PRCTICA No.

DETERMINACION Y CURVA DE CRECIMIENTO DE MICROOGANISMOS (E. COLI Y LEVADURA CANDIDA).

EQUIPO No 1.
GUZMN LPEZ AMAYRAN CONCEPCIN. HERNNDEZ GUZMN MARIO. JIMNEZ PINTO DIANA CAROLINA. MENDOZA SANTIAGO DAYANA CAROLINA.

ING. BIOQUMICA.

5to. SEMESTRE.

CATEDRTICA: QBP. AURA FLORES PREZ.

TUXTLA GUTIRREZ, CHIAPAS. NOVIEMBRE DE 2009.

DETERMINACIN DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO GENERAL: CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI Y DE LA LEVADURA CANDIDA. OBJETIVO ESPECIFICO: CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. COLI (UFC) EN CALDO NUTRITIVO MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO KLETT) CADA 2 HORAS DURANTE 24 HORAS. CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA (COLONIAS) INOCULADO EN CALDO NUTRITIVO MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO KLETTS) CADA 12 HORAS DURANTE 96 HORAS.

CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. COLI EMPLEANDO LA TECNICA DE VACIADO EN CAJAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO (72 HORAS DESPUES DE SU INOCULACION) MEDIANTE EL RECUENTO DE UFC. .CUANTIFICAR EL NUMERO DE CELULAS DE LA LEVADURA CANDIDA POR UN RECUENTO DIRECTO (CON DILUCIONES) EMPLEANDO LA CAMARA DE NEUBAUER. CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA MEDIANTE DIFERENCIAS DE MASA.

INTRODUCCION
Cuando un microorganismo es colocado en un medio nutricionalmente completo aumenta de tamao y con el tiempo se reproduce para formar nuevos individuos dando como resultado una poblacin de clulas vegetativas no diferenciadas. La Escherichia coli es una bacteria gram (-) que se encuentra generalmente en los intestinos animales y en aguas negras. es anaerbico facultativo; mvil por flagelos pertricos (que rodean su cuerpo); no forma esporas; se puede inocular en Agar y caldo nutritivo(por poseer todo tipo de nutrientes son excelentes para su uso),Agar E.M.B, Agar McConkey, etc.; es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa ;y su prueba de IMVIC es ++--. Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de gentica y biotecnologa molecular porque es ampliamente conocida su organizacin, estructura y funcin. Adems, se han modificado E. coli para ser usada en laboratorio sin riesgos patognicos. Generalmente las bacterias se reproducen por fisin binaria. Las levaduras en general son clulas esfricas a elpticas cuyo dimetro vara de 3-15m. Si bien unas pocas levaduras se reproducen por fisin binaria la mayora se reproduce por brotacin o blastoconidios. Despus de la proliferacin en un medio con agar durante 1-3 das las levaduras producen colonias plidas y opacas y en general alcanzan un dimetro de 0.5 a 3 mm. Las especies del gnero Cndida producen levaduras elipsoides o esfricas con brotes que miden alrededor de 3 a 6 m. De manera habitual se forman mltiples brotes y pseudohifas en medios deficientes de sustratos fcilmente metabolizables. Los medios para el recuento de levaduras son: Medio sabouraud Oxiteclicina, glucosa, agar (O.G.A) MEDIO DE PATATA, GLUCOSA AGAR (P.D.A) Extracto de levadura, glucosa y agar Medio de jugo de uva (para enologa) o medio mosto de cerveza ( para cervecera) Estos medios se hacen selectivos frente a numerosas bacterias por la acidificacin a pH 4-3.5. Existen varios mtodos para medir el crecimiento microbiano: Mtodos indirectos: son aquellos que utilizan parmetros distintos del n de clulas, pero que pueden relacionarse de forma directa con ste (masa celular, actividad metablica, etc.).Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y as la velocidad de crecimiento de la poblacin puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parmetros. Entre los mtodos indirectos se encuentran:

 Determinacin del peso seco (bacterias y levaduras). Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el n de clulas proporcional a sta. Este mtodo, aunque lleva tiempo, es til como referencia en el trabajo de aislamiento y purificacin de otros mtodos. Determinacin del nitrgeno celular. Medir el contenido proteico del cultivo. Determinacin del DNA Determinacin de una actividad metablica segn el tipo de microorganismo: consumo de oxgeno (en aerobios), liberacin de CO2 u otro producto de fermentacin, aumento de la concentracin de alguna enzima constitutiva, incorporacin en la clula de algn material radiactivo, etc. Medida de la turbidez del cultivo (bacterias y levaduras). Se basa en la capacidad de las clulas y partculas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. La turbidez es proporcional al nmero de clulas y puede medirse utilizando un espectrofotmetro. El espectrofotmetro es un aparato que hace pasar la luz a travs de una suspensin celular y detecta la luz no dispersada, es el mtodo mas difundido para la estimacin de la biomasa total en suspensin. Las tcnicas turbidimtricas son totalmente tiles para determinar tanto la masa de clulas durante el desarrollo, como para evaluar los efectos antimicrobianos en bacterias. Una aplicacin directa de turbidimetra es la realizacin de una curva patrn en la que se relaciona la medida de la absorbancia con el nmero de clulas viables del cultivo. Simultneamente a las medidas de absorbancia se realizan recuentos en placa (bacterias). Frecuentemente las muestras naturales tienen un numero muy elevado de microorganismos (bacterias), por lo que se requiere diluirlas de forma seriadas que posteriormente se siembra en placas con el medio de cultivo adecuados. Esta tcnica de recuento por diluciones seriadas nos permite conocer el nmero de microorganismos viables en una determinada muestra. La inoculacin de la placa con la muestra que contiene los microorganismos pueden realizarse: a) directamente sobre el medio ya solidificado en la placa (mtodo de extensin sobre placa); b) mezclndolo previamente con el medio fundido y temperado, para verterlo despus sobre la caja petri vaca (mtodo en vertido en placa o siembra en profundidad). Es el mtodo ms habitual para la determinacin de clulas viables se basa en contar el nmero de colonias UFC. La viabilidad en microbiologa se define como la capacidad del microorganismo para dividirse y dar lugar a una descendencia. El mtodo ms habitual para la determinacin de clulas viables se basa en contar el nmero de colonias UFC.

Mtodos directos: son aquellos en los que se cuenta el n total de clulas en un volumen
conocido y as se estima el n total en la poblacin. Entre ellos: Recuento directo del n de clulas al microscopio (levaduras). Se utilizan portas especialmente diseados para el recuento celular y son denominados cmaras de recuento en donde un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta (hemacitmetros, cmaras de Petroff-Hauser, Neubauer o de Helber) estas consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen. Este mtodo tiene el inconveniente de que no diferencia entre clulas viables y no viables. Es poco preciso. Contadores electrnicos. Las clulas son suspendidas en un fluido conductor que pasa Lentamente a travs de una abertura fina por la que pasa una corriente elctrica permiten medir la distribucin de tamaos y el nmero de clulas en las suspensiones bacterianas pero son muy costosos. Cuando en un medio adecuado se inocula con bacterias o levaduras y se toman muestras pequeas a intervalos regulares, la representacin grafica de los datos dar una curva de crecimiento caracterstico. La curva de crecimiento bacteriano se puede dividir en cuatro fases: fase de latencia, fase del crecimiento exponencial, fase estacionaria y fase de declinacin. Fase de latencia: durante esta fase hay un aumento de los componentes macromoleculares, de la actividad metablica y de la susceptibilidad a los agentes qumicos y fsicos. Fase de crecimiento exponencial: en esta fase las clulas se encuentran es un estado equilibrado .Durante este periodo la masa ye l volumen de las clulas aumentan por el mismo factor y de tal manera que la composicin promedio de las clulas y las concentraciones relativas de los metabolitos se mantienen constantes.

Fase estacionaria: en esta fase hay productos de desecho, agotamiento de nutrientes,

la variacin del pH y otros factores que ejercen un efecto nocivo sobre el cultivo, lo que produce una disminucin de la velocidad de crecimiento.

Fase de muerte celular. Las clulas mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de la nutriente y/o excesiva acumulacin de sustancias txicas. A veces la muerte va acompaada de lisis celular y esto disminuye la absorbancia del cultivo.

MARCO TEORICO
El crecimiento microbiano se define como un incremento en el n de clulas, es decir, se refiere al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada clula individual y su divisin celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: 1. El microorganismo en s. As por ejemplo, en condiciones ptimas E. Coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos por que en una poblacin joven el nmero de bacterias muertas es mnimo. 2. La composicin del medio de cultivo. Las clulas crecern ms lentamente en un medio mnimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecern ms o menos rpidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal).Por ejemplo el crecimiento de las bacterias sobre un medio de cultivo liquido es claramente exponencial. 3. Las condiciones de incubacin. La temperatura de incubacin, la concentracin de CO2 en la atmsfera de cultivo, la agitacin, etc. son factores importantes. Por ejemplo para las bacterias patgenas el ptimo de crecimiento se consigue a los 37C y para las levaduras y otros hogos, a 25C. 4. La procedencia y caractersticas del inculo. La curva de crecimiento variar dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc. En general, los hongos se desarrollan mejor a la temperatura de la habitacin (20 a 25C) o a 37C, comnmente en un medio de pH 5.5 a 6.5. La mayora de los hongos son aerobios. Para el aislamiento se usa con ms frecuencia el medio de ensayo o de conservacin de Sabouraud y el medio de Pensilvania. En la mayor parte de los medios de especies del gnero Cndida no pueden identificarse sobre la base del aspecto de sus colonias. En 24 48 horas producen colonias sobreelevadas, de color crema y opacas, a aproximadamente 1 a 2 mm de dimetro. Despus de varios das en un medio con agar es posible observar hifas que penetran en el agar. El proceso de crecimiento del microorganismo (levadura) se desarrollara en condiciones aspticas y a temperatura ambiente, la homogenizacin y aire reaccin del medio de cultivo se realizara en forma manual cada doce horas por 7 das. El medio de caldo de maltosa Sabouraud esta especificado para el desarrollo de levaduras, mohos y bacterias as como la investigacin en las pruebas de esterilidad. En este medio de crecimiento de mohos se parece a esferas de algodn ms o menos grande. Se modifican y adoptan la forma de capas membranosas mientras que el crecimiento de levaduras o bacterias se manifiesta por turbidez homognea que se reconoce por investigacin microscpica. En contraste, las bacterias se reproducen por fisin binaria a un ritmo mximo promedio de cada 20 min, pero este ritmo se mantiene solo por un corto periodo.

METODOLOGIA
CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO (E. Coli) 1.- Preparacin del medio de cultivo; Caldo nutritivo (150 ml, 3 matraces nefelomtricos con 50 ml) y agar nutritivo para la tcnica de vaciado en cajas (por duplicado).

2.- Toma de muestra de una cepa pura cultivada en el cepario del laboratorio de microbiologa del ITTG.

3.- Inoculacin Matraz 1: Colocar 2 ml de la muestra (cepa pura) en un matraz nefelomtrico que contiene 50 ml de caldo nutritivo, previamente esterilizado. Poner en agitacin el matraz una vez inoculado a 110 revoluciones /minuto. Hacer lecturas en el turbidmetro Klett cada 2 horas. Matraz 2: Inocular 2 ml de muestra a un matraz con 50 ml de caldo nutritivo estril, agitar y posteriormente hacer diluciones 1:9 para inocular en cajas petri, con la tcnica de vaciado por duplicado. Cada dos horas tomar las lecturas de densidad ptica (Klett), hacer las diluciones y la inoculacin en cajas para estudiar su crecimiento. Para comprobar el efecto antimicrobiano de un producto comercial y estudiando el crecimiento de la bacteria. Utilizamos el jabn Escudo. Colocando en dos cajas petri una pequea proporcin de solucin del jabn preparada con agua, sobre determinadas reas y en estas inocular por la tcnica de estra masiva. Matraz 3: Blanco, servir de referencia para verificar el crecimiento (turbidez) de la bacteria comparndolo con ste.

LEVADURA 1.- Preparacin del medio de cultivo: Caldo YM para el cultivo de la levadura Cndida. Preparar matraces con 50 ml de caldo YM. Esterilizar. 2.- Inoculacin: Tomar 2 ml de muestra, inocular en un matraz nefelomtrico con caldo estril, agitar y leer su contenido de clulas en la cmara de Neubauer. Posteriormente filtrar el contenido del matraz con ayuda de una bomba de vaco, el papel filtro debe estar a peso constante, para determinar su biomasa. ..Filtracin:

Para determinar su biomasa: diferencia de pesos. P1 = peso del papel filtro a peso constante. P2= peso del papel con la muestra (levadura)
P2 p1= peso neto total de levadura.

Repetir este paso cada 12 horas durante 4 das.

En un segundo matraz inocular 2 ml de muestra en 50 ml de caldo YM, someter a agitacin (110 rpm) durante 12 horas, posteriormente leer su densidad ptica en el equipo Klett.

RESULTADOS E. coli
Se realizaron 6 lecturas, cada 2 horas, en las cuales se midieron dos datos, lectura en el Klett y las UFCs (conteo en placa). La siguiente tabla muestra los datos obtenidos: No. De lectura (Hora) 0 1 2 3 4 5 6 Hora Lectura en el Klett UFCs / ml 09:00 11:00 2.5 68 x 106 13:00 55 25 x 106 15:00 102 557 x 106 17:00 185 1155 x 106 19:00 209 1314 x 106 21:00 202 2200 x 106

Tabla 1: datos obtenidos de las lecturas cada dos horas de los matraces, en el Klett y conteo en placa.

Graficando lo datos, para demostrar el crecimiento bacteriano se obtiene la siguiente curva normal de crecimiento:

Curva de crecimiento E. coli

250 200 Unidad Klett 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 14

tiempo (c/ dos horas) .Grafica 1: que muestra el crecimiento microbiano, por los datos de turbidimetra (Klett) y las lecturas cada 2 horas.

Conteo en placa de UFC de e. coli y turbidimetra en el equipo Klett

Imagen 1: conteo en placa---------------------------------------------Imagen 2: equipo Klett (turbidez, lectura)

Crecimiento de e. coli en caja petri:

-------------Imagen 3: agar nutritivo inoculado con e. coli

Levadura (Cndida)
Se realizaron 6 lecturas, cada 12 horas durante 4 das, midiendo dos tres datos: a) Turbidimetra (Klett) b) Conteo de microorganismo (cmara de Neubauer) c) Biomasa (diferencias de peso en papel filtro)
Los datos obtenidos se muestran a continuacin: No. Fecha Lectura UFCs Klett Dilucin 1 Lunes 09/11 08:00 5777.5 260 1:10 2 Martes 10/11 10:30 56,500 405 1:100 (martes noche) 3 20:40 66,900 465 1:100 4 Mircoles 11/11 08:40 140,900 485 1:100 (Mircoles Noche) 5 20:40 208,500 >1000 1:100 6 Jueves 12/11 08:40 214,500 >1000 1:100 --------------------Tabla 2: Datos obtenidos en la lecturas del Klett y conteo en placa

Para obtener la grafica que muestre el crecimiento de la levadura, se graficaron dos datos, la lectura en el Klett y el conteo en la cmara de Neubauer.

Crecimiento de la levadura
250000 200000 Conteo Neubauer 150000 100000 50000 0 0 20 40 Tiempo (c/ 12 horas) ..Grafica 2: Conteo de microorganismos en Neubauer vs tiempos de lecturas. 60 80

Conteos en cmara de Neubauer:--------------------------------Conteo en placa:

Imagen 4: Conteo en cmara de Neubauer---------------Imagen 5: conteo en placa de levaduras

CALCULO DE LA BIOMASA DE LA LEVADURA (DIFERENCIA DE PESOS) P2-P1 = PESO NETO TOTAL DE LEVADURA. P1= Peso del papel filtro a peso constante P2=Peso del papel filtro con muestra.
Tabla 3: Muestra los pesos de los papeles filtro a peso constante y con muestra biolgica (levadura filtrada, por vacio), obteniendo la diferencia de ambos se tiene la biomasa. Graficando dicho dato vs las lecturas hechas.

Peso constante. Papel filtro

0 0.16 0.23 0.23 0.18 0.16

Peso con muestra 0 0.34 0.48 0.54 0.48 0.49

Horas de lectura 0 12 24 36 48 60

Biomasa (peso de levadura)

0 0.18 0.25 0.31 0.30 0.33

Graficando Horas de lectura vs Biomasa, se obtiene la siguiente grafica

CURVA BIOMSICA
0.35 GRAMOS DE LEVADURA 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 0.18 0.25 0.31 0.3 0.33

TIEMPO (HORAS)

----------Grafica 3: muestra los gramos de levadura vs los tiempos de lectura hechos.

------Dicha grafica muestra, que conforme las horas de agitacin pasaban, la levadura creci de una manera impresionante, pesando incluso gramos de organismo. La levadura (hongos), en general son los microorganismos que pueden pesarse. Se muestra un grafica normal de crecimiento de microorganismo.

DISCUSION DE RESULTADOS
La cepa utilizada de E. Coli para la inoculacin fue una reserva que llevaba das, dando como resultado un crecimiento no muy ptimo. Otro factor importante que provoco un desajuste en los resultados en la segunda lectura de UFC/ml fue provocado por la contaminacin de una caja inoculada, esto ocurri por una mala esterilizacin del rea de trabajo. Otro factor prescindible en los resultados de la misma lectura fue el calentamiento excesivo de la pipeta con la que se inoculo causando la muerte de las bacterias y dando un resultado muy pequeo. El resultado total del conteo de UFC/ml se realizo a las 48 despus de las inoculaciones hechas y no a las 24 horas que era lo correcto. Las ltimas dos lecturas En equipo Klett se obtuvo un resultado aproximado debido a que el rango de lectura del equipo no fue suficiente para el conteo de las levaduras. Los datos en el clculo de la biomasa, as como los datos de los pesos de los papeles filtro, no fueron correctos.

CONCLUSIN
Segn los resultados obtenidos en la tabla de E. coli, nos muestra una curva normal de crecimiento, demostrando as que el crecimiento bacteriano fue casi ideal y continuo. En el caso de la inoculacin utilizando un producto comercial antimicrobiano (jabn Escudo), se estudio el efecto de dicho producto, cual funcin fue psima, ya que no hubo inhibicin de ningn tipo, las colonias fueron notorias en el medio inoculado. Las UFC crecieron alrededor del agente. Comprobando as la mala funcin de este. El crecimiento bacteriano fue de mayor rapidez en comparacin del crecimiento de la levadura, pero su biomasa fue mayor en esta ltima.

Bibliografa

Bacteriologa principios y practicas, Bryan h. Arthur, Mxico D.F. 1983, editorial continental S.a. de C.V., 8 ed. Dicit ; Bacterias y levaduras ;jueves 16 de octubre de 2008 http://dicitblog.blogspot.com/search/label/Divulgaci%C3%B3n%20cient%C3%ADfica Microbiologa, Zinsser; Argentina 1994, Editorial Medica panamericana, 20 ed. Microbiologa alimentaria, Bourgeois, Zucca, Mescle; Editorial Acribia S.A.