcla de cloroformo - metanol - agua (3:48:47; en volmenes) + homogeneizar + centrifugar 5' a 2500 r.p.m. + extraer capa superficial con pipeta + repetir el anterior lavado una vez ms + extraer capa superior con pipeta + filtrar a travs de papel de filtro la fase inferior remanente + lavar el tubo de centrfuga y el filtro con 5 ml de cloroformo + evaporar al vaco a 45 C. si quedara un remanente de agua, adicionar 10 ml de benceno, que con el agua remanente forma un azetropo benceno - agua (91,1 : 8,9 p/p) de p.eb.= 69,4 C y destilar al vaco a 45 C a sequedad. Las diferencias entre ambas tcnicas (la original y la propuesta) se sintetizan en la Tabla 1.

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EXTRACCION DE LIPIDOS FOLCH (1957) 1 gr muestra + 13,3 ml de cloroformo + metanol (1+1) y homogeneizar por espacio de 5 a 10 segundos, posteriormente adicionar 6,7 ml de cloroformo y homogeneizar por 2 hs. (para desnaturalizar las protenas).

EXTRACCION DE LIPIDOS FOLCH MODIFICADO Suero sanguneo: 1 ml + 45 mezcla de Folch (cloroformo-metanol (2+1): + agitar magnticamente 1 hora + agregar 8 ml de agua + homogeneizar + centrifugar 5' (min) a 2500 r.p.m. + extraer capa superior con pipeta y desecharla. Agregar 20 ml de una mezcla de cloroformo - metanol - agua (3:48:47; en volmenes) + homogeneizar + centrifugar 5' a 2500 r.p.m. Evaporar al vaco a 45C.

Agregar 4.2 ml de ClK 0,37 M, se homogeneiza y se centrifuga a 3.000 rpm durante 5. Se destila hasta residuo seco a 40 C bajo vaco.

Eliminar el remanente con una redestilacin Eliminar el agua remanente por redestilacin con etanol absoluto. con benceno; se forma un azetropo benceno - agua (91,1 : 8,9 p/p) de p.eb.= 69,4 C ; destilar al vaco a 45 C a sequedad. Los lpidos son redisueltos en cloroformo y Las muestras se refrigeran y se procesan en se almacenan a -20C con BHT. 24 hs.

Tabla 1. Diferencias entre el Mtodo de Folch (1957) y la propuesta

II.2. Preparacin de los steres metlicos Los steres metlicos se prepararon de la siguiente manera: se tom el residuo con 3 ml de n-hexano y se transfiri a un tubo con tapa a rosca. Posteriormente, se adicionaron 0,25 ml de metxido de sodio 0,5 N en metanol, se agit fuertemente 2 minutos, se dej decantar y separar cuantitativamente la capa superior de hexano que es la que contiene los esteres metlicos de los cidos grasos. II.3. Esterificacin de los cidos grasos patrones(1) Los patrones de cidos grasos se esterificaron utilizando el siguiente mtodo: en un tubo con tapa a rosca de 10 ml se colocaron los mg necesarios para obtener la concentracin deseada de solucin patrn, luego se adicionaron 6 ml de hexano. Posteriormente se agregaron 0,25 ml
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de metxido de sodio 0,5 N en metanol. La mezcla se agit vigorosamente por 1,5 min y luego se centrifug a 2000 r.p.m. durante 3 min. La parte superior contiene los metil steres que luego se resolvieron por H.P .L.C. II.4. HPLC Fase Inversa El equipamiento a utilizado fue: - Cromatgrafo lquido de alta resolucin Hewlett - Packerd HP-1100. - Columna C18, 100 mm de largo, dimetro interno: 4 mm, dimetro de partcula 4 micrones. Fase mvil isocrtica acetonitrilo-agua (93:7 v/ v). - Flujo: 1ml/min; Temperatura: 35C; Detector UV 200 nm. III. Resultados III.1. Cromatograma obtenido de una mezcla de soluciones testigos de los cidos grasos en estudio. En la pgina siguiente se reproduce el cromatograma que muestra el efecto de la composicin de los cidos graso sdel plasma humano sobre la fsico-qumica de los LDL.

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III.2. Anlisis de los cidos grasos Se analizaron soluciones patrn de cidos oleico y linoleico en nhexano, cuya concentracin es de 0,40 mg/ml y de 1,00 mg/ml respectivamente. Con respecto a la precisin, se procesaron por triplicado cada una de las soluciones patrn, comprendiendo cada anlisis: 1) Obtencin de los steres metlicos de los cidos grasos. 2) Su resolucin y cuantificacin por HPLC.

PATRN c. Oleico c. Linolnico

X1 0.3870 1.0120

X2 0.4150 1.1500

X3 X (media) 0.4080 0.4033 0.9800 1.0473

S CV % 0.01457 3.61 0.09034 8.63

Se grafic, a su vez, la correspondiente curva de calibrado para cada uno de los cidos analizados; esto fue utilizando 3 concentraciones diferentes para cada uno y cuantificando cada una por triplicado, para luego obtener la medicin promedio y emplearla en dicha curva. Resultados obtenidos para el cido oleico:

x1 0.2432 0.4875 0.7521

x2 0.2367 0.4659 0.7480

x3 X (media) 0.2498 0.2432 0.4768 0.4767 0.7246 0.7416

S CV % rea (mAU*s) 0.00655 2.69 1.45E+04 0.01080 2.27 2.16E+04 0.01483 2.00 4.26E+04

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Curva de calibrado para el cido Oleico

C u rv a c . O le ic o
0.8000 Concentracin (mg/ml) 0.7000 0.6000 0.5000 0.4000 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000 1.45E + 04 2.16E + 04 4.26E + 04 A r e a (m A U * s) R 2 = 0.9987

Resultados obtenidos para el cido linoleico:

x1 0.5432 0.9987 1.5510

x2 0.5198 0.9754 1.5219

x3 X (media) S CV % rea (mAU*s) 0.5264 0.5298 0.01206 2.28 2.88E+04 0.9868 0.9870 0.01165 1.18 5.15E+04 1.5300 1.5343 0.01502 0.98 8.35E+04

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Curva de calibrado para el cido Linoleico

C u r v a c . L in o le ic o
1.800 1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 2.88E + 04

Concentracion (gr/lt)

R 2 = 0.9973

5.15E + 04

8.35E + 04

A re a (m A U *s)

III.3. Anlisis de las lipoprotenas del suero humano: determinacin de los cidos oleico y linoleico Precisin: Se analizaron tres muestras de suero sanguneo humano normal por triplicado. Los valores obtenidos se muestran a continuacin:

c. Oleico c. Linolnico

x1 0.4471 0.9920

x2 0.3904 0.9475

x3 X (media) 0.4485 0.4287 0.9266 0.9554

S CV % 0.0383 8.93 0.0366 3.83

Exactitud: Para determinar este parmetro se analizaron tres muestras de suero sanguneo normal por triplicado, antes y despus del agregado de 0,50 ml de solucin patrn de cido oleico, y 0,50 ml de solucin patrn de cido linoleico a 1 ml de suero, previo al proceso de extraccin. 190
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Acido Oleico en suero sanguneo Los valores obtenidos, como mencionamos anteriormente, son los siguientes:
x1 0.4471 x2 0.3904 x3 X (media) 0.4485 0.4287 S CV % 0.0383 8.93

c. Oleico

Valor esperado de cido oleico despus del agregado de 0,25 mg de cido oleico.

x = 0,6787 mg/ml
Determinacin de cido oleco despus del agregado de 0,50 ml de solucin patrn de cido oleico (0,25 mg).

c. Oleico

X (media) 0.6370

S CV % 0.04446 6.98

Error Absoluto: 0,6370 - 0,6787 = -0,0417 mg/ml. Error Relativo %: -0,05 x 100 = -6,1 % 0,6787

Acido linoleico en suero sanguneo:

c. Linolnico

x1 0.9920

x2 0.9475

x3 X (media) 0.9266 0.9554

S CV % 0.0366 3.83

Valor esperado de cido linoleico despus del agregado de 0,50 mg de cido linoleico.

x = 1,4554 mg/ml

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Determinacin de cido linoleico despus del agregado de 0,50 ml de solucin patrn de cido linoleico (0,50 mg).

c. Linoleico

X (media) 1.4359

S CV % 0.05469 3.81

Error Absoluto: 1,4359 - 1,4554 = -0,0195 mg/ml. Error Relativo %: -0,0195 x 100 = -1,34 % 1,4554 IV. Discusin Los resultados obtenidos en la determinacin del cido oleico y del cido linoleico en el suero sanguneo humano muestran la precisin de esta tcnica en ambas determinaciones, descripta por los coeficientes de variacin 7,1 y 7,6 % respectivamente. La exactitud expresada en trminos de error absoluto y de error relativo (-0,0417 y 6,1 % respectivamente, en la determinacin de cido oleico, y -0,0195 y 1,34 % en la de cido linoleico), indican que los resultados obtenidos son menores que el valor verdadero. El mismo signo y magnitud de los errores en las mediciones repetidas definen a ste como un error sistemtico. Concluyendo, dadas las necesidades analticas y las dificultades del problema analtico, podemos considerar a este mtodo como razonablemente preciso y exacto, lo que lo hace adecuado para el trabajo que se pretende realizar. Notas
1) Nollet, 1996, pg. 359.

Referencias bibliogrficas
CAREY, F. A. (1992). Organic Chemistry. 2 ed. Nueva York, Mc Graw Hill, 1992. FENNEMA, O.R. (1993). Qumica de los Alimentos. 2 ed. Espaa. Acribia. PINE, S.H. y col. (1993). Qumica orgnica. 4 ed. Mxico, Mc Graw Hill. NOLLET, L.M. (1996). Handbook of food analysis. Vol I. Marcel Dekker, New York.

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