UniversidadAndrsBello FacultaddeCienciasBiolgicas DepartamentodeCienciasBiolgicas

GUIADETRABAJOSPRACTICOS MICROBIOLOGIAGENERAL BIO055

Carrera: NutricinyDiettica

SEGUNDOSEMESTRE2011

NDICE

CONTENIDO INTRODUCCINALLABORATORIODEMICROBIOLOGA N1TCNICASBSICASDEMICROBIOLOGAYMORFOLOGA BACTERIANA N2MORFOLOGABACTERIANA:EXAMENMACROSCPICOY MICROSCPICO.TINCIONES. N3FLORANORMALYFISIOTAXONOMADEBACTERIASGRAM POSITIVO.ANTIMICROBIANOS N4FISIOTAXONOMADEBACTERIASGRAMNEGATIVO. ANTIMICROBIANOS N5AISLAMIENTOBACTERIANODESDEALIMENTOS. N6HONGOSUNICELULARESYFILAMENTOSOS

PGINAS 917 1831 3444 4766 6988 8995 98105

ObjetivosdelPrcticodeMicrobiologa
Altrminodelcursoprctico,elalumnodebersercapazde: 1. Identificarelmaterialhabitualutilizadoenlaprcticadelamicrobiologa. 2. Manipular correctamente el material de laboratorio y los cultivos de microorganismos. 3. Aislar y propagar microorganismos tanto de muestras heterogneas (por ejemploalimentos)comoapartirdecultivospuros. 4. Identificar correctamente formas y agrupaciones bacterianas mediante observacinmicroscpica. 5. Emplear distintas formas de tincin para identificar microorganismos o estructurasimportantesdeestos. 6. Utilizarlainformacinderivadadelaactividadmetablicademicroorganismos sobredistintossustratos,confinestaxonmicos(identificacin). 7. Realizar estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos para diferenciar bacteriassegnsugradodesensibilidadaciertosantibiticos. 8. Aislar y propagar levaduras y hongos filamentosos tanto de muestras heterogneascomoapartirdecultivospuros. 9. Reconocer y diferenciar la morfologa macroscpica y microscpica de levadurasyhongosfilamentosos.

Programadetrabajosprcticos
1. Procedimientosbsicosdemicrobiologa Identificacin del material de uso microbiolgico. Clasificacin y utilidad de mediosdecultivo.Tcnicasdesiembraenmediosdecultivoslidosylquidos. Obtencindecoloniasaisladas,anlisismacroscpicodestas. 2.Morfologabacteriana:Examenmacroscpicoymicroscpico.Tinciones. Crecimientoycultivoendistintosmediosdecultivo.Descripcinmacroscpicade colonias.Tincionesyanlisismicroscpicodelasbacteriasenestudio:Morfologa yagrupacin;tincindeGram,tincindecpsula,tincindeesporas.Anlisisde muestrasalfresco. 3. FisiotaxonomadebacteriasGrampositivo: Pruebas bioqumicas para cocceas Gram positivos. Estudio de sensibilidad a antibiticos. Estudio de las alteraciones producidas por la accin bacteriana en mediosdecultivo:Hemlisis.AnlisismicroscpicodebacteriasGrampositivo. 4. FisiotaxonomadebacteriasGramnegativo: Pruebas bioqumicas para Gram negativo: Batera bioqumica y API. Estudio de sensibilidad a antibiticos. Estudio de las alteraciones producidas por la accin bacterianaenmediosdecultivo:Utilizacindelactosa.Anlisismicroscpicode bacteriasGramnegativo. 5. Aislamientobacterianodesdealimentos: Metodologas de enriquecimiento y aislamiento de microorganismos presentes en alimentos ya sea como contaminantes o constituyentes de los mismos. Aislamientodeenterobacterias,Staphylococcussp.,Pseudomonassp.,Vibriosp.y Lactobacillussp.Usodemediosdecultivoselectivosydiferenciales. 6. Hongos:LevadurasyMohos Descripcin macroscpica y microscpica de levaduras y hongos. Anlisis de estructuras reproductivas. Cultivo de hongos provenientes de muestras de alimentosyaseacomocontaminantesoconstituyentesdelosmismos.

Profesoresysecciones:
Horario : Mircoles, mdulos 1 y 2 (8:30 - 10:10 hrs.) Jueves, mdulos 1 y 2 (8:30 - 10:10 hrs.) Sesiones cada 15 das

Secciones 1 y 2: Profesores Leslie Daille y Milka Darlic

Secciones 3 y 4: Profesores Francisca lvarez y Jorge Irarrzaval

Secciones 5 y 6: Profesores Anilei Hoare y Alejandro Gonzlez

Seccin 7: Profesores Nicols Villagra y Matas Jofr

Salas de Laboratorio: Laboratorio de Microbiologa I (LAB 206): Secciones 1 y 2 Laboratorio de Microbiologa II (LAB 207): Secciones 3 y 4 Laboratorio de Biologa IV (BIO 204) Secciones 5 y 6 Laboratorio de Biologa V (BIO 117): Seccin 7

Evaluacin:
El curso se aprueba con nota final igual o superior a 3.95, segn planilla de clculo del sistema en Intranet. No existir ningn tipo de interrogacin y/o trabajo para subir nota. La nota de presentacin se calcular de acuerdo a los siguientes parmetros: 1) Pruebas de entrada 60 % 2) Informes 40 % El promedio de las actividades sealadas con la ponderacin establecida corresponde a la nota de presentacin. Promedio Final: 1) Nota de presentacin 70% 2) Examen Terico-Prctico 30 %

La nota final se expresa con un solo decimal. En este caso, cuando la centsima sea igual o mayor a 0,05 se aproximar a la dcima superior. Por su parte, si la centsima es igual o menor a 0,04 se mantiene el decimal. Esto de acuerdo al siguiente ejemplo: Nota final : 3,95 3,94 se aproxima a 4,0 (aprobado) se mantiene en 3,9 (reprobado)

Pruebas Recuperativas Slo tendrn derecho a Prueba Recuperativa aquellas inasistencias debidamente justificadas en la Escuela. Ante la inasistencia a una sesin de laboratorio, se realizar un control recuperativo slo cuando est debidamente justificado y hayan entregado una fotocopia de la aceptacin del certificado mdico al profesor que corresponda. Independiente del trabajo prctico al cual el alumno haya faltado, se realizar un control al final del semestre y contemplar TODOS los contenidos de los trabajos realizados. Los alumnos que obtengan nota 1,0 como consecuencia de llegar atrasados al trabajo prctico NO TIENEN DERECHO a recuperar esa nota. No se contemplan actividades recuperativas para los informes de laboratorio. Condiciones de eximicin Se eximirn del examen final SLO aquellos alumnos que alcancen una nota 5,5 superior. (Condiciones establecidas que se rigen segn el Reglamento del Alumno de Pregrado, Artculo 40).

Cronograma de actividades
AGOSTO Mircoles 24: Jueves 25: Mircoles 31: Organizacin del curso SECCIONES IMPARES Organizacin del curso SECCIONES PARES Prctico 1: Procedimientos Bsicos I SECCIONES IMPARES

SEPTIEMBRE Jueves 1: Mircoles 7: Jueves 8: Mircoles 14: Jueves 15: Mircoles 21: Jueves 22: Mircoles 28: Jueves 29: Prctico 1: Procedimientos Bsicos II SECCIONES IMPARES Prctico 1: Procedimientos Bsicos I SECCIONES PARES Prctico 1: Procedimientos Bsicos II SECCIONES PARES Prctico 2: Morfologa Bacteriana I SECCIONES IMPARES Prctico 2: Morfologa Bacteriana II SECCIONES IMPARES Prctico 2: Morfologa Bacteriana I SECCIONES PARES Prctico 2: Morfologa Bacteriana II SECCIONES PARES Prctico 3: Gram positivos y Flora Normal I SECCIONES IMPARES Prctico 3: Gram positivos y Flora Normal II SECCIONES IMPARES

OCTUBRE Mircoles 5: Jueves 6: Mircoles 12: Jueves 13: Mircoles 19: Jueves 20: Mircoles 26: Jueves 27: Prctico 3: Gram positivos y Flora Normal I SECCIONES PARES Prctico 3: Gram positivos y Flora Normal II SECCIONES PARES Prctico 4: Fisiotaxonoma de Gram negativos I SECCIONES IMPARES Prctico 4: Fisiotaxonoma de Gram negativos II SECCIONES IMPARES Prctico 4: Fisiotaxonoma de Gram negativos I SECCIONES PARES Prctico 4: Fisiotaxonoma de Gram negativos II SECCIONES PARES Prctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos I SECCIONES IMPARES Prctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos I SECCIONES PARES

NOVIEMBRE Mircoles 2: Jueves 3: Mircoles 9: Jueves 10: Mircoles 16: Jueves 17: Mircoles 23: Jueves 24: Mircoles 30: Prctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos II SECCIONES IMPARES Prctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos II SECCIONES PARES Prctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos I SECCIONES IMPARES Prctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos II SECCIONES IMPARES Prctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos I SECCIONES PARES Prctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos II SECCIONES PARES Sin actividades Sin actividades Controles Recuperativos y revisin de notas para todas las secciones

DICIEMBRE Mircoles 14: EXAMEN PRCTICO TODAS LAS SECCIONES

NormasGeneralesdeltrabajoenelLaboratorio
1. El alumno llevar obligatoriamente un delantal blanco, fundamentalmente para protegersuropadematerialinfecciosoyreactivoscorrosivosodetincin. El NO uso del delantal significar que el alumno NO podr ingresar al trabajo prctico. 2. Est absolutamente prohibido ingresar o consumir cualquier tipo de alimentos, beberofumarenellaboratorio. 3. Para evitar contaminacin y el peligro de quemaduras es indispensable la utilizacindelcabellorecogidoduranteeldesarrollodeltrabajoprctico. 4.Paraevitarcontaminacinyelpeligrodequemadurasnosedebeportarelementos comogorros,bufandasopauelosniningntipoderopaqueincomodeduranteel desarrollodeltrabajoprctico. 5. En caso de ruptura de material contaminado con bacterias u hongos, debe comunicarse inmediatamente con el profesor encargado para proceder a la desinfeccindelazona. 6. No se podr ingresar al Laboratorio de Prctico con mochilas, bolsos o ropa de abrigoporloquedebenserguardadosenlasgavetasdispuestasparaello.Deben traersupropiocandado. 7. Cada grupo de trabajo ser responsable por los microscopios disponibles y del materialentregado.Elmaterialdebeserdevueltontegramenteylosmicroscopios debenquedarlimpiosyordenados.

IntroduccinalLaboratoriodeMicrobiologa
1.Introduccin 1.1BIOSEGURIDAD Un laboratorio de microbiologa debe contar con la infraestructura necesaria para manipularunmicroorganismo(mo)deacuerdoasuriesgobiolgicocumpliendocon losprocedimientosdelniveldebioseguridadcorrespondiente(nivelesdel1al4). Nuestro trabajo docente involucra microorganismos no patgenos, siendo nuestro nivel de Bioseguridad de tipo 2. Es decir, se requiere de un espacio diseado especialmenteparalamanipulacindelmicroorganismo(mo)yotrosespaciosparala preparacin del material estril y la eliminacin o esterilizacin del material contaminado.Ademssedebenseguirnormasquepermitanunamanipulacinlibre decontaminacinparaelmo,elexperimentadoryparaelmedioambiente. 1.2MATERIALESPRESENTESENUNLABORATORIODEMICROBIOLOGA Es esencial que posea: estereomicroscopios (lupas), microscopios, refrigeradores, cmarasdecultivo,balanzas,centrfugasydestiladoresdeagua.Enmuchasocasiones lascmarasdecultivoyrefrigeradoresseubicanenunasalaespecial,obienalgunos deestosequipossondeusocomnparavarioslaboratorios. MICROSCOPIOOPTICOCOMPUESTO:

Sistemaptico
o

OCULAR:Lentesituadacercadelojodelobservador.Amplalaimagen delobjetivo.

OBJETIVO: Lentesituada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.

CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.

DIAFRAGMA:Regulalacantidaddeluzqueentraenelcondensador. 9

FOCO:Dirigelosrayosluminososhaciaelcondensador.

Sistemamecnico
o

SOPORTE:Mantienelaparteptica.Tienedospartes:elpieobaseyel brazo.

o o

PLATINA:Lugardondesedepositalapreparacin. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocularobinocular.

REVLVER:Contienelossistemasdelentesobjetivos.Permite,algirar, cambiarlosobjetivos.

TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtricoqueconsigueelenfoquecorrecto.

1.3Otrosmaterialesutilizadosson: a)Devidrio:placasdePetri,matracesErlenmeyer,tubosdeensayo,pipetasPasteur, embudos, matraces aforados, pipetas graduadas, buretas, probetas, cristalizadores, portaobjetos, cubreobjetos, desecadores, frascos (diferentes capacidades,

transparentesocolormbar),vasosdeprecipitado,frascoscuentagotas,etc. b) Otros: algodn, papel filtro, papel indicador de pH, papel de envolver, pinzas, bistures,asasconhilosdeplatino,colorantes,reactivosdiversos,etc. Para realizar siembras y/o repiques, se utilizan asas con hilos de platino o de tungsteno.Lautilizacindeestosmetalessedebeaquesonresistentesalaoxidacin y porque una vez esterilizados a la llama, se enfran rpidamente sin riesgo de provocarlamuertedelosmicroorganismosconqueseesttrabajando.Adems,estos

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hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en esptula, permitiendorepicaroresembrardesdeunmediolquidooslido.

Asanquelcromo

PlacadePetri.Placapetriconmedioslido.

MatrazErlenmeyer. INCUBADORA:(Rangotemperatura5100C) 11 PipetaPasteur

AUTOCLAVE

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EntrminosdeFsicaexperimentalsedefineelpuntodeebullicindeunlquidocomo latemperaturaalacualseigualaelvalordelapresindevapordelfluidoconelque corresponde a la presin atmosfrica. El autoclave est formado por una vasija cilndricadehierroforjado,deparedesgruesasyconunatapaderaresistentequese cierra hermticamente mediante la accin o giro de un potente tornillo conectado a unaabrazadera.Enuncomienzoantesdequesealcancelatemperaturade100C,se elimina la presin del vapor de agua (Flowing steam), de modo que suba la temperatura junto con la presin, sin alcanzar el punto de ebullicin del agua. Este procedimientoaplicadosobrematerialresistentealatemperaturaeliminamo,virusy esporas,esdecir,quedatotalmenteestril. 1.4PRECAUCIONESENELLABORATORIOYDURANTEELTRABAJOPRCTICO Paraevitarposiblescontaminaciones,esesenciallalimpiezayelordendentrodel laboratorio. Antesdecomenzaratrabajarsedebelimpiarelmesnconunalgodnembebido enalcoholetlico7096,oconunasolucindehipocloritodesodio(15%). Serecomiendatrabajarenformacmodaenunmesndematerialsintticoduro ynoinflamable.Estemesndebeestarubicadoenunsitioconmenorcorriente deaire(lasventanasdebenestarcerradas),alejadodelaszonasdecirculacinde otraspersonasydebecontarconunmechero. Lostubosdeensayo o matracesquecontenganmediosdecultivosocultivosde mo,nuncadebenabrirseenposicinvertical,sinolomshorizontalmenteposible (inclinados)yparaquitareltapndealgodnsemantendrninclinadosconuna mano y se abrirn con la otra, la que sostendr a su vez el asa (con el dedo meique,seretiraeltapndealgodnqueobturaeltubo).Unavezabiertodela forma sealada, se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operacin una vez realizada la siembra (el tapn nunca debe dejarse sobre el mesn).

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 Antes de utilizar las asas con hilos de platino, que sirven para las siembras y/o repiques, stas deben flamearse al rojo en posicin vertical bajo la accin de la llama.Antesdeefectuarlasiembray/orepiquedebeesperarsealgunossegundos aqueseenfren,pudiendoenfriarsetambinenelbordedelaplacadePetrique contiene el medio de cultivo. Inmediatamente despus de haberlas utilizado, debenflamearsenuevamente,evitandodiseminarelmicroorganismoenelmedio ambiente. Partesdelallama 1.Conofro:nollegaoxgeno 2.Conodereduccin:pocooxgeno 3.Conodeoxidacin:abundanciadeoxgeno 4.Zonadefusin:alcanzalos1500C(Zona queesterilizaporcalor) Elasaseflameaenlazona4,hastalograrla Incandescencia. Las placas de Petri deben abrirse mantenindolas en lo posible en posicin vertical. El material de vidrio destinado a esterilizacin debe prepararse previamente (placas de Petri envueltas en papel, etc.), estar bien lavado y seco. El lavado se realizacondetergentesy/osolucionesespeciales,luegodebeenjuagarseconH2O corrienteyposteriormenteconH2Odestilada. Las observaciones microscpicas, tinciones y las diferentes pruebas bioqumicas debenrealizarseenelmomentooportuno.

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1.5NORMASDESEGURIDADENELLABORATORIO a) Dejarlaropainnecesariaenloscasillerosfueradellaboratorioyusarundelantal (blanco). b) Nuncadebenllevarsealabocalpices,etiquetasocualquierotromaterial. c) Los mesones del laboratorio deben limpiarse antes y al final decada laboratorio conundesinfectanteapropiado. d) Lasasasconloshilosdeplatinodebenesterilizarsealallamadelmecheroentoda suextensinantesydespusdesuuso.Elsalpicadoseevitasosteniendoelhilo alrededordelallamaantesdeflamearlo. e) No se distraiga conversando mientras trabaja, as evitar quemarse con el mecheroosufrirotrosaccidentes. f) Sisederramauncultivoenelmesnopiso,cubrirelreaconundesinfectantey notificaralInstructor. g) Nuncadebensustraersecultivosdemicroorganismosdellaboratorio. h) Los medios inoculados deben colocarse en las cmaras de cultivo con su identificacinrespectiva,ej.:nombre,naturalezadelespcimen,sustratodelcual seasla,fecha,identificacindelmanipulador. i) Cuandonoseutilizanlosmecheros,stosdebenguardarseysedebeestarseguro queseleshaapagadoalfinaldecadalaboratorio. j) Oculares, objetivos, como tambin otras partes del microscopio, debern limpiarseantesydespusdesuuso.Loslentesdebenlimpiarseconpapelespecial paralentesounpaodebatista. k) Todoslosreactivosyequiposdebendejarseensulugardeorigenaltrminode cadalaboratorio. l) Todoslostubos,placasdePetri,pipetas,portaobjetos,etc.,debendejarseenlos recipientesadecuadosunavezterminadoellaboratorio. m) Todos los materiales de desecho como trozos de papel, algodn, etc., deben colocarseenlosbasurerosadecuadosynoenlosmesonesosuelo. 15

n) Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, debencomunicarseinmediatamentealInstructor. o) Todoslosestudiantesdebernlavarselasmanosconjabnoconundesinfectante siesnecesario,antesdedejarellaboratorio. EVITEACCIDENTESTRABAJANDOORDENADAMENTEYCONPRECAUCION.Sienforma accidentalentraencontactoconestematerial,aviseinmediatamenteasuInstructor indicndoleelorigendelacontaminacin.

MEDIOSDECULTIVO.
Estadodelosmediosdecultivo: Losmicroorganismospuedencrecerenunmedioslido,lquidoosemislido.La mayoradelosmediosdeslidosllevanunagentesolidificantellamadoAgarenuna concentracinde1,5%ysemislido0,7%.Elagaresunpolisacridocidoproducido porciertasalgasrojasycuyaspropiedadesprincipalmenteson;solidificarpordebajo delos45C,serinocuoparalamayoradelosmicroorganismosynoserutilizadocomo fuentedecarbono,nitrgenooenerga. Composicindelosmediosdecultivo: a) Mediossintticosoqumicamentedefinidos:llevanfuentedecarbono,fuente de nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos comosonestimuladoresdelcrecimientoaconcentracionesconocidas. b) Medios complejos o de composicin indefinida: estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extractodecarne,etc.Contienennutrientesenabundanciaperosinsabercon exactitudlacomposicincualitativanicuantitativadeestosnutrientes. c) Medios selectivos: son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microorganismo en particular. Es de gran utilidad para el aislamientodemicroorganismosapartirdeunapoblacinmixta.

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d) Medios diferenciales: son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo agar MacConkey diferencia bacterias lactosapositivodelactosanegativo. e) Mediosdemantenimiento:suelenserdistintosalosdecrecimientoptimoya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas. f) Mediosdecripreservacin:debenprotegeralasclulasdelefectolticodel aguaenelprocesodedescongelamientorpido,yaqueloscristalesdeagua actan como cuchillas que cortan a la clula. El medio ms utilizado es el glicerolal100%estrildiluidoenrazn1:1.

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TRABAJOPRCTICON1 TCNICASBSICASDEMICROBIOLOGA

OBJETIVOSGENERALES
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Identificarmaterialbsicoempleadodurantelaprcticabacteriolgica. Adquirirladestrezaparamanipularmaterialesycultivosbacterianos. Adquirirladestrezayelcuidadoparatrabajarenesterilidad. Conocerlosdiferentesmediosdecultivo. Conocerlautilidaddelosmediosdecultivomsusados. Conocerelconceptodesiembrayaislamientodebacterias. Practicardiferentestiposdesiembra. Practicaraislamientobacteriano. Conocerdistintostiposdetincionesylautilidaddestas.

El objetivo principal del prctico es la adquisicin de conocimientos bsicos en lo que respecta a la manipulacin de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del conceptodeesterilidad,siembraenmedioslquidos,enmediosslidos(diferenciales, selectivos,etc.)ysiembraencondicionesanaerbicas. Elcumplimientodelastareasenmicrobiologadealimentosexigelarealizacinde

tresactividades:laprimeradeellas,aislamientoeidentificacindemicroorganismos,se iniciaconelcultivo,delasmuestrasprocedentesdealimentos,enmediosespecficosy encondicionesdefinidas,yvaseguidodeexamenmicroscpicoypruebasbioqumicas al microorganismo aislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistenciaosensibilidadaantibiticos,biotipificacinyserotipificacin;yporltimo,la tercera actividad involucra la identificacin epidemiolgica o comparacin de los aislamientosdelamismaespecieconelfindehacerelcontroldelainfeccinoanlisis depoblacin. Parapoderrealizarlaprimeradeestasactividades,esimprescindiblecontarconun

cultivo puro que debe ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesarioeindispensableemplearmaterialcompletamenteestril(TablaN1). Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro

procedimiento importante en el rea de la microbiologa que es la siembra o cultivo. 18

Estaconsisteencolocaralosmicroorganismosenunambienteadecuadoparaquese desarrollen y multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivo corrientes o bsicos y especiales, operacin que debe realizarse en formaasptica. Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprfitas (flora normal) o contaminantesdelprocesodemuestreoyotrassonlasquetienenunrolpatgeno. Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza, condicin indispensable para poder estudiar sus caractersticas morfolgicasybioqumicasylograrassuidentificacincorrecta. Si en la placa de agar ha crecido ms de un tipo de bacterias, se debe realizar el

aislamientodeUNAcoloniaaotromediodecultivosemejanteoamediosselectivos. En elcasodelosmedioslquidos,unavezobtenido elcrecimientobacteriano,se

deberealizarunaislamientodeUNAgotaoUNAasadadelcultivoaunmedioslido paraobtenercoloniasaisladasypuras(TablaN2). Nota: La asada es el volumen que se encuentra retenido en el extremo curvo del filamentodelasadeplatino. Si fuese necesario, las colonias se sometern a uno o ms reaislamientos, hasta

obtener cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la mismamorfologaymicroscpicamentecorrespondanaunsolotipodebacteria. Slo en este momento se puede proceder a la identificacin de la especie

bacteriana mediante el traspaso de UNA sola colonia a una batera de medios de identificacin. Colonia A

Colonias A y B se encuentran mezcladas

Colonia B

Figura N 2: Aislamiento por estras o en cuadrantes en placa de agar MacConkey. 19

Materialporgrupo(2personasxgrupo). MediosdeCultivo 2TubosconAgarNutritivotendido. 2TubosconAgarNutritivo. 6PlacasPetriconAgarNutritivo. 2TubosconMedioLquido Material 4Trulasestriles SolucindeYodo SolucindeCloro SolucindeAlcohol70% 1Tubocon3mLdeSueroFisiolgico CultivosBacterianosporgrupo 2CultivoenPlacaPetri. 2CultivoBacterianoenMedioLquido.

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 Tabla N 1 : Material de uso comn en el Laboratorio de Microbiologa Esterilizacin Material Tipo esterilizacin Antes de ser utilizada Asa de platino Pipetas aforadas de vidrio* Pipetas aforadas de plstico Pipetas Pasteur de vidrio* Tubos estriles
**

Tipo de material Despus de ser utilizada S S No Si Si Si No Si Re-utilizable Re-utilizable Desechable Desechable Re-utilizable Re-utilizable Desechable Desechable

Directo a la llama del mechero Directo a la llama del mechero Qumica Autoclave Autoclave Boca del tubo en la llama del Mechero Autoclave Autoclave Qumica

S S No No Si Si No No

Placas Petri de vidrio Puntas de Papel Absorbente Placas Petri de plstico

* Este material se pueden encontrar en cilindros metlicos o envueltas en papel, ya estriles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior. ** Cada vez que se destape un tubo estril, se debe flamear su boca y repetir la operacin inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo. 21

ACTIVIDADESPRCTICAS
1. DemediosSlidosamediosSlidos. 1.1. DesdeplacaPetriatuboconAgartendido:
a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo,GrupoyFecha). b. Flamearelasaparasuesterilizacin. Nota:Flamearelasaimplicamantenerlaencontactoconlallamadelmechero hastaqueelfilamentoseveacompletamenterojo.Despussedejaenfriaral ladodelmechero. c. EnlaplacaPetriconlamuestra,enfriarelasaenlaszonasdelagardonde noexistancolonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio slido con la bacteria en estudio(Consolotocarlacoloniaestartomandolacantidaddebacteria suficienteparapodersembrar). e. Destapareltuboconagartendidoyflamearlabocadeltubo. f. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un slo movimiento, deslizarelasaconmovimientosenzigzagascendentesporlasuperficiedel mediodecultivo. g. Flamearytaparlabocadeltubo. h. Flamearelasaparasuesterilizacin. i. Incubareltuborecinsembradoalatemperaturaadecuada.

C D FiguraN1:SiembradesdeagarenplacaPetriaTuboconagartendido.
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DemediosSlidosamediosLquidos. 1.2. DesdeplacaPetriatuboconmediodecultivolquido:

a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre microorganismo,Grupo,Fecha). b. Flamearelasaparasuesterilizacin. c. Enfriarelasaenlaszonasdelagardondenoexistancolonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio slido con la bacteria en estudio(Consolotocarlacoloniaestartomandolacantidaddebacteria suficienteparapodersembrar). e. Flamearlabocadeltuboconmediolquido. f. Introducirelasadentrodeltuboconcaldoyagitarvigorosamente. g. Flamearlabocadeltuboyelasaparasuesterilizacin. h. Tapareltuboeincubaralatemperaturaadecuada.

18 24 Hrs.

Figura N 2: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo. 23

2. DemediosLquidosamediosSlidos 2.1. DesdetuboconcultivobacterianolquidoaplacasdePetri:

a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datoscorrespondientes. b. Flamearelasaparasuesterilizacin. c. EnlaplacaPetriconlamuestra,enfriarelasaenlaszonasdelagardonde noexistancolonias. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tuboeintroducirelasahastaelfondo.Posteriormente,agitarsuavemente elasayretirarla. e. Flamearytaparlabocadeltubo. f. Colocarlatapadelaplacasobreelmesncercadelmechero. g. Tomarlaplacaporsubaseyrealizarlasiembramedianteestras,paraello: i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig zag en un pequeo sectordelaplaca.Flamearelasa. ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig zag. Flamearelasa. iii. Apartirdelasltimaslneasrealizadas,deslizarelasahaciaelsector contrariodelaplacaenformadezigzag.Flamearelasa. iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tenercuidadodequecuandosehacenlasestrasenii.)yiii.)notocar lasqueyaseencuentranenlaplaca. h. Taparlaplacayflamearelasaparasuesterilizacin. i. Incubarlaplacaalatemperaturaadecuada.

A D

18 24 Hrs.
Figura N 3: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a agar en placa Petri. 24

2.2. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con agar (Por picadura).
a. b. c. d. e. Rotulareltuboconlosdatoscorrespondientes. Flamearelasaparasuesterilizacin. Enfriarelasaenlasparedesinternas. Tomaruninculodeltuboproblema. Efectuarlasiembradeltuboproblemaaltuboestril;paraello: i. Destapareltuboestrileintroducirelasacargadasintocarlasparedes, picandoelmediodecultivoalcentrosinllegaralfondodelmismo. ii. Retirarelasaconprecaucinparaproducirelmenordesgarroposible. f. Flamearlabocadeltuboytpelo. g. Flamearelasaparasuesterilizacin. h. Incubareltubosembradoalatemperaturaadecuada. B A D C Figura N 4: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar 25

3. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con agar (Zig Zag superficie). a. Rotulareltuboconlosdatoscorrespondientes. b. Flamearelasaparasuesterilizacin. c. Enfriarelasaenlasparedesinternasoenellquidodecondensacin. d. Tomeuninculodeltuboproblema. e. Destapareltuboconagartendidoyflamearlabocadeltubo. f. Introduzca el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un slo movimiento, deslizarelasaconmovimientosenzigzagascendentesporlasuperficiedel mediodecultivo. g. Flamearytaparlabocadeltubo. h. Flamearelasaparasuesterilizacin. i. Incubareltuborecinsembradoalatemperaturaadecuada.

Figura N 5: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a tubo con agar tendido.

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4. DesdemediosLquidosamediosLquidos. 4.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con medio de cultivolquido.

a. b. c. d. e.

Rotulareltuboconlosdatoscorrespondientes. Homogenizareltuboproblemaporagitacin. Flamearelasaparasuesterilizacin. Enfriarelasaenlasparedesinternasdeltubo. Tomaruninculodeltuboproblemaprocurandoquequedeunapelculaen elasa. f. Destapar el tubo estril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, agitarenelmediodecultivoyretirarconcuidado. g. Flamearlabocadeltuboytpelo. h. Flamearelasaparasuesterilizacin. i. Incubareltubosembradoalatemperaturaadecuada.

18 - 24 hrs.

Figura N 6: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a tubo con medio de cultivo.

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 TablaN2:CuadroResumenActividadTcnicasdeSiembra. DesdeMedioTipo AMedioTipo Tomademuestradesde Siembraen TuboconAgarTendido Slido Slido Lquido PlacaPetri PlacaPetri TuboconAgar TuboconMediodecultivo PlacaPetri Slido Lquido TuboconAgarTendido Lquido Tuboconcultivolquido TuboconMediodecultivo ZigZagsuperficie Agitacinconasa Tuboconcultivolquido TuboconAgar Pinchadura Agitacinconasa Encuadrantes Pinchadura TipoSiembra ZigZagsuperficie

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5. TcnicasdeEsterilizacin 5.1. Flameado

a. b. c. d. e. Dividirunaplacaporlamitad. Tomarunasayabrirunaplacadeagarnutritivoydeslizarlasuavemente porunamitaddelagar.Cerrarlaplaca. Flamear el asa para su esterilizacin, enfrela en la tapa y deslcela suavementeporlaotramitaddelagar. Cerrarlaplaca. Incubarlaplacaa37C.

6. DesinfeccinyAsepsia
a. b. c. d. Tomarunatrulaydeslizarlarpidamenteporunsectordentroofuera dellaboratoriodeampliaexposicin Pasarlasuavementesobreunamitaddelagarnutritivodeunaplaca. Humedecer la misma trula con la solucin de cloro y deslizarla por la otramitaddelaplaca. Incubarlaplacaa37C.

7. Yodo
a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedosporelagar. b. Tome un trozo de algodn con yodo y aplquelo en el dedo que utiliz, espereunossegundos. c. Pasareldedosuavementeporlaotramitaddelaplaca. d. Incubarlaplacaa37C.

8. Alcohol
a. Repitalospasosrealizadosparalaactividaddelcloro. b. Escojaotrolugardellaboratoriodeampliaexposicin. c. Incubarlaplacaa37C.

AnlisisMacroscpico
Unaetapaimportanteybsicaenelestudiodelascaractersticasdeunabacteria, es la observacin de su morfologa. Como consecuencia del pequeo tamao que presentan no es posible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias esnecesarioproporcionarlesalasbacteriaslosrequerimientosnecesariosdemateria orgnica, iones inorgnicos y factores de crecimientos entre otros a travs de un mediodecultivo.Cadacoloniacorrespondeensuorigenaunasolabacteriaquese ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo slido, hasta formar una 29

poblacin que se represente como una colonia visible. Por lo tanto una colonia est formadapormillonesdebacterias. Elcrecimientodelasbacteriasenmedioslquidos,nodaorigenalaformacinde

colonias.Eldesarrolloseevidenciamediantelaturbidezdelcaldo,sedimentoyotras caractersticas. Cabe destacar que la morfologa macroscpica de las colonias (anlisis

macroscpico) permite un acercamiento en la identificacin de los gneros bacterianosqueposeencaractersticaspropiasdedesarrollodesuscolonias,segnsu forma,elevacin,margen,superficie,brillo,coloryhemlisis(enagarsangre). Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que haceimposiblediferenciarlassoloconlaobservacinmacroscpicadeestasporloque sehacenecesarioademsunaobservacinmicroscpicadelasclulasqueconforman estascolonias. Esto datos proporcionan una orientacin sobre las pruebas bioqumicas para la identificacindefinitivadelascolonias. En la figura N 1 se observan algunas caractersticas macroscpicas de colonias bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripcin de una bacteria o microorganismo. Paraobservarlaelevacin,coloquelaplacadeformahorizontalfrenteasusojosy observelacolonia.Laformaqueadquiereporsobreelhorizontedelagaresloquese consideracomoelevacin. Elmargenencambio,correspondealpermetrodelacolonia.Porejemplo,una coloniabacterianapuedesercircularperosubordeomargenpuedeserlobulado.

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Figura N 1: Criterios macroscpicos para la descripcin de una colonia bacteriana.

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APUNTES

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APUNTES

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TRABAJOPRCTICON2: MORFOLOGABACTERIANA EXAMENMACROSCPICOYMICROSCPICO TINCIONES

Unaetapaimportanteybsicaenelestudiodelascaractersticasdeunabacteria,

es la observacin de su morfologa. Como consecuencia del pequeo tamao que presentan no es posible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionar a las bacterias los requerimientos necesarios de materia orgnica,ionesinorgnicosyfactoresdecrecimiento,entreotros,medianteunmedio decultivo.Cadacoloniacorrespondeensuorigenaunasolaclulabacterianaquese ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo slido, hasta formar una poblacin que se representa como una colonia visible. Por lo tanto una colonia esta formadapormillonesdebacterias. Elcrecimientodelasbacteriasenmedioslquidosnodaorigenalaformacinde

colonias. El crecimiento en este medio se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimentoyotrascaractersticas. Cabe destacar que la morfologa macroscpica de las colonias (anlisis

macroscpico) permite un acercamiento en la identificacin de los gneros bacterianosqueposeencaractersticaspropiasdedesarrollodesuscolonias,segnsu forma,elevacin,margen,superficie,brillo,coloryhemlisis(enagarsangre). En la figura N 1 se observan algunas caractersticas macroscpicas de colonias bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripcin de una bacteria o microorganismo. Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas, lo que haceimposiblediferenciarlassoloconlaobservacinmacroscpicadeestasporloque sehacenecesarioademsunaobservacinmicroscpicadelasclulasqueconforman estascolonias. Estos datos proporcionan una orientacin sobre las pruebas bioqumicas para la identificacindefinitivadelascolonias.

34

La observacin al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie de

caractersticascomplementariasalamorfologadecoloniaentrelasqueencontramos: forma, disposicin o agrupacin, presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas,flagelos),movilidad,etc. Existen numerosas tcnicas para la observacin microscpica de los

microorganismos,delascualesenellaboratoriosonfcilesderealizarlassiguientes: 1. Observacin de bacterias vivas: Para observarlas bacterias vivas, sin teir,se utiliza el microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarroll para hacer posible observar clulas pequeas sin teir. Se basa en utilizar y aumentar la pequea diferencia de ndice de refraccin que existe entrelasclulasyelmedioquelascircunda.Estadiferenciapuedeserusada paracrearunaimagenconmuchomayorcontrastequelaqueseobtieneenel microscopiodecampoclaro.Estemicroscopiousaunlenteobjetivoespecialy enelcondensadorseinsertaundiafragmaespecial;ademsparaaumentarel contrasteseinsertanfiltrosverdesoazules. a. Enfresco:Estemtododeexamenpermiteobservarelmicroorganismoal estado vivo y evita las deformaciones artificiales de su morfologa que producen las tcnicas de coloracin. Su aplicacin ms importante se refierealestudiodelamovilidaddelosmicroorganismos. b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenmeno de Tyndall, de reflexin luminosa.ParalaobservacinsesustituyeelcondensadordeAbbporel condensador de fondo oscuro, o de ultra. Se ilumina la preparacin en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismossinpenetraren elobjetivodelmicroscopio. Seemplea para la observacin de bacterias muy pequeas o de aquellas que difcilmente se observan al microscopio de campo claro por su falta de contrasteconelmedio. c. Gotacolgante:Consisteensuspenderelmicroorganismoaobservarenun lquidoydepositarunagotadelasuspensinsobreuncubreobjetoelcual se coloca sobre un portaobjeto, luego se procede a la observacin microscpica. 35

2.

Observacindebacteriasmuertas: a. Tincionessimples.Seutilizaunslocolorantepararevelarlapresenciade microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriologa. b. Tincinnegativa.Setieelfondomientrasquelasclulaspermanecensin teir (transparentes), observndose como entidades claras sobre un fondooscuro.Ejemplodeestetipodetincineslatincindecpsulaen laqueseusatintachina. c. Tinciones especiales. Se utilizan para observar alguna estructura en particularcomonucleoide,flagelo,esporas,etc. d. Tincionesdiferenciales.Lasbacteriassondiferentesentres,tantoensu estructura fsica como en su composicin qumica, de modo que reaccionanenformadiferentefrentealoscolorantes.Estastincionesse utilizan para diferenciar los distintos grupos de bacterias. La tincin de Gram es la tincin diferencial ms importante usada en bacteriologa. Otra muy utilizada es la tincin cido resistente o tincin de Ziehl Neelsen.

Otrasestructurasbacterianasquetambinpuedenserdiferenciadaspormtodos

detincinsonlasesporasylacpsula a. Observacin de esporas: Esta tincin es un ejemplo de una tincin especial. AlgunosgnerosbacterianoscomoBacillusyClostridium,producenendosporas como una forma de resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecacin.Laresistenciadelaesporasedebealaestructuraproteica(ricaen aminocidos azufrados) de sus capas externas, lo que tambin las hace resistentesatincin.Porestemotivolasesporassetienencaliente. b. Observacin cpsula: se trata de una tincin negativa usando tinta china que permitedeterminarlapresenciadecpsulaspolisacardicas. Entonces, el estudio macro y microscpico de una muestra bacteriana permite obtenerunaorientacinpreliminardesuidentidadydirigeaeldesarrollodepruebas bioqumicasespecificasquepermitanunaidentificacinmscerterayprecisa. 36

OBJETIVOS
1. Practicartincionesdiferencialesdefrotisbacterianos:tincindeGram,tincinde cpsulayesporas. 2. ObservarendosporasysudisposicinenformasvegetativasdeBacillusspp. 3. ObservarlapresenciadecpsulaenKlebsiellaspp. 4. Compararcoloniasbacterianasdesarrolladasendistintosmediosdecultivoslido (PlacasdeAgar). 5. Describircoloniasdeacuerdoacriteriosmacroscpicos.

ACTIVIDADESPRCTICAS OBSERVACIONESMACROSCPICAS
1. Describa las colonias desarrolladas en los medios de cultivo entregados por el profesor de Laboratorio. Considere los siguientes aspectos: forma, borde, elevacin,superficie,caractersticasfsicas(textura,colorybrillo). 2. Siembrelasiguientebateradeplacascomoloindicalatablaydejeincubando. AgarCorriente AgarSangre AgarMacConkey 3. En la siguiente sesin de trabajo prctico observe y describa las colonias desarrolladas en los distintos medios, considerando los aspectos anteriormente mencionados. GramPositivo + + + GramNegativo + + +

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OBSERVACIONESMICROSCPICAS
1. TincindeEsporas(Demostrativa).
Procedimiento: a. Limpieunalminaportaobjetoconalcoholysequecuidadosamenteconpapel absorbente. b. Coloque una gota de cultivo de Bacillus spp. con el asa hasta que sea del tamaodeunaarvejayfijeenelmecherohastaquesesequecompletamente (sinhervir). c. Noolvideesterilizarelasadespusdeusarla.Noladejecontaminadasobreel mesn. d. Corte papel absorbente en forma rectangular, de manera que cubra el frotis conbacteria. e. Ponga 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuacin agregue solucin coloranteverdedemalaquita.Debefijarsequeelcolorantetienequeatravesar las4capasdepapelyponerseencontactoconelfrotisbacteriano. f. Esta tincin se realiza en caliente: para ello con unas pinzas de madera debe colocarlamuestraencimadelallamadelmecherohastaobservaremisinde vapordurante5min.Nosobrecalienteparaevitarquesequemesumuestrao serompaelportaobjeto. g. Unavezquesedetengalaemisindevapordesdelamuestra,hayquereponer elcolorantenuevamente.Deberepetir4vecesesteproceso. h. Laveconaguadetalmaneraqueescurrasuavementetodoelcoloranteverde demalaquita. i. Posteriormente durante 2 min., cubra el frotis con el colorante de contraste, safranina. j. Laveconagua.

k. Sequecuidadosamenteconpapelabsorbenteyobserveconinmersin. NOTA: Lasbacteriasseobservanrosadasmientrasquelasesporas(demenortamao quelasbacterias)sonpequeasesferasverdes. 38

 Esposibleobservaresporaslibresyesporasintracelulares.Enestasltimases posibledeterminarsiseencuentranalcentroohaciaunextremodelaclulay, silaesporadeformaonoalbacilo.

Papel absorbente

Verde malaquita

F G

Safranin

Una vez observada la muestra deseche la lmina en los frascos con DESINFECTANTEubicadosencadamesn.

39

2. TincindeCpsula(Demostrativa).
Procedimiento: a. Limpieunalminaportaobjetoconalcoholysequecuidadosamenteconpapel absorbente. b. En una esquina de la lmina portaobjeto coloque una gota de tinta china del tamaodeunaarveja. c. EsteriliceelasaytomepartedelcultivodelabacteriaKlebsiellaspp. d. Mezclelatintachinaconlabacteria,esteriliceelasayrepita3o4veces(slo agregarlabacteria).Latintachinaimpideversilasolucintieneonosuficiente bacteria,porlomismoesnecesariomezclarconsuficientecultivo. e. Noensuciesucultivobacterianocontintachina,asegresedeesterilizarelasa previamenteydeenfriarstaenlasparedesdeltubo. f. Realice un frotis extendiendo la suspensin de manera que quede una capa delgada.Estoserealizatomandouncubreobjetoy,esparciendolamezclaalo largodelportaobjetoquecontienelamezclatintachinabacteria.VerFigura. g. Fijesuavementeenelmechero. h. Durante2mincubracompletamenteconcolorantedecontraste,fucsina. i. Laveconagua,sequeconpapelabsorbenteyobserveconinmersin.

40

D C

E
Fucsina

Bacterias Cpsula

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3. TincindeGram.
Fundamento Las bacterias Grampositivo y Gramnegativo se tien de forma distinta debido a diferenciasensuparedcelular.LapareddelasGrampositivoesgruesayconsisteen variascapasinterconectandasdepeptidoglicanoascomoalgodecidoteicoico. Generalmente,el80%90%delapareddelasclulasGrampositivoespeptidoglicano. Porotrolado,laparedcelulardebacteriasGramnegativo,contieneunacapamucho msdelgadadepeptidoglicanoyestrodeadaporunamembranaexteriorcompuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% 20% de la pared de la clulaGramnegativoespeptidoglicano. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algndetallelatincindeGramylasinterpretacionesqueactualmentesehacensobre elporqudesufuncionamiento. Lasclulasfijadasalcalorsobreunportaobjetossetien,primeroconunasolucinde cristalvioleta(otroscolorantesbsicosnosontanefectivos)ysonlavadasparaquitar elexcesodecolorante.Enesteestado,todaslasclulas,tantolasGrampositivocomo lasGramnegativo,estnteidasdeazul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodoyoduro potsico. El ingredienteactivoesaquelI2;elKIsimplementehacesolubleelI2 enagua.ElI2 entra enlasclulas yforma uncomplejoinsolubleen agua conelcristalvioleta.Denuevo tanto las clulas Grampositivo como las Gramnegativo se encuentran en la misma situacin. Ladecoloracinsellevaacabousandounamezcladealcoholacetona,sustanciasen lasquesesolubilizaelcomplejoI2cristalvioleta.EnestaetapalosorganismosGram positivos no se decoloran, mientras que los Gramnegativos si se decoloran. La diferencia se debe probablemente a que en bacterias Gramnegativo, la mezcla alcohol/acetona disuelve la membrana externa de la pared celular (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano), siendo incapaz de retener el de complejo cristal violetayodo, causando la decoloracin. Las clulas Grampositivo, a diferencia de las anteriores, poseen una pared celular con mayor contenidodepeptidoglicanoymenorcontenidolipdico,siendomenospermeablesa 42

lamezclaalcohol/acetona.Estocausaladeshidratacindelaclulayelcierredelos poros disminuyendo el espacio entre las molculas, atrapando el complejo I2cristal violetadentrodelaparedcelular.DespusdeladecoloracinlasclulasGrampositivo sontodavaazules,perolasGramnegativosonincoloras. ParapodervisualizaralasclulasGramnegativoseutilizaunacoloracindecontraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gramnegativo son rojas, mientras quelasGrampositivopermanecenazules. Preparacinfrotisbacterianoapartirdecolonia. a. Colocarconelasaunagotadeaguaenelcentrodelalmina(aprox.0,5cmde dimetro). b. Flamearelasaparasuesterilizacin. c. Enfriarelasaenunsectordelagardondenoexistancolonias. d. Obtenerunapequeamuestradesdelaplaca. e. Mezclarlamuestraconlagotadeaguayesparcirlaporlasuperficiedel portaobjeto. f. Fijarelfrotisexponindoloalallamadelmecherohastaqueseseque. Preparacinfrotisbacterianoapartirdecaldodecultivo. a. Flamearelasaparasuesterilizacin. b. Enfreelasaenlasparedesinternasdeltubo. c. Tomeuninculodeltuboproblemaprocurandoquequedeunapelculaenel asa. d. Esparcirlagotaporlasuperficiedelportaobjeto. e. Fijarelfrotisexponindoloalallamadelmecherohastaqueseseque. Tincinfrotis a. Verificar,coneldorsodelamano,queelvidrionoestdemasiadocaliente. b. Cubrirelfrotiscompletamenteconcristalvioletaydejarenreposopor3min. c. Dejarescurrirelcristalvioletayagregarsobrelamuestraunasolucindelugol. d. Dejarconlugolpor2min. 43

e. Lavarellugolconalcoholacetonapor1520seg.(esimportantenosobrepasar estetiempoyaqueladecoloracinexcesivapuedealterarlosresultadosdela tincin).Lavarconaguadejandoescurrirsuavemente,hastaeliminarelexceso decristalvioleta. f. Cubrirconcolorantedecontraste,Safraninaal1%,por1min. g. Lavarconagua,dejarescurrirysecarsuavementeconpapelabsorbente. h. Observarenelmicroscopiopticoconinmersin. Gram Positivo Negativo Cocos Morfologa Bacilos Baciloscurvos Cocobacilos Individual Agrupacin Cadena Racimo Ttrada Utilizarelmicroscopio,anotarydibujarloqueobserve.

44

APUNTES

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APUNTES

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TRABAJOPRCTICON3: FLORANORMALYFISIOTAXONOMADEBACTERIAS GRAMPOSITIVO

Como en la mayora de los animales, en el organismo humano hay lugares que normalmentesemantienenestrilesyotrosdondecohabitan,tambinnormalmente, una gran diversidad y una cantidad sorprendente de microorganismos, aun en las personasmssanas. La sangre, el lquido cefalorraqudeo, la mdula sea y las vas areas inferiores (bronquiosyalvolos),entremuchosotros,carecendemicroorganismosdebidoalos mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, odos, piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normal del ser humano. Algunos de los microorganismos ms frecuentemente encontradosenloscultivosdelasdiferentesregionesdelcuerpoyqueseconsideran integrantes de la flora normal, son: Staphylococcus epidermidis, S. aureus, Streptococcus mitis, S. salivarius, S. mutans, S. faecalis, S. pneumoniae, S. pyogenes, bacterias coliformes como E. coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos, clostridios como Clostridiumtetani. La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacteriasGrampositivo,comoStreptococcusdelgrupoA,Staphylococcusaureusydel gneroNeisseria,ademsdeflorafngicacomoCandidaalbicans,lacualseconsidera patgenasiemprequeseaslaenlapiel(TablaN1). Innumerablesbacteriassonfiltradasamedidaqueelairequelostransportapasaa travs de la nasofaringe, la trquea y los bronquios; la mayora de estos microorganismossonatrapadosenlasecrecionesmucosasydeglutidos.As,lossenos nasales, la trquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estriles. La nasofaringeeselhbitatnaturaldebacteriasyviruspatgenoscomunesquecausan infeccionesenlanariz,garganta,bronquiosypulmones. Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococosydescarganestosmicroorganismosengrandescantidadesdesdelanariz haciaelaire. 47

Las bacterias con las que convivimos diariamente pueden representar un riesgo

paranuestrasaludcuandoelecosistemaenelcualconvivensimbiticamentecuerpo humanobacteriaseveafectado,yaseaporalteracindelecosistemabacterianoopor factoresdelhuspedquefavorecenladisminucindelainmunidad(defensas)yque permitenquelasbacteriasnormalesinvadanyataquenasuhuspedhumano. Es en estos casos que el diagnstico de los organismos responsables es de suma

importancia para poder elaborar tratamientos adecuados. Por este motivo, el Laboratorio de Microbiologa cumple un rol fundamental en la identificacin de bacteriasenunamuestradeterminada.

Elanlisismicrobiolgicodeunamuestra,porlogeneralsiguelasiguientesecuencia: a. Observacindirectaalmicroscopio b. Cultivo c. Identificacinfisiotaxonmica(baterabioqumica) d. Estudiosdesensibilidadaagentesantimicrobianos Laobservacindirectadelamuestrateidacon Gramentregainformacinsobre

sucontenidobacteriano.Loscultivospermitenobservarlamorfologadelascolonias bacterianasenunmediodeterminado.Ambosestudiosorientativossecomplementan con anlisis de identificacin como bateras bioqumicas y de sensibilidad a agentes antimicrobianos. Lafisiologabacterianaestudiaelcomportamientodelasbacteriasvivasatravsde

las alteraciones que producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitido establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificacinendiferentesgnerosyespecies. Las tcnicas de identificacin bioqumica de las bacterias diferencian gneros y

especiesbacterianasenbasealadeteccinde: a. Utilizacindefuentesdecarbono: Glucosa, Sorbitol,Citrato. b. Formacindeproductosfinalesointermediariosdelmetabolismomicrobiano: Indol,CO2,Acidosulfhdrico(H2S),Acetilmetilcarbinol,etc. 48 Lactosa, Sacarosa, Manitol,

c. Presenciadeenzimas:Catalasa,Ureasa,Oxidasa,Coagulasa,etc. d. Sensibilidad a algunas compuestos qumicos o antibiticos: Bacitracina, Optoquna,Novobiocina,etc. En general, para cocceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos

ltimosmtodos,encambioparabacilosGramnegativoseempleanlostresprimeros. Estostestsepuedenrealizarmediante baterasentubosconvencionalesomediante sistemascomercialesmsfcilesdemanipular(API). En este trabajo se analizaran dos de las Familias de Bacterias Gram positivo ms importantes,comosonlasMicrococcaceaeyStreptococcaceae.

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TABLA DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

Cocaceas Catalasa Positivo Test de Bacitracina R Test de Coagulasa S Micrococcus (-) Staphylococcus Coagulasa negativo Test de Novobiocina S S. Coagulasa negativo No saprophyticus R Staphylococcus saprophyticus Streptococcus grupo viridans Streptococcus pneumoniae Optoquina resistente Hemlisis Alfa Observar Hemlisis Hemlisis Beta Test de Latex Optoquina sensible Hemlisis Gamma Bilis Esculina NaCl 6,5 % Enterococcus Listeria Bacilo en empalizada Corynebacterium sp Bilis positivo NaCl positivo Bacilos Grandes Esporulados Bordes netos Bacillus sp Bacilos finos Negativo Streptococcus Bacilos Catalasa positivo Aspecto Tincin Gram

(+) Staphylococcus aureus

Streptococcus Grupo A, B, C, D, F, G

Enterococcus

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LaFamiliaMicrococcaceaecomprendelosgnerosMicrococcus,Staphylococcusy Planococcus.SonbacteriasGrampositivo,esfricas(cocos)agrupadasenracimo.Son catalasapositivos,reaccinqueseusaparadiferenciarlaFamiliaMicrococcaceaede otroscocosGrampositivoscomoporejemploStreptococcus. Figura N 1: Agrupacin de algunas cocceas Gram Positivo

LasespeciesdelgneroMicrococcussonsaprfitas,seencuentranhabitualmente en la piel de mamferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia de las especies del gnero Staphylococcus que son aerobios anaerobiosfacultativos. Otra caracterstica que diferencia ambos gneros, es la propiedad de Staphylococcus de fermentar glucosa en anaerobiosis, no as los Micrococcus que no tienenestapropiedad. Las principales especies del gnero Staphylococcus son: Staphylococcus aureus y Staphylococcusepidermidis. Staphylococcusaureusespatgenoparaelhombre.Produceunavariedadde factoresresponsablesdesupatogenicidad,algunosdeestossedescribenenlasTablas N1y2. 51

TablaN1:AlgunasenzimasproducidosporStaphylococcusaureus. Enzimas Hialuronidasa Fibrinolisina Coagulasa Nucleasas TablaN2:AlgunastoxinasproducidosporStaphylococcusaureus. Toxinas Alfatoxina Leucocidina* Exfoliatina Enterotoxinas Accinenlaclulablanco Esunahemolisinaqueproducelisistotaldelosglbulosrojos.Esuna protenaantignicadepesomolecular30.000D. Causadegranulacindelosleucocitosymacrfagos. Algunascepasproducenestatoxina,laquecausaelsndromedepiel quemada. Algunascepasproducenestastoxinasquecausanintoxicaciones alimentaras. Accinenlaclulablanco Rompeelcementocelularfacilitandolainvasindelos tejidosporlasbacterias. Disgregacogulosdefibrina. Coagulanelplasmay,sepuedenencontrarsecretadasal medioextracelularyotrasqueestnunidasamembranas. HidrolizanDNA.

*TambinesconocidacomotoxinadePantonValentine. LastoxinasproducidasporStaphylococcusaureussoncausantesdelossntomasdelas enfermedadesestafiloccicas.

AislamientoyCaracterizacin:
El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depender si la muestraesunalimentoosiesunamuestraclnica. ParaelaislamientodeS.aureusenmuestrasCLNICAScomopus,heridas,secreciones, etc.seutilizan: a. AGARSANGRE.steesunmedioenriquecidoquecontienesangredefibrinadade cordero o de conejo. Permite el desarrollo abundante de las especies de Staphylococcusyademspermitevisualizarlaproduccindehemolisinasporlisis delosglbulosrojosalrededordelascolonias. S.aureus :producehalosdehemlisiscompletaalrededordelascolonias, producidaporlaalfatoxina. S.epidermidis :noproducehemlisisolohacedbilmente. 52

Micrococcus

:noproducehemlisis.

Figura N 2: Tipos de hemlisis

b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN. Es un medio selectivo que contiene manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus y Staphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentracin de NaCl. En este medio adems se evidencia la fermentacin de manitol,laqueseobservaporelvirajedelindicadoraamarillo. S.aureus : da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (productodelafermentacin) S.epidermidis: generalmentenofermentaelmanitol Micrococcus : nofermentaelmanitol. En los dos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar

mediantetincindeGramlapresenciadecocosGrampositivoenracimo,yaqueotras especies pueden dar colonias semejantes. Una vez confirmada la presencia de cocos Gram positivo en racimo se realizan pruebas bioqumicas para confirmar el diagnstico. Unavezaisladaslascoloniasyhabiendoobservadosuaspectoycaractersticasen medios selectivos se realizan las pruebas bioqumicas. Si se sospecha que la colonia correspondeaStaphylococcusaureus,serealizalapruebadelaCOAGULASA.Estaes unapruebadePATOGENICIDAD,lacualsepuederealizardedosformas: a) Tcnica en tubo: consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo lquidodeStaphylococcus.Lareaccinpositivaseobservacomolaaparicinde uncoguloalas4horas.Estatcnicadetectalacoagulasalibre. b) Tcnica en portaobjeto: a partir de un cultivo de Staphylococcus en medio slido, se hace una suspensin abundante sobre una gota de agua. Esta 53

suspensindebeserlomshomogneaposible.Sobrestasecolocaunaodos gotas de plasma de conejo y se homogeniza. La reaccin positiva se observa como aglutinacin de las bacterias a los 20 segundos. Esta tcnica detecta la coagulasaunidaamembrana.

Partculasde latexcon anticuerpos Anticuerpo(Antgenoespecfico) =reconocenelantgenobacteriano. Bacterias Aglutinacindelaspartculas

Figura N 3: Fundamento del test de ltex para identificacin de Gram positivos.

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FamiliaStreptococcaceae
El Gnero Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios facultativosquesedisponenenparesoencadenasysoncatalasanegativosreaccin quelosdiferenciadelaFamiliaMicrococcaceae.Bajociertascondicionesdecultivolas clulassonovoidesoalargadas.Seencuentranendiferentessuperficiesymucosasdel hombre y de algunos animales como cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunasespeciessonutilizadasenlaindustrialecheraparalaelaboracindequesos, lechesfermentadasyyoghurt(Streptococcuslactis). LosmiembrosdelgneroStreptococcusseclasificandeacuerdoa: 1. ACTIVIDAD HEMOLTICA: segn el tipo de hemlisis que presenten al ser cultivadasenplacasdeagarsangredeconejoodecordero. a) Beta hemolticos: producen halos limpios de hemlisis alrededor de las colonias. b) Alfahemolticos:producenhalosdehemlisisincompletadecolorverdoso (viridans)alrededordelascolonias. c) Gamahemolticos:noproducenhemlisis 2. SEGNCONSTITUCINANTIGNICADELAPAREDCELULAR:eslaclasificacinde Lancefield. Se basa en la composicin qumica y antignica de un hidrato de carbono presente en la pared celular y permite clasificar a los estreptococos en gruposserolgicosquevandesdelaAhastalaU. Ambas clasificacionesse asocian entre s, as tenemos por ejemplo estreptococos betahemolticosdelgrupoAcomoStreptococcuspyogenes,queeselmspatgeno delgnero. Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patgeno. Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc. Adems provoca enfermedades sistmicas como fiebrepuerperalyescarlatina. Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este gnero, agente causante de neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esfrico, tiene forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulentaseencuentrarodeadaporunacpsula.Eshabitantenormaldelafaringedel hombre.Parasuaislamientolasplacasdebenincubarseenunambientecon10%de 55

CO2. En agar sangre S. pneumoniae presenta alfa hemlisis y las colonias son planas conformasdefichasdedamas. Estreptococos fecales oenterococos(porejemploEnterococcusfaecalis).Existen otrasespeciesdeStreptococcusquehabitanelintestinodelhombreyanimalesyseles conoceconelnombredeestreptococosfecalesoenterococos.Secaracterizanporque generalmente son no hemolticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl6,5%),pHbsico(pH9,6)ypresenciasalesbiliaresenqueotrosestreptococosno puedenhacerlo.Supresenciaenalimentosoaguaindicacontaminacinfecal.

AislamientoyCaracterizacin:
ElaislamientodeStreptococcuspyogenesseefectasembrandolamuestrasobre una placa de agar sangre. Los Streptococcus pyogenes presentan las siguientes caractersticas: 1. Hemlisisenplacadeagarsangre.Seobservahemlisislimpiaalrededordelas colonias,lascualessonmuypequeas. SedebeconfirmarmediantetincindeGramlapresenciadecocosGrampositivo en cadena ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus.Unavezconfirmadasupresenciaserealizanpruebasadicionalespara confirmareldiagnstico. a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolticos del grupoA(Streptococcuspyogenes)sonsensiblesaBacitracina(seestudiacomoun antibiograma). Otros estreptococos tambin son sensibles, sin embargo no son betahemolticos. b) Pruebasserolgicas.EldiagnsticodeStreptococcuspyogenessedebeconfirmar mediante reacciones serolgicas con antisueros especficos para el antgeno superficial. c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%. Los Enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%, toleran las sales biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococos de otros cocos Gram Positivo catalasanegativos.Enlapruebapositiva,eltubodondeestelmediosetornade colorchocolateoscuro,caractersticoaldesdoblarlabilisesculina. 56

Testdesusceptibilidadalosagentesantimicrobianos MtododedifusinenagaroKirbyBauer

Unametodologacomnparaelestudiodelasensibilidadaantimicrobianosesla difusinenagar.Estemtodocualitativosebasaenlainoculacindelmicroorganismo sobreunaplacadeagardondesecolocandiscosdepapelfiltroestrilesimpregnados con una concentracin conocida de antibitico. El antibitico en los discos difunde radialmenteduranteeltiempodeincubacindetalmaneraqueamedidaquesealeja deldisco,laconcentracindisminuye.Enunpuntodeterminado,laconcentracindel antibitico no podr inhibir el crecimiento del microorganismo, producindose entoncesunazonacirculardeinhibicin(ohalodeinhibicin)alrededordeldisco.El dimetrodelreadeinhibicinpuedeserconvertidoalascategorasdesusceptible, intermedio o resistente de acuerdo a las tablas publicadas por el National CommitteeforClinicalLaboratoriesStandars(NCCLS). Antibiograma mediante la tcnica de difusin con discos

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Interpretacin de los halos de Inhibicin para Staphylococcus spp (Agar Mueller Hinton)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Penicilina Cefotaxima Ceftazidima Oxacilina Gentamicina Tetraciclina Ciprofloxaxino Eritromicina Clindamicina Vancomicina Cloranfenicol Novobiocina Amoxicilina / A. Clavulnico Ampicilina / Sulbactam

10 U 30 g 30 g 1 g 10 g 30 g 5 g 15 g 2 g 30 g 30 g 5 g 20 / 10 g 10 / 10 g

29 23 18 13 15 19 21 23 21 15 18 16 20 15

15 22 15 17 11 12 13 14 15 18 16 20 14 22 15 20 13 17 12 14

28 14 14 10 12 14 15 13 14 12 16 19 11

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus -hemolticos (Mueller-Hinton con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Penicilina Ampicilina Cefotaxima Eritromicina Tetraciclina Cloranfenicol Claritromicina Clindamicina Vancomicina

10 unidades 10 g 30 g 15 g 30 g 15 g 15 g 2 g 30 g

24 24 24 21 23 21 21 19 17

16 20 19 22 18 20 17 20 16 18 -

15 18 17 16 15 -

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Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus pneumoniae (MuellerHinton con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Penicilina 1 g de oxacilina Tetraciclina 30 g Cloranfenicol 30 g Clindamicina 2 g Eritromicina 15 g Trimet/sulfame 1.25 / 25.75 g Vancomicina 30 g

20 23 21 19 21 21 17

19 22 16 18 16 20 16 20 -

18 20 15 15 15 -

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus spp. del grupo Viridans -hemoltico (Mueller-Hinton con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Tetraciclina Cefotaxima Cloranfenicol Clindamicina Eritromicina Vancomicina

30 g 30 g 30 g 2 g 15 g 30 g

23 28 21 19 21 17

19 22 26 27 18 20 16 18 16 20 -

18 25 17 15 15 -

Bacitracina:Esunantibiticoqueinterfiereconlasntesisdelassubunidadesdel peptidoglicano. Se debe diseminar en una placa de agar sangre una colonia con la precaucindeunasiembrahomogneaytotaldelaplaca.Luegosecolocaundiscode bacitracina,seincuba1624horasydespussemideeltamaodelhalo. Seconsiderasensiblecuandoexisteunhalodeinhibicin10mmdedimetro. Seconsideraresistentecuandoelhaloderesistenciaesde<10mmdedimetro. Micrococcussonsensiblesabacitracina. Staphylococcus,sonresistentesabacitracina. Optoquina: es un compuesto qumico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celular de la bacteria y que a bajas concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae que es sensible de otros Streptococcus hemolticos. Se utiliza un disco de optoquina que se deposita en una placa de agar sangrecorderoluegodehaberdiseminadolacoloniasospechosa.Seincubalaplacaa

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37Cpor24horasydespussemideelhalodeinhibicin.Sielhaloesde14mm, correspondeaStreptococcuspneumoniae Novobiocina:esunantibiticoactivoporvaoral.Seutilizaparaeltratamiento

deinfeccionesporS.aureusyparaeltratamientodeinfeccionesurinariasresistentesa otros frmacos. Este frmaco se utiliza muy poco debido que su uso est asociado a una alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes. Amoxicilina / cido Clavulnico: La asociacin amoxicilina/cido clavulnico

est indicado para el tratamiento a corto plazo de las infecciones bacterianas en las siguienteslocalizacionescuandosesospechaqueestncausadasporcepasresistentes a amoxicilina productoras de betalactamasas. En otras situaciones, debera considerarselaamoxicilinasola.

Infecciones del tracto respiratorio superior (incluyendo ORL), en particular sinusitis, otitis media, amigdalitis recurrente: Estas infecciones son a menudo producidasporStreptococcuspneumoniae,Haemophilusinfluenzae,Moraxella catarrhalisyStreptococcuspyogenes.

Infeccionesdeltractorespiratorioinferior,enparticularexacerbacionesagudas de bronquitis crnicas (especialmente si se consideran graves), bronconeumona. Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcuspneumoniae,HaemophilusinfluenzaeyMoraxellacatarrhalis.

Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales, en particular cistitis (especialmente cuando sea recurrente o complicada excluyendo prostatitis),abortosptico,sepsisplvicaopuerperalysepsisintraabdominal, las cuales son a menudo producidas por Enterobacterias (principalmente Escherichiacoli,Staphylococcussaprophyticusspp.yEnterococcusspp.)

Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales y abscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides spp.Algunascepasdeestosgrmenesproducenbetalactamasas,locualhace quenoseansensiblesaamoxicilinasola. 60

NOTA:

Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar.

RECUERDE EN TODO MOMENTO TRABAJAR CON TCNICA ASPTICA PARA EVITAR LA CONTAMINACIN QUE CONDUCIR A RESULTADOS ERRNEOS. RECUERDE QUE EST TRABAJANDO CON MUESTRAS BIOLGICAS Y MICROORGANISMOS PATGENOS, POR LO QUE DEBE APLICAR LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD APRENDIDAS CON ANTERIORIDAD.

Objetivos
1. 2. RealizarpruebasbioqumicasparalaidentificacindecocceasGrampositivo Reconoceralteracionesproducidasenlosmediosdecultivo,porlapresenciade productosintermediarios,debidoalaaccinbacteriana.

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ACTIVIDADESPRCTICAS
1. 2. 3. Observelasplacassembradas.Describalascoloniasbacterianas.Observesise tratadecultivospuros. RealiceunatincindeGramasumuestra.Observealmicroscopio. RealiceelTestdedifusinpordisco(Sensidisco) a) Ud. cuenta con una placa de agar Sangre donde se encuentra la bacteria en estudio. b) Con el asa, tome una colonia desde la placa y simbrela en el tubo de agua estrilhastaquequedeturbio. c) Tome la trula estril y (sin flamearla!!!!) sumrjala en el caldo recin inoculado.Flameelabocadeltuboycierre.Tomelatrulamojadaydeslcela sobretodalasuperficiedelagarMllerHinton(Staphylococcus)oagarSangre (Streptococcus).Unavezquetermine,eliminelatrula. d) Tome la pinza y flamela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos (discos de papel impregnados con el antibitico) y distribyalos homogneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre s, ya que estas situaciones dificultarnlamedicindeloshalosdeinhibicin.

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Nota: Asegresedeflamearlaspinzascadavezquevaatomarunsensidiscoyenfre enlatapadelaplacaantesdesacaruno. Trate de no tocar el agar al poner los discos, slo djelos caer desde cerca y presinelossuavementecontraelagarconlapinza(sinhundirlos!!!) ObservacindeunTestdeSensidiscos Observeloshalosdeinhibicinymidaeldimetrodeestosparadeterminarsi la bacteria es susceptible, intermedio o resistente con respecto a los antibiticosdispuestosenelagar.CompareconlaTablaadjunta. Tiposdezonasquepuedendesarrollarsealrededordelosdiscos: a. Resistentes:Nohayzonadeinhibicinosiexisteesmuyestrecha. b. Intermedio: Hay una estrecha zona libre de crecimiento bacteriano alrededordeldisco. c. Sensible:Hayunaampliazonalibredecrecimientobacterianoalrededordel disco. 4. Realicelaspruebasbioqumicascorrespondientessegnlatabla Para el estudio de bacterias Gram positivo, se utilizan bsicamente la deteccindeenzimasylasensibilidadacompuestosqumicosoantibiticos. Anteesto,seestudiarlapresenciadeenzimascomocatalasaycoagulasa.La sensibilidadaantibiticossetocenelpuntoanterior. Catalasa:Buscalapresenciadelaenzimacatalasa,quedescomponeelH2O2en H2O+O2 La enzima se encuentra en la mayora de las bacterias que contienen citocromo.LaexcepcinesStreptococcusquenopuededescomponerelH2O2. El test permite diferenciar Staphylococcus, Micrococcus y Listeria (catalasa +) deStreptococcus(catalasa). Se debe colocar una gota de perxido de hidrgeno en un portaobjetos, sobrelacualseagregalacoloniaenestudio.Laaparicinrpidaysostenidade burbujas(antesde20segundos)indicatest(+). 63

Precauciones: no tocar el agar sangre al tomar la colonia ni usar asas de platinoyaqueestassustanciasdanfalsospositivos. ProcedimientoPruebadelacatalasa a) Flamee brevemente una pipeta Pasteur y tome una colonia desde el agar (sinsacaragar). b) PaselaPasteurconlabacteriasobreunportaobjetoyeliminelaPasteur. c) Ponga sobre el portaobjeto con la bacteria una gota de H2O2 y observe. AnoteloobservadoycompareconsuresultadodelGram. Coagulasa: Busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcusaureus. La enzima es un activador del fibringeno a fibrina, adems, la pared de Staphylococcusaureusposeereceptordefibringenoloquepermitelaformacin depuentesentrebacteriaybacteria,formndoseuncogulo. DiferenciaStaphylococcusaureusdeotrosStaphylococcuscoagulasanegativo. Serealizaentuboconplasmadeconejooenlminacomotestdeaglutinacin conpartculasdelatex.Sedebecolocarunagotadelreactivolatexsobreuncrculo delatarjeta,acontinuacinseemulsionasobrelagota,lacoloniasospechosa,se agita durante unos segundos y si hay formacin de grumos visibles se considera positiva.Siempresedeberealizaruncontrolnegativoqueestincluidoenelkit.El fundamentodelatcnicadeaglutinacinconpartculasdeltexsemuestraenla figuraN3.

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ProcedimientoPruebadelaCoagulasa: a. Tome una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas. b. Conunpalillodeplsticotomevariascoloniasdesdeelagar. c. MezcleconlasolucindeanticuerposdelTestdeaglutinacin(plasmade conejo). d. Espereunosminutosagitandoconstantemente. e. Si existe la presencia de cogulos (como leche cortada), la reaccin es positiva. Si se ve siempre homogneo, la reaccin es negativo. Anote lo observadoycompareconsuresultadodelGram. 5. La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los descubridores del fenmeno.EsteprocedimientoseutilizaparaconfirmarlapresenciadeStreptococcus tipo B por la produccin de una zona de hemlisis caracterstica cuando crece en la proximidaddeStaphylococcusaureus,loquesedenominapuntadelanza(Verfigura adjunta) Procedimiento: 1. Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una nica estra en elcentro a partirdeuncultivodeStaphylococcusaureus. 2.Perpendicularalaestraoriginal,realiceconelasaunaomsestrasconelcultivo deStreptococcus. 3.Incubaralatemperaturaadecuada. 65 TestdeCAMPparaStreptococcus

6.Siembradefloranormalenplacasdeagarsangre. a.Tomarunamuestradefloranormalconunatrulahumedecidaensuerofisiolgico, deunazonaanatmicadeinters(boca,manos,narz,etc.) b.Sembrarenplacasdeagarsangreeincubara37Cpor24horas. c.Realizaranlisismacroymicroscpicodelacoloniamsrepresentativa.

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APUNTES

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APUNTES

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TRABAJOPRCTICON4:

FISIOTAXONOMADEBACTERIASGRAMNEGATIVO

Objetivos
1. Realizar pruebas bioqumicas convencionales para la identificacin de bacterias Gramnegativo. 2. Realizar Test de Deteccin Comerciales para la identificacin de bacterias Gram negativo(API10EAPI20EAPI32AAPI10S). 3. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productosintermediarios,debidoalaaccinbacteriana. 4. Realizarpruebadesusceptibilidadantimicrobianapordifusinenagar. EnellaboratoriodeMicrobiologaelanlisisdeunamuestrasigue,porlogeneral, lasiguientesecuencia: a) Siembrayobtencindelmicroorganismoaislado(cultivopuro) b) Observacindemorfologamacroscpica c) Tincionesyobservacindemorfologayagrupacinmicroscpica. d) Identificacinfisiotaxonmica(reaccionesmetablicasespecficas) e) Estudiosdesensibilidadaagentesmicrobianos. ComosevioeneltrabajoprcticosobrebacteriasGrampositivo,lafisiotaxonoma bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a travs de las alteraciones que producen en medios de cultivo indicadores. Estas alteraciones son producidas por enzimas especficas de las diferentes bacterias, ya que no todos los microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales o poseen las mismas rutas metablicas. De este modo esta tcnica taxonmica se basa principalmenteenladeteccinde: a) Utilizacindefuentesdecarbono. b) Formacindeproductosfinales. 69

c) Presenciadeenzimas d) Sensibilidadaproductosqumicosoantibiticos. La identificacin de un bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayosbioqumicosquegeneralmentedeterminanlaactividaddeunavametablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un mediodecultivoyquelabacteriaalcrecertransformaono. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponenelmejorconjuntodepruebasbioqumicasparalaidentificacindeungrupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Laspruebasoensayosbioqumicos,sonpruebassimplesquesehandesarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinadavametablica,crecimientoaunadeterminadatemperatura,crecimiento enpresenciadeinhibidores,etc.Nosignificandeningunamaneraunestudioprofundo delmetabolismobacteriano. Parallevarlasacabo,sepuedenutilizardiferentessistemasdetrabajo(mediode cultivo, indicador, revelador, etc.) que pueden ser diferentes an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factoresdecrecimientoelmediodecultivoparaestudiarlafermentacindedistintos azcarescuandosesabequeelmicroorganismoenestudioesexigente. A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeos compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean cdigosnumricosparalainterpretacinderesultados.

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Labateraconlacualtrabajaremosenellaboratorioconstade6tubosconmedio estril: 1.Agartendidocorriente: Es un medio slido nutritivo, que permite observar posiblepigmentacinenlascolonias. 2.AgarUrea:Esunmedioslidoenlquesepuedeobservarlaproduccinde ureasa ya que contiene adems de nutrientes bsicos: Triptona Urea IndicadordepHfenolftalena

Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias que poseen la enzima ureasa y pueden degradar urea a amonaco y CO2. Esta reaccin es fcilmente evidenciable por que el pH vara hacia alcalino debido al efecto del amonaco. El cambiodepHseobservaporvirajedeunindicadordepHcomolafenolftalena.

3.AgarCitrato:Estemediodecultivocontieneademsdesalesminerales: Fosfatodeamonio Citratodesodio,comonicafuentedecarbono IndicadordepHazuldebromotimol(verdeapH

neutro,azulapHalcalino) Estemediocontienecomonicafuentedecarbonoelcitratoysolamentepueden desarrollarse aquellas bacterias que posean la enzima citrato permeasa la que les permitetransportarelcitratoatravsdelamembranacitoplasmtica.Unavezenel 71

interior de la clula el in citrato es metabolizado a travs del ciclo de los cidos tricarboxlicos.

Coloracinazuldelmedioindicapruebapositiva. 4.AgarTSI:Lasbacteriaspuedenutilizarazcares(hidratosdecarbono)atravs devariasrutasmetablicas.Losproductosfinalesdeestasreaccionesdependernde la bacteria de que se trate, del azcar utilizado y de la ruta metablica. En general estosproductosserncidos(frmico,pirvico,lctico,etc.)ygases(CO2,H2).Existen muchosmediosdecultivoquesehandiseadoconelobjetodedetectarlaproduccin decidosydegasapartirdedistintosazcares. El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesariosparaelcrecimientodelasbacteriasyquepermitevisualizarutilizacinde azcares. Contiene adems de nutrientes como extracto de carne, extracto de levadura,peptona,etc: Glucosa Lactosa Sacarosa 0,1% 1,0% 1,0%

CitratodeamonioyHierro IndicadordepHrojodefenol(amarillopHcido,rojopH

alcalino) La bacteria primero usar glucosa, como la concentracin es baja, se agota rpidamente. Si la bacteria fermenta solamente la glucosa, en el fondo del tubo se producirn cidos y el indicador de pH virar a amarillo. En cambio, en la superficie 72

inclinada por efecto del metabolismo oxidativo de los aminocidos presentes en el mediodecultivo,seproducirnaminas,porloqueelindicadorenlasuperficievirara rojo. Si la bacteria fermenta adems de la glucosa, la lactosa (que est en mayor concentracin)todoeltuboviraraamarilloporlaproduccindecidos,puesnose alcanzaaconsumirtodalalactosapresente. Si se produce gas se observar como quiebres en el agar o separacin de la

columnadeagardelfondodeltubo. Si la bacteria produce H2S, este reacciona con la sal de hierro dando sulfato

ferroso,uncompuestoinsolubledecolornegro. Estemediopermitediferenciaralosmicroorganismosquefermentanazcaresde losqueno.Siemprehayqueasegurarsequeexistadesarrollobacteriano.

C:Controlnegativo 1: Desaminacin de aminocidos positiva, fermentacin de glucosa negativo, fermentacindelactosaysacarosanegativo,produccindeH2Snegativo. 2: Desaminacin de aminocidos positiva, fermentacin de glucosa positiva, fermentacindelactosaysacarosanegativo,produccindeH2Snegativo. 3: Desaminacin de aminocidos positiva, fermentacin de glucosa positiva, fermentacindelactosaysacarosanegativo,produccindeH2Spositivo. 4: Desaminacin de aminocidos positiva, fermentacin de glucosa positiva, fermentacindelactosaysacarosapositiva,produccindeH2Snegativo. 5: Desaminacin de aminocidos positiva, fermentacin de glucosa positiva, fermentacindelactosaysacarosapositiva,produccindeH2Spositiva. 73

5.AgarLIA:Lasdistintasbacteriasposeenenzimasinduciblesquepuedenactuar sobre algunos aminocidos, desaminndolos o descarboxilndolos. Ejemplo de estas reacciones enzimticas son: la descarboxilacin de la lisina y la desaminacin de la lisina. Otro efecto de las bacterias sobre aminocidos azufrados es la remocin del grupoSH2,produciendoH2S(reaccinqueseobservatambinenelmedioTSI). Este medio contiene adems de nutrientes como peptona y extracto de

levadura,etc.: Aminocidolisina Aminocidosazufrados Glucosa Citratodehierroyamonio IndicadordepHprpuradebromocresol(amarilloapH

cido,moradoapHalcalino). LabacteriaprimeroutilizalaglucosaproduciendocidoporloqueelpHbajayel indicador vira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina descarboxilasa se mantendrestacoloracinamarilla(ReaccinK/A,negativo).SilabacteriaPRODUCE la enzima lisina descarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la lisina dando comoproductoCO2yunadiamina(alcalina),entonceselindicadorviranuevamente hacia el lado alcalino y se revierte el viraje de amarillo a morado (Reaccin K/K, positiva) SilabacteriaproduceH2Sstereaccionaconlasaldehierroformandosulfuro

ferroso (negro). Si la bacteria es capaz de desaminar a la lisina, la superficie se ver rojayelfondoamarillo(ReaccinR/A)

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6. Medio MIO: Permite observar motilidad. Si el crecimiento bacteriano se observacomoelenturbamientocompletodelmedio,lareaccinespositiva.Sislose limitaalpinchazo,esnegativo.Tambinesposibleobservarlapresenciadelaenzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios aminocidos en algunas bacterias. La reaccin positiva se observa por el color morado del tubo, en cambioenlareaccinnegativaelmediosetornaamarillo(puedeponersemoradoel fondo).Adems,sepuedeobservarlapresenciadeindol,paralocualhayqueagregar unagotadereactivodeKovacs.Enestecaso,lareaccinpositivaserlaaparicinde unarorojosobrelasuperficiedelmedio.

En la figura, los pares estn organizados sin y con reactivos de Kovacs, respectivamente. 1:Motilidadnegativa,ornitinadescarboxilasanegativo,indolpositivo(conreactivode Kovacsseobservaanillofucsia) 2:Motilidadpositiva,ornitinadescarboxilasapositiva,indolnegativo(conreactivode Kovacsseobservaanilloamarillo) 3:Motilidadpositiva,ornitinadescarboxilasapositiva,indolpositivo. Otra prueba que complementa la determinacin de una especie bacteriana

desconocida es la susceptibilidad a antibiticos. Los antibiticos son agentes teraputicosproducidospororganismosvivos,queinhibenodestruyenalosagentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad estn indicados para apoyar la quimioterapiaantimicrobianadetratamientoenprocesosinfecciososporbacteriasen las que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiablesususceptibilidad.Estosensayossonamenudoindicadoscuandosepiensa

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queelorganismocausanteperteneceaunaespeciecapazdemostrarresistenciaalos agentesantimicrobianosmscomnmenteusados. Los mtodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son mtodos

que determinan in vitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentesantimicrobianosbajocondicionesespecficasyestandarizadas. NOTAPARALAPRUEBADELABORATORIO:NOesnecesarioqueUd.seaprendade memoriacadaunadelasreaccionesbioqumicasquesedescribieron.Slodebeser capaz demanejarlosconceptosgenerales,como porejemplo: "elmedioMIOsirve paraversilabacteriaesmvilono".

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ACTIVIDADESPRCTICAS

1. SiembradeBateraBioqumica.
Cada grupo contara con una batera convencional compuesta por 6 pruebas bioqumicas dispuestas en 6 tubos. Para sembrar la batera se deben seguir las siguientesindicaciones: a. Flameeelasaparasuesterilizacin. b. Tome una colonia aislada de la placa de agar Nutritivo sembrada y tape la placa. c. Flameelabocadeltuboconcaldoestril,sumerjaelasaconcuidadoyagite. d. Flamee el asa para su esterilizacin. El caldo recin sembrado ser utilizado comoinculoparasembrartodalabatera. e. Esterilice el asa, enfre en las paredes internas del tubo recin sembrado y sumrjalaenelcaldo. f. Useesteinculoparasembrartodoslostubosdelabatera. g. Antes de empezar, anote los colores de los distintos medios. Esto le servir parahacerunacomparacinconelresultadofinal. h. Paracadatubodelabateraelasadebeseresterilizadapreviamenteyenfriada enlasparedesdeltuboantesdesumergirlaenelcaldoinoculado. Posteriormentesiembreenlosmedioteniendoencuentaque: 1. Los medios semitendidos (Agar TSI, Urea y LIA) se deben sembrar en profundidadyensuperficie,esdecir,atravesndoloshastaelfondoconelasa enpunta,yluegoenzigzagporlasuperficie. 2. Los medios tendidos (Agar Citrato y Corriente) se siembran slo en la superficie,esdecir,serealizaunzigzagconunasaconvencional(enargolla). 3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inculo dentro del tubo con el medio. 4. Losmediossemislidos(agarMIO)sesiembransloenprofundidadconunasa enpunta,pinchandoelagarhastalamitaddeltuboaproximadamente. LecturaeinterpretacindelaBatera. Una vez que la batera es sembrada, se incuba a 37C para que los microorganismos crezcan y produzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se leen y se comparan con la Tabla de Resultados adjunta.

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2. Siembra de Tira reactiva comercial para la identificacin de bacteriasGram()(API10S)

a. Preparar una cmara de incubacin y rellenar con agua corriente lo pocillos paramantenerunambientehmedo.QueNOquedunexceso. b. Anotarenelexcesodelatapa,enlapartelateral,elnombredelabacteriayel deunintegrantedelgrupo. c. Coloquelagaleradereaccionessobrelacmaradeincubacin. d. Tomeconelasaunacoloniadesdeelagarysiembreeneltubodesueroestril hastaunamedidadedensidadigual0.5McFarland(Estndardeturbidez). e. ConunapipetaPasteurestril,inoculecadaunadelasceldasdelagalerahasta elmenisco,talycomosemuestraenlafiguraadjunta(lneaazul).

f. LlenarlaspruebasCIThastalacpula(verfigura)

g. EnlaspruebasLDC,ODC,UREyH2Scoloque,despusdeinocular,unagotade aceitemineral,paracreaunambientemicroaeroflico. h. Incubara37C g. Lea la tira de acuerdo a la Tabla anexa y luego agregue los reactivos abajo mencionados: h. Para la produccin de Indol: Coloque una gota del reactivo de James en la pruebaIND(esperarunpardeminutos).Coloracinrosaindicapositivo. ParalaproduccindeNitritos:ColoqueunagotadelreactivodeNIT1yNIT2en lapruebaGLU.Esperarunosminutos.Coloracinrojaindicapositivo. 78

 Paraladeteccindetriptofanodesaminasa:ColoqueunagotadeFeCl3(TDA) enlapruebaTDA(Marrnespositivo) i. j. LeaycomparesusresultadosconlaTablaadjunta. Rellenelacartilladeresultadossegncomodetallelaprofesora.

k. Comparesucdigonumricoconloscatlogosquetienelaprofesora.Anoteel resultadoenlacartillaygurdeloparapegarloensuinforme.

TEST ONPG GLU ARA LDC ODC CIT H2S URE REACCIONES Betagalactosidasa Fermentacin/oxidacinglucosa Fermentacin/oxidacin arabinosa Enzimalisinadescarboxilasa Enzimaornitinadescarboxilasa Utilizacindelcitrato ProduccindeH2S Enzimaureasa POSITIVO Amarillo Amarillo,amarillo/gris Amarillo Naranja Rojo/naranja Azul/verde,azul NEGATIVO Incoloro Azul,azul/verdoso Azul,azul/verdoso

Amarillo Amarillo verde plido/amarillo Depsito/lneanegra Incoloro/gris Rojo/naranja Amarillo

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3. Testdesusceptibilidadaagentesantimicrobianos MtododedifusinenagaroKirbyBauer
a. Tomeunatrulaestrily(sinflamearla!!)sumrjalaenelcaldoconelinoculo. Flameelabocadeltuboycierre. b. Deslice la trula mojada sobre toda la superficie del agar MllerHinton. Una vezquetermine,eliminelatrula. c. Dejesecarlaplacaconlatapaligeramenteentreabierta. d. Tome la pinza y flamela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscosy distribyalos homogneamenteen la placa, cuidando de que no quedendemasiadocercadelbordedelaplacanidemasiadocercaentresi. e. Incubea37Cdurante16hrs. f. Observeymidaeldimetrodelhaloformadoalrededordelossensidiscos. NOTA: Losdiversostamaosdeloshalosdeinhibicinproducidosporantibiticosdiferentes paraunamismaespeciebacterianaNOPUEDENSERCOMPARADOSENTRESI. 80 Segnlatablaadjunta,determinesensibilidadoresistenciaalantibitico. Compareresultadosusandodiferentesespeciesbacterianas.

Por ejemplo: un halo de inhibicin de 30 mm para Penicilina no indica mayor sensibilidadqueunhalode20mmparaTetraciclina. Interpretacin de los halos de Inhibicin para Enterobacterias (Mueller-Hinton)
DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm)

Ampicilina Gentamicina Cloranfenicol Ciprofloxacino Cefotaxima Tetraciclina Ceftazidima Amoxicilina / c. Clavulanico

Carbenicillin para Especies de Proteus E. coli Carbenicillin para P. aeruginosa Ceftazidima para P. aeruginosa Clindamicina Ciprofloxacino

10 g 10 g 20 g 5 g 30 g 30 g 30 g 20 / 10 g
100 g 100 g 30 g 2 g 5 g

17 15 18 21 26 15 21 18
17 13 14 14 15

14 16 13 14 13 17 16 20 23 25 12 14 18 20 14 17
18 22 14 16 15 17 15 20 16 20

13 12 12 15 22 11 17 13
23 17 18 21 21

4.Anlisisdelamuestraproblema.
Analicemacroscpicamenteunacoloniaaisladadesumuestraproblema. A partir de una colonia aislada, siembre en cuadrantes en una placa de agar MacConkey,parasuincubacina37C. Compare los resultados obtenidos en la batera bioqumica tradicional con los resultadosobtenidoseneltestcomercial.

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LecturadeBateraBioqumica
AgarUrea Reaccinpositiva :Elagarsetornafucsia. Reaccinnegativa :Elagarnocambiadecolor. AgarCitrato Reaccinpositiva :VirajedelindicadordepHacolorazul(alcalino). Reaccinnegativa :Elagarpermanecedecolorverde(neutro). AgarTSI Utilizacindeglucosa :Superficieroja(pHalcalino).SeanotaK Fondoamarillo(pHcido).SeanotaA Utilizacindelactosa :Fondoysuperficieamarilla(pHcido).SeanotaA/A Produccindegas :Rupturadelacolumnadeagar ProduccindeH2S :Ennegrecimientodelagar. Reaccinnegativa :Eltubonovaradecolor.SeanotaK/K. AgarLIA Descarboxilacindelisinapositivo :todoeltubomorado(alcalino).SeanotaK/K Descarboxilacindelisinanegativo :superficiemorada(alcalina).SeanotacomoK fondoamarillo(cido).SeanotacomoA Desaminacindelisinapositivo :superficieroja.SeanotaR fondoamarillo.SeanotaA Desaminacindelisinanegativo :nohaycambio.SeanotaA/A ProduccindeH2S :ennegrecimientodelagar MedioMIO Reaccinpositiva :Elmedioseobservadecolormorado. Reaccinnegativa :Elmediosetornaamarillo(puedeponersemoradoelfondo). Presenciadeindol Reaccin positiva ser la aparicin de un aro rojo sobre la superficie del medio al agregarunagotadereactivodeKovacs.

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APUNTES

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APUNTES

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RESULTADOSMASFRECUENTESDEALGUNASPRUEBASBIOQUIMICASPARALAFAMILIAENTEROBACTERIACEAE
Escherichiacoli Shigellaflexneri Shigelladispar Salmonellatyphi SalmonellaparatyphiA SalmonellaparatyphiB Salmonellagallinarum Citrobacterfreundii Klebsiellapneumoniae Enterobacteraerogenes Enterobacterhafniae Serratiamarcescens Serratiarubidae Proteusvulgaris Proteusmirabilis Pseudomonas i * Alcaligenesfaecalis* Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato H2S AG A A AG AG A AG AG AG AG V AV AV AG + V + + + V + V V +/ + + V + + + V + V + + + + + + + + + + + + + + + + + + + /+ + + + + + V + + + + + V + + V (+) + V + + +/ +/ + + Motilidad Indol +/ + + + + + + + +/ + + + + + + + + VP + + +/ + + /+ RM + + + + + + + + /+ /+ /+ + + PigmentoUrea + + + V V + +

*NopertenecenalafamiliaEnterobacteriaceae AG =AcidoGas(utilizacindelsubstratoyproduccindegas) V =Variable (+) =Positivodespusde34das +/ =Generalmentepositivo /+ =Generalmentenegativo 85

TABLA I Fermentacin de Glucosa Positivo Fermentacin de Lactosa Positivo Lisina Desaminasa Negativo Produccin de H2S Positivo Indol Negativo Lisina Descarboxilasa Positivo Salmonella Arizonaa Negativo Citrobacter freundii Positivo Escherichia coli Negativo Lisina Descarboxilasa Positivob Indol Negativo Enterobacter spp. Klebsiella spp.

Nota : Todos producen gas de glucosa. Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er da a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.
86

TABLA II Fermentacin de Glucosa Positivo Fermentacin de Lactosa Negativo Lisina Desaminasa Negativo Produccin de H2S

Positiva Lisina Descarboxilasa Indol

Negativo Lisina Descarboxilasa Indol Citrato

Positivo Proteus vulgaris

Negativo Proteus mirabilis

Negativo Proteus morganii

Positivo Proteus rettgeri

Nota : P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato Todos producen un poco de gas de Glucosa Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia

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TABLA III Fermentacin de Glucosa Positivo Fermentacin de Lactosa Negativo

Produccin de H2S

Positiva Lisina Positivo Indo Positivo Citrato Negativo Negativo Edwarsiella Salmonella Typhi Salmonella Arizona Negativo

Negativa Lisina

Negativo

Positivo Indol Negativo Citrato Positivo Serratia

Negativo Citrato Negativo

Citrato Positivo Citrobactera Citrato Positivo Salmonella Paratyphi

Indol

Negativo Salmonella Paratyphi A Shigella spp.

Positivo Shigella spp. Yersinia enterocolitica

Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica. No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de

a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo

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TRABAJOPRCTICON5:

AISLAMIENTOBACTERIANODESDEALIMENTOS

OBJETIVO:
Aislamientoyposterioridentificacindedistintasespeciesbacterianasapartirde diferentesmuestrasdealimentos.

INTRODUCCIN
Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se deben conocer previamente los requerimientos nutricionales y las condiciones ambientales ptimas para su crecimiento. Los alumnos debern buscar en la bibliografa, las caractersticas metablicas y el hbitatdelosmicroorganismosquesevanautilizar. Organismosaaislareidentificar: Enterobacterias Staphylococcussp. Pseudomonassp. Vibriosp. Lactobacillussp. BacteriasProbiticas Lasbacteriasprobiticascorrespondenabacteriasvivasqueproducenalgntipode beneficioalorganismohospedero.Presentesennumerososproductoslcteos,estn compuestasmayoritariamenteporlosgnerosBifidobacteriumyLactobacillus.

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Los beneficios de estas bacterias en el organismo son variados: Alivio en la intoleranciaalalactosa,mejoraenelsistemainmunolgico,efectoanticancergeno, competenciaconpatgenos,entreotros.

Cultivoenanaerobiosis. Algunas especies bacterianas presentes en alimentos requieren de condiciones especiales de cultivo como por ejemplo una baja o nula concentracin de oxgeno parasucrecimiento. Existen diferentes sistemas que son satisfactorios para el cultivo de bacterias anaerobias; uno de los ms utilizados es el Sistema GASPAK, que consta de un soporteparaplacasincluidoenunacubetatransparentecontapahermtica(figura1). Paracrearlaatmsferaanaerbicaseutilizaunsobrecomercialconcatalizadorque contiene una tableta de borohidrato sdico y otra de bicarbonato sdico y cido ctrico. Lasplacasylostubossembradosenelinteriordelajarra,obtendrnunambientede anaerobiosis,alreaccionarelcatalizadorcon10mldeaguadestiladaestrilquese adiciona al sistema, de esta manera se produce la reduccin del oxgeno segn la siguientereaccin. 2H2+O2 2 H 2O

AdemsenotrasreaccionesseformaH2yCO2. Paraconfirmarelambienteanaerobio, secolocadentrodelajarraunpapelindicador(azuldemetileno)queviradecolor(de azulablanco)enpresenciadeCO2. Figura1:SistemaGASPAKparacrecimientodebacteriasanaerbicas 90

MEDIOSDECULTIVOTILESPARAAISLAMIENTODEBACTERIASDESDEALIMENTOS AgarMacConkey: EstemedioseutilizaparaelaislamientodebacilosGramnegativosdefcildesarrollo, aerobios yanaerobiosfacultativos.Permitediferenciarbacterias queutilizan o no, la lactosacomofuentedecarbono.Enmuestrasclnicas,deaguayalimentos.Todaslas especiesde lafamiliaEnterobacteriaceaepuedencrecerenelmismo.En estemedio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliaresyelcristalvioletasonlosagentesselectivosqueinhibeneldesarrollodegran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismosnofermentadoresdelactosaproducencoloniasblancas. UnmediocomplementarioalagarMacConkeyeselagarENDOLESparaelaislamiento y cultivo de bacterias coliformes desde distintas fuentes como agua, alimentos y muestras clnicas. Al igual que el agar MacConkey, este agar permite el crecimiento selectivo de Gram negativos e inhibe el crecimiento de Gram positivos. Aquellas bacterias coliformes capaces de fermentar la lactosa (por ejemplo Escherichia coli) formarncoloniasdecolorrojoenelmediodecultivo,mientrasqueaquellasqueno soncapacesdehacerloproducirncoloniasdecolor blancooincoloras(porejemplo Salmonella). AgarManitolsalado: Mediodecultivoselectivoydiferencial,utilizadoparaelaislamientoydiferenciacin de Staphylococcus. Es recomendado para el aislamiento de Staphylococcus patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materialesdeimportanciasanitaria. Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los Staphylococcus coagulasa positivo hidrolizan el manitol acidificando el medio por lo quelascoloniasaparecenrodeadasdeunazonaamarillabrillante.LosStaphylococcus coagulasanegativos,presentancoloniasrodeadasdeunazonarojaoprpura.Eneste 91

medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable,elclorurodesodio(queseencuentraenaltaconcentracin)eselagente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicadordepH.Lasbacteriasquecrecenenunmedioconaltaconcentracindesaly fermentanelmanitol,producencidos,conloquesemodificaelpHdelmedioyvirael indicador de pH del color rojo al amarillo. Los Staphylococcus crecen en altas concentracionesdesal,ypuedenonofermentarelmanitol.Staphylococcusaureuses capaz de fermentar el manitol y sus colonias se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Por otra parte, los Staphylococcus que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismocoloroprpura. AgarPseudomonas: Mediodecultivoparaelaislamiento,ladeteccinyladiferenciacindePseudomonas aeruginosaydeotrasespeciesdelgnero.Lafrmuladeestemedioestdesarrollada parafavorecerlaseleccindeP.aeruginosayestimularlaformacindepigmentos.Es tambinconocido comoMedioKingA. Eneste medio,lapeptonadegelatinaaporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccindepigmentos,lassalesdemagnesioypotasioestimulanlaproduccinde piocianinaypiorrubinaeinhibenlaproduccindefluorescena.Luegodelaincubacin puede observarse la produccin de piocianina como una zona de color azulverdoso querodealacoloniaoqueseextiendeentodoelmediodecultivodebidoaladifusin del pigmento. La produccin de piorrubina se observa como una zona de color rojo alrededor de la colonia o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusindelpigmento. AgarTCBS: Es un medio selectivo para el aislamiento y cultivo de distintas especies del gnero Vibrio. Pueden aislarse distintas especies desde fuentes como alimentos hasta muestras clnicas. Este medio es altamente selectivo para Vibrio sp. debido a sus componentesnutricionalesyalaaltaconcentracindesales.Estemediojuntoconel 92

aguapeptonadaalcalinaesutilizadoparaelaislamientodeV.choleraeyotrasespecies a partir de muestras fecales. Componentes como el extracto de levadura y las peptonas proporcionan al medio la fuente de nitrgeno, vitaminas y aminocidos. El citrato de sodio, el tiosulfato de sodio y la bilis actan como agentes inhibidores de bacterias Gram positivas y coliformes dando alcalinidad al medio. La sacarosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio promueve el crecimiento, el tiosulfatodesodioeslafuentedesulfuro yelcitratodehierroesun indicador para detectarlaproduccindeH2S.ElazuldebromotimolactacomoindicadordepH. Luegode1824hrs.deincubacin,elcrecimientodeVibrioscapacesdefermentarla sacarosa da lugar a la formacin de colonias lisas, opacas y de color amarillo. V. vulnificusnofermentalasacarosaporloquepresentaunacoloracinverde. AgarRogosa: Medio para el aislamiento y recuento de Lactobacillus, desde la cavidad oral y microfloraintestinal,tambinsepuedenencontrarenlalecheysusderivados.Dentro de sus componentes se caracteriza por un bajo pH y alta concentracin de acetato parainhibirelcrecimientodeotrosmicroorganismos.ElcrecimientodeLactobacillus en anaerobiosis se evidencia por la formacin de colonias redondas y blancas en el medio. METODOLOGAGENERAL: Paraelaislamientodirectodesdealimentodelasdistintasespeciesbacterianassevaa seguirelsiguienteesquema:

1. Tomar una muestra de alimento segn la especie bacteriana que se desee aislar. 2. Aislardirectamenteenmediodecultivoselectivoindicadoparacadacaso. 3. Incubaratemperaturaytiempoadecuados. 4. Observarcrecimientodecoloniasaisladas. 5. Realizaranlisismacroscpicoymicroscpicodecolonias.

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ActividadesPrcticas

1.AislamientodeEnterobacteriasdesdesandwich. 1 Tomar una muestra de sandwich desde una superficie de inters, empleando unatrulaestril. 2 DepositarmuestradealimentoenunaplacadeagarMacConkeyyenplacade agarENDOLES. 3 Aislarlamuestraempleandotcnicadeagotamientoporestrasconasaestril paracadacaso.Rotularlasplacas. 4 Incubardurante24hrs.a37C. 5 Realizar anlisis macroscpico observando colonias con distinta morfologa y color. 6 RealizaranlisismicroscpicoempleandotincindeGram. 2.AislamientodeStaphylococcussp.desdepastel. 1 Tomar una muestra de pastel desde superficie de inters, empleando una trulaestril. 2 Depositar muestra de alimento en una placa de agar manitol salado y agar sangre. 3 Aislarlamuestraempleandotcnicadeagotamientoporestrasconasaestril paracadacaso.Rotularlasplacas. 4 Incubardurante48hrs.a37C. 5 Realizar anlisis macroscpico observando colonias con distinta morfologa y color. 6 RealizaranlisismicroscpicoempleandotincindeGram. 3.AislamientodePseudomonassp.desdelecheyhuevo. 1 Tomarunamuestradelecheydehuevoempleandounatrulaestril. 2 DepositarmuestrasdealimentoenunaplacadeagarPseudomonas. 3 Aislarlamuestraempleandotcnicadeagotamientoporestrasconasaestril. Rotularlasplacas. 94

4 Incubardurante48hrs.a42C. 5 Realizaranlisismacroscpicoobservandocoloniasconpigmentacindecolor verdeazulado. 6 RealizaranlisismicroscpicoempleandotincindeGram. 4.AislamientodeVibriosp.desdechoritos. 1 Tomarunamuestradesdechoritos,empleandounatrulaestril. 2 DepositarmuestrasdealimentoenunaplacadeagarTCBS. 3 Aislarlamuestraempleandotcnicadeagotamientoporestrasconasaestril. Rotularlasplacas. 4 Incubardurante48hrs.a37C. 5 Realizar anlisis macroscpico de colonias observando morfologa y pigmentacin. 6 RealizaranlisismicroscpicoempleandotincindeGram. 5.AislamientodeLactobacillussp.desdeyogur. 1 Tomarunamuestradesdeyogur,empleandounatrulaestril. 2 Depositarmuestrasdealimentoenunaplacadeagarrogosa. 3 Aislarlamuestraempleandotcnicadeagotamientoporestrasconasaestril. Rotularlasplacas. 4 Incubar durante a 37 C en condiciones de anaerobiosis empleando una jarra Gaspak. 5 Realizaranlisismacroscpicodecolonias. 6 RealizaranlisismicroscpicoempleandotincindeGram.

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APUNTES

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APUNTES

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TRABAJOPRCTICON6:

HONGOSUNICELULARESYFILAMENTOSOS
INTRODUCCIN
LosHongosconstituyenungrupodiversodeorganismosunicelularesopluricelulares que se alimentan mediante la absorcin directa de nutrientes. Los alimentos se disuelvenmedianteenzimasquesecretanloshongos;despusseabsorbenatravsde lafinapareddelaclulaysedistribuyenpordifusinsimpleenelprotoplasma. Los hongos, junto con las bacterias hetertrofas y un reducido grupo de otros organismosconstituyenlosdescomponedoresdelabiosfera.Suactividadesesencial paraelcontinuofuncionamientodelanaturaleza.Ladescomposicinliberadixidode carbono y aporta compuestos nitrogenados y otros minerales al suelo, en donde puedensernuevamente utilizadosporlasplantasyeventualmente porlosanimales. Los hongos, equipados con un poderoso arsenal de enzimas que degradan los compuestosorgnicos,muchasvecesconstituyenorganismosdainosparaelhombre. Atacan madera, ropa, pintura, plumas, pelos, y de hecho casi cualquier sustancia. Puedencrecersobrepan,fruta,vegetales,carneyotrosproductos.Algunosproducen toxinasaltamentevenenosas. Por otra parte, muchos hongos son valiosos desde el punto de vista comercial. Por ejemplo las levaduras, que son tiles debido a su utilidad para producir sustancias como el etanol y el dixido de carbono. Otros son de inters como fuentes de antibiticos,incluyendolapenicilina,ademsdesuspotencialesusoscomofuentede protenas. Adicionalmenteesimportantesealarsuimportanciaenlaasociacinquepresentan conotrosorganismos.Porejemplo,lasasociacionesexistentesentreloshongosylas races de las plantas (micorrizas) juegan un rol fundamental en la nutricin y distribucindemuchasespeciesvegetales.Porotrolado,estnloshongospatgenos, quienes constituyen la principal causa de las enfermedades de las plantas. Cerca de 5.000especiesdehongosatacancultivoscomerciales,ademsdealamayoradelas especiessilvestres.

98

Aunque existe una importante discrepancia en la clasificacin de este reino, generalmente se le clasifica en tres rdenes: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota.Estosdosltimossonconsideradoshongossuperiores,mientrasqueel primero agrupa a los hongos inferiores. La clasificacin se basa en las diferencias en sus estructurasreproductivas. LosZygomycota poseen zygoesporas como esporas de reproduccin sexual (cigotos con una gruesa pared celular y sin asociacin a un oogonio), los Ascomycota producen ascoesporas, dentro de una estructura especial denominada ascos, mientras que los Basidiomycota producen basidioesporas en un basidio.
TALO

(cuerpomacroscpico) TantolaslevadurascomoloshongosfilamentosossesiembranenagarSabouraud, cuyocontenidoenglucosaesmayorqueeldeotrosmediosdecultivoyelpHescido (pH 5,6) para impedir la contaminacin bacteriana. Generalmente se incuban a 25 30C por un tiempo que depende de la especie fngica (levaduras y hongos ambientales,48haprox,hongosdermatofitos,1530das). Colonias algodonosas, lanosas, aterciopeladas Colonias semejantes a las bacterianas Sifonado Septado Levaduras Micelio Unicelular Pluricelular

99

Hongosunicelulares(Levaduras)
Las levaduras son organismos fngicos unicelulares que generalmente se reproducen asexualmente por gemacin. Normalmente prosperan en hbitats con abundanteazcar,talescomofrutas,floreseinclusolacortezadelosrboles.Algunas de ellas viven en simbiosis con animales, especialmente insectos. Las levaduras ms importantes desde el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas delgneroSaccharomyces,yaquejueganunpapelcrucialenlapreparacindelpan,la cerveza,elvino,etc. HongosFilamentosos: Estospueden sersifonados(aseptados)oseptados. Loshongossifonadosson

generalmentemultinucleares(ej.Mucoral)yloshongosseptadospresentanhifascon tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmtica (ej. Aspergillus, Dermatophytos).Granpartedeestetipodehongosseconsiderancontaminantesde alimentos, sin embargo Penicillium camemberti y Penicillium roqueforti son ejemplos de aquellos que son utilizados en la empresa alimenticia, especficamente en la generacindequesosespeciales:elquesoCamembertyelquesoRoquefort. 1) Hongosseptados Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium), como patgenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patgenos (ej. Dermatophytos). Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a ste gnero son

extremedamentefrecuentesenelmedioambienteydecrecimientorpido(48h).En contrasteconlamayoradelasinfeccionesproducidasporCandida,laaspergilosisse adquiere de fuentes exgenas. Estos microorganismo se identifican por sus caractersticas morfolgicas presentando colonias aterciopeladas, algodonosas o pulvurentas,coloreadas(crema,verde,cafynegras).Microscpicamentepresentan hifasseptadasdelaquenaceunaprolongacinnoseptada(conidforo),el cual se dilata en su extremo distal (vesculas) rodendose all de clulas conidiognicas

100

(filides).Lasfilidesproducenconidioslosquesedisponenenformadecadenas.El conjuntovescula,filideyconidiosseconocecomocabezaaspergilar.VerFigura2. De las aproximadamente 900 especies de Aspergillus descritas, A. Fumigatus y A. Flavus son las que con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son ubicuitarios en el ambiente y no forman parte de la flora normal del ser humano, aunque pueden producirse colonizaciones transitorias. La aspergilosis est asociada conproblemasrespiratorioscomoladilatacincrnicadelavaareahastauncolapso deunsegmentopulmonar.

Figura2:EstructuramicroscpicadeespeciesdeAspergillus. 101

Penicillium

:Estosmicroorganismosonubicuitariosenelmedioambientey

suelen aislarse en muestras de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio,desarrollndoseen34das.En1929,SirAlexanderFlemingobservque una especie de Penicillium haba contaminado su cultivo de Staphylococcus aureus, destruyendo las bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el hongo.Estaobservacincasualllevaldescubrimientodelapenicilina. Loshongosquepertenecenaestegnerosecaracterizanporlaproduccinde

conodiforos en el extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan en superficies, como una placa de agar, germinan y crecen rpidamente produciendo coloniasconaspectopolvoriento,decolorverdeazulado(Fig.3). P. marnefeii es la nica especie patgena de Penicillium y es causa de

infecciones espontneas del sistema retculoendotelial, afectando vasos linfticos, pulmn,hgado,bazoyhueso. Figura3:AspectomicroscpicodePenicillium. 102

2) Hongossifonados. Zigomicetos :EspeciesdeRhyzopus,MucoryAbsidiahansidoimplicadosen

cuadros de zigomicosis. Macroscpicamente presentan un micelio algodonoso. Microscpicamente, forman hifas aceptadas y se reproducen asexualmente produciendo esporangios en los que se desarrollan esporas (Ver figura 4). Las enfermedades asociadas a estos microorganismos son usualmente la mucormicosis rinocerebral. Esta infeccin se origina en los senos paranasales y puede afectar la rbita y el paladar, extendindose hacia el cerebro. En pacientes inmunodeprimidos puedeafectarelpulmn,eltractogastrointestinalylostejidossubcutneos.

Figura 4: Aspecto microscpico de hongos sifonados. 103

OBJETIVOS
1. Conocer y caracterizar la morfologa macroscpica de las colonias de hongos unicelularesolevaduras. 2. Conocerlamorfologamicroscpicadelaslevaduras.

ACTIVIDADESPRCTICAS
1. Observacinydescripcindecultivosdelevadura. a) Examen macroscpico: Describa, tal como lo haca para colonias bacterianas, forma,color,aspectodelasuperficie,borde,elevacinybrillodelascolonias. Anoteloqueobserve. b) Examenmicroscpico:RealiceunatincinGramtradicional.Esdecir,realiceun frotis con la colonia de levaduras en una gota de agua y contine con el protocoloporUd.conocido.Observeconinmersinydibujeloqueobserva. Nota:LatincinGramesslounatcnicadetincin.LaslevadurasnosonGram positivoniGramnegativo. RecuerdequelacaractersticadeserGrampositivo o Gramnegativoestrelacionadaconpropiedadesquepertenecenalasmembranas bacterianas. 2. Observacin,descripcinysiembradehongosfilamentosos. a) Examen macroscpicos: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa, polvorienta,lanosa)enanversoyreverso.Anoteloqueobserve. b) Examenmicroscpico:Paraestoseestudiaranmicrocultivospreparadosporlos docentesusandoelobjetivo40X. 104

3. Siembrayobservacindehongosprovenientesdemuestrasdealimento. a) Reconozcaapartirdediferentesmuestrasdequesos(Camembert,Roquefort), hongos que se encuentran formando parte del proceso de maduracin de stos.SiembreenagarSabouraudencsped.Realiceunexamenmacroscpico ymicroscpico.Anoteloqueobserve. b) ObservacindelevaduradelpanSaccharomycescerevisiae.Tomeunamuestra, resuspendaen medio de cultivo y siembre en cuadrantes en agar Saburoaud. Unavezcrecida,realiceTincinGramyobservacindeestehongounicelular. c) ObservacindeNdulosdeKefir(yogurdepajarito).RealiceunatincinGrama una muestra de ndulo y observe la diversidad microbiana que presenta este ndulo,incluyendolevadurasybacterias.

Nota:
Recuerdeelprincipalcriterioparala identificacindeestosmicroorganismosesel morfolgico,porlotanto,esimportantequetrabajeconcuidado. Recuerde que est trabajando con patgenos oportunistas: Trabaje siempre cerca delmecheroynoseacerquedemasiadoalosmediosquecontienenloshongos.As mismo,antecualquierposibilidaddecontaminacin,lvesedeinmediato.

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APUNTES

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APUNTES

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El camino al xito, comienza con el recorrido de nuestros esfuerzos

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