OBTECION DE CULTIVOS DE MICROORGANIMOS CULTIVOS. Un cultivo es el crecimiento de poblaciones microbianas de forma controlada en un medio artificial.

Un cultivo segn su composicin qumica puede ser: Sintticos: Tiene una composicin qumica definida. Cuanto ms simple es mejor purificamos los productos de la bacteria. Complejos: su composicin es no conocida, no sirve para purificar los compuestos pero en ellos puede crecer cualquier microorganismo. (Ej. caldo glucosado). Segn el estado fsico del medio los cultivos pueden ser: Lquido, slido, semislido. Depende de si el agar es ms o menos gelatinoso. El agar es un compuesto formado por agarosa que es un polmero de galactosa al 70% y de agaropectina al 30%. Es slido cuando existe el 1.5-2% de agar, semislido (para estudios de mivilidad) cuando la concentracin es de 0.15-04% y es lquido cuando hay menos del 0.15% de agar. APLICACIONES: Medios enriquecidos: Aaden nutrientes a los cultivos donde el microorganismo exige mucho. (Ej. sangre para que crezca Hemofilus) Medios selectivos: Aaden compuestos al agar que permiten el crecimiento selectivo de los microorganismos. Ej. Cristal violeta: slo crecen Gram-; Maltosa: Slo crecen los que tengan la enzima maltasa; Penicilina: slo crecen eucariotas; etc.) Medios diferenciales: Los microorganismos crecen de forma diferente, aadiendo al medio sustancias especiales (sangre). Se usa tambin viraje de colores. Ej. en sangre diferenciamos los organismos hemolticos de los que no los son; en EMB (eosina azul de metileno vemos los que aprovechan lactosa de los que no; medio McConky (rojo neutro); en sales de pb vemos los productores de SH2 que dan un precipitado negro de lo que no lo producen.Un ejemplo tpico es el caldo comn, que es glucosa ms extracto de carne, y peptona , se ajusta el pH, se aade NaOH, tamponamos, filtramos, espesamos y por ltimo esterilizamos. SIEMBRA: TCNICAS E INSTRUMENTOS: .- INSTRUMENTOS: Asa de siembra: picadura. Asa de vidrio. Pipeta Pasteur. .- TCNICAS: De lquido a placa: Se puede hacer de dos formas: a) Estra en placa, Asa de cultivo asa de vidrio. b) Extensin en placa. De lquido a tubo: Se puede hacer: a) En tubo inclinado. Aumenta la superficie. b) En Tubo no inclinado. Por picadura. c) Semislido. Por picadura. Tambin se puede transferir a un cultivo puro. OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS 1. Siembra en superficie. Extensin y estra. 2. Vertido en placa. Mezclando los microorganismos con agar fundido a 44C, y se echa luego sobre la placa. Los microorganismos crecen en la superficie y dentro 3. Tcnicas de enriquecimiento. Aplicar el elemento adecuado (por ejemplo benzoato) al tubo de ensayo, se aslan microorganismos que no se aslan con los mtodos anteriores y que estn en pequeas cantidades (como pueden ser aquellos que slo usan benzoato). Se debe realizar varias veces para asegurarnos que tenemos un cultivo puro. (Otros ejemplos: elevada temperatura para termfilos; calentamiento a 80C para esporulados y termfilos.) 4. Dilucin seriada. Slo aslo el microorganismo ms abundante. (Lister con Streptococcus lactis hace diluciones, cada dilucin la siembra en 20 tubos, cuando de un dilucin dlo crece el 5% la probabilidad de que en ese tubo crezca 1 alo tipo de microorganismo es del 4.8%, as estamos seguros de que slo existe un tipo de microorganismo). 5. Micromanipulador: aislamos una sola clula utilizando este aparato. 6. Aislamiento de microorganismos anaerobios. Micromanipulados. Obtenemos los organismos anaerobios por una adicin de agar a 44C, mezclamos y tapamos con parafina (aceite estril). Eliminamos el O2 con agentes reductores (tioglicolato, aadimos un colorante REDOX para ver cuando se ha reducido), con una vela que consuma el oxgeno, usamos la jarra de anaerobios (sistema que produce CO2 + H2 y un catalizador que consume O2). Cuanto ms sensibles son ms precauciones tenemos que tomar. PARAFINA

CARACTERIZACIN DE CULTIVOS PUROS Las colonias deben ser iguales en forma, tamao y color. Que no existan formas inhibidas. Al microscopio deben tener un aspecto comn. Tiene que tener iguales propiedades tintoriales.

 Deben ser bioqumicamente y fisiolgicamente iguales. .- Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia. MANTENIMIENTO 1.- Debemos transferir peridicamente, ya que los tubos de agar se secan, se evapora el agua. 2.- Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede hacer ms tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer. 3.- Se disminuye la temperatura, congelamos las clulas. Para proteger las clulas y que no se formen cristales que las daen se usa el glicerol 4.- La liofilizacin es la sublimacin a alto vaco de las muestras congeladas con rapidez.

http://www.elergonomista.com/microbiologia/loscultivos.htm
En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas en el laboratorio en cultivos puros (o axnicos). En ocasiones el estudio molecular conduce a la caracterizacin de los microorganismos, an en poblaciones mixtas. Sin embargo la identificacin bacteriana y la caracterizacin completa solo es posible tras el aislamiento de la bacteria y la obtencin de cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de los microorganismos presentes (enn una muestra patolgica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el aislamiento es posible obtener la bacteria de inters en cultivo puro .

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Aislamiento
Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio de cultivo slido adecuado dispuesto en una placa de petri. Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao , consistencia, etc.. Los tipos de bacterias presentes en la muestra original es visible como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor nmero de estras posible. En las primeras estras aparecern colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estras finales debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie. Criterios para la diferenciacin de colonias El aspecto de las colonias, su coloracin, tamao, etc. permiten diferenciar diferentes bacterias, aunque son propiedades generales muy influenciadas por las condiciones de cultivo, por lo que a continuacin se realiza una descripcin muy general. Las colonias pueden ser opacas, translucidas o transparentes. Algunas producen pigmentos fluorescentes cuando se iluminan con luz ultravioleta. Otras aparecen con superficie pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o poseen anillos concntricos. En ocasiones el olor es tambin caracterstico.

Obtencin de cultivos puros

Se trata de obtener el cultivo de un solo tipo microbiano en un medio de cultivo, por ejemplo en un tubo inclinado de agar nutritivo. Para ello, se obtiene una pequea cantidad de masa bacteriana de una colonia separada en el aislamiento. Con ella se inocula un nuevo medio de cultivo haciendo estras muy juntas. La incubacin en condiciones adecuadas

proporcionar un cultivo puro. Puede repetirse el proceso con cada tipo de colonia. Se obtendr una coleccin de cultivos puros, separados, de los microorganismos que coexistan en la muestra original. Es aconsejable hacer un segundo aislamiento antes de proceder a la obtencin del cultivo puro. Si todas las colonias de la segunda placa resultan idnticas, puede usarse una de ellas para establecer el cultivo puro. Obtenido el cultivo puro es conveniente comprobar su pureza mediante una tincin de Gram. Los cultivos puros de microorganismos son mantenidos en el laboratorio porresiembras (pase de un medio de cultivo a otro) sucesivas. Una de las copias puede ser liofilizada para su conservacin.

http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/aislamiento

Estudio de la morfologa colonial INTRODUCCION Si se toma un asa bacteriolgica cargada con una muestra que contenga bacterias y se van haciendo estras de sta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera que el material se vaya diluyendo sobre la superficie (Fig. 12.1), llegar un momento en que las bacterias depositadas en la estra estn bien separadas unas de otras, reproducindose cada una en progresin geomtrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, etc.). Dependiendo del tiempo de generacin, que vara segn la especie bacteriana, despus de cierto tiempo, cada una se habr multiplicado muchas veces, formando sobre la superficie del medio un pequeo promontorio constituido por clulas bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas. Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamao, color, consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases. Cada colonia aislada est constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la descendencia de una sola clula y por tanto, un cultivo puro. Para estudiar las caractersticas fsicas, qumicas, fisiolgicas, etc., de una bacteria, se necesita que sta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en caja Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una porcin de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza despus de la incubacin apropiada, mediante observacin al microscopio. La morfologa de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe familiarizarse el alumno con ella. (Fig. 12.2). La terminologa mencionada a continuacin sobre algunas de las caractersticas ms constantes de una colonia bacteriana es muy til: MICROBIOLOGIA APLICADA Manual de Laboratorio FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc. TAMAO: Estimar el dimetro en mm. SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc. ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada, etc. BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc. ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa. COLOR: Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc. OPACIDAD: Transparente, opaca, etc. CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el asa bacteriolgica para determinar la consistencia. http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p12.pdf