Aplicacion PCR

Extraccin y purificacin de los cidos nucleicos.

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Extraccin y purificacin de los cidos nucleicos

Todos los tipos de macromolculas biolgicas tienen una caracterstica en comn que va a permitir el desarrollo de un mtodo de separacin especifico para ellas. Estos mtodos deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente tiles al investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molcula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces de contaminantes de nuestra molcula en cuestin. En este sentido, la cromatografa en columna ha demostrado ser una herramienta muy til ya que se dispone de varios mecanismos de separacin. La modificacin de las diferentes fases estacionarias ya existentes, as como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtencin de las condiciones necesarias para la rpida y eficiente separacin de biomolculas. Cromatografa de penetrabilidad. El componente bsico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partculas de un polmero orgnico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidroflicos equilibrados con un tampn acuoso. La tcnica consiste en que las molculas de gran tamao no penetran por los poros del polmero, por lo que migran mucho ms rpidamente que las de menor tamao que s son capaces de penetrar por los poros de la matriz. Al principio del desarrollo de la tcnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones estaba restringido debido a los elevados tiempos de separacin y su poca resolucin. En la actualidad se han desarrollado matrices de slica estables a elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presin, para la separacin de biomolculas en funcin de su forma y tamao.

Cromatografa de intercambio inico. Es el mtodo ms utilizado para la separacin de cidos nucleicos. El mecanismo bsico es el intercambio reversible de los iones en solucin con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un cido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unir a un intercambiador inico con grupos cargados positivamente, pero eluir de la columna al cambiar el pH del tampn (tampn de elucin) ya que los iones del tampn de elucin interaccionan con los grupos cargados del cido nucleico o del intercambiador inico, respectivamente; primero eluirn de la columna las molculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al aadir el tampn de elucin, eluirn las molculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

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Una modificacin de este mtodo es la extraccin en fase slida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unin se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elucin se va incrementando la concentracin de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unin y se obtienen una rpida y eficiente purificacin de los cidos nucleicos (DNA y/o RNA).

Cromatografa de adsorcin. Se basa en la adsorcin y desorcin de los cidos nucleicos en presencia de sales caotrpicas. Bajo condiciones nativas, los cidos nucleicos estn recubiertos de una capa hidratante de molculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adicin de iones caotrpicos a los cidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de molculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrpicas crean un entorno hidrofbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofbicas, los cidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de slica de las columnas, mientras que las protenas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los cidos nucleicos se eluyen de la membrana de slica mediante tampones de elucin con baja concentracin de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los cidos nucleicos, liberndolos as de la membrana. Con esta tecnologa, no se produce ningn efecto sobre las molculas de los cidos nucleicos ya que la unin intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofbica. Con este rpido proceso de purificacin mediante la tecnologa de la adsorcin-desorcin sobre membranas de slica, se obtiene cidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciacin, blotting, clonaje, etc.

Ultrafiltracin. En esta tecnologa, la muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltracin y mediante vaco o centrifugacin, se eliminan todos los contaminantes mientras que la muestra con los cidos nucleicos permanecen retenidos en la superficie de la membrana. Despus de un paso de lavado opcional, se recuperan los cidos nucleicos aadiendo agua o un tampn adecuado.

Bolas magnticas. Con esta tecnologa, los cidos nucleicos se unen selectivamente a bolas paramagnticas en presencia de sales caotrpicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. Los cidos nucleicos purificados se eluyen de la solucin con las bolas paramagnticas bajo condiciones de baja salinidad y estn listos para ser usados en posteriores aplicaciones. Pasos generales de la extraccin. Todos los mtodos de preparacin de las muestras pueden dividirse en una serie de pasos generales, de tal forma que la necesidad de cada paso depende del microorganismo y de la muestra: Liberacin de los cidos nucleicos de las bacterias, hongos o virus. Puede ser un paso muy sencillo en el caso de los virus y algunas bacterias (Mycoplasma spp.) pero muy difcil en el caso de otras bacterias (Mycobacterium tuberculosis) y hongos. Hay una gran variedad de mtodos para la liberacin de los cidos nucleicos de diferentes microorganismos, entre los que se encuentran el hervir en agua destilada o tampn de PCR, el uso de detergentes con o sin calor, hidrxido sdico con calor, ciclos de congelacindescongelacin, SDS-proteinasa K, cido perclrico, enzimas (lisozima), sonicacin, etc. aunque la utilizacin de enzimas no es muy recomendable ya que la propia muestra puede contener inhibidores de las mismas. Proteccin y estabilizacin de los cidos nucleicos frente a la degradacin. El RNA es mucho ms difcil de estabilizar que el DNA.

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Eliminacin de inhibidores de la amplificacin. Para algunas muestras (esputo, sangre) pueden ser necesarios ms pasos que para otras (orina, LCR). Concentracin de la muestra y la diana en un pequeo volumen. Algunas muestras (esputo para M.tuberculosis y Legionella pneumophila y sangre para sepsis) requieren una mayor grado de concentracin que otras (orina para Chlamydia o Gonococcus) para alcanzar la sensibilidad deseada Colocacin de la diana en un medio acuoso compatible con el mtodo de amplificacin Los laboratorios generalmente utilizan diferentes mtodos para aislar el DNA de diferentes bacterias (ya sean gramnegativas o grampositivas); esto es un problema ya que requiere la preparacin y almacenamiento de una gran cantidad de reactivos y tampones y la utilizacin de diferentes protocolos de extraccin. A continuacin se muestra un protocolo universal de extraccin de DNA genmico con el que se pueden extraer entre 100 y 400g de DNA; consta de un mdulo central (til para la extraccin de DNA de bacterias gramnegativas, incluyendo las encapsuladas y las productoras de polisacridos) y un mdulo opcional (permite la extraccin de bacterias grampositivas): Mdulo central Cultivar los microorganismos en el medio ms adecuado o en 5-10mL de medio de cultivo. Si se utilizan placas de agar, recoger las colonias con un asa estril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensin (3,3mL de NaCl 3M; 1,0mL de Tris 1M pH 8,0; 2,0mL de EDTA 0,5M pH 8,0; 58,5mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL). Si se utiliza medio de crecimiento, centrifugar las colonias durante 5min a 3600g a 4C, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensin. Centrifugar la suspensin durante 5min a 3600g a 4C. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 3,78mL de buffer de suspensin. Aadir 200L de SDS al 20% y mezclar completamente mediante inversin. Incubar la mezcla a 37C durante 30min. Aadir 20L de proteinasa K (20mg/mL), mezclar y continuar incubando a 37C durante otro 30min. Aadir 720L de NaCl (5M), mezclar completamente, aadir 600L de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y mezclar por inversin. Incubar a 65C durante 10min y a 37C durante 5min. Aadir un volumen igual de PCI (25:24:1 fenol-cloroformo-alcohol isoamlico). Centrifugar a 1500g durante 15min. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Aadir un volumen igual de CI (24:1 cloroformo-alcohol isoamlico) y centrifugar durante 15min a 1500g. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Aadir 2,5 volmenes de etanol fro al 95%, mezclar por inversin y mantener a -70C durante 30min. Centrifugar durante 30min a 14500g. Eliminar el sobrenadante y secar el pellet mediante vaco. Resuspender el pellet en 400L de buffer TE (Tris HCl 10mM; EDTA 1mM pH 8,0) Aadir 1L de una dilucin 1:3 en agua estril de RNasa T1. Incubar la mezcla a 37C durante 1h. Centrifugar a 19900g durante 2 min. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Aadir 0,1 volmenes de acetato sdico 3M y mezclar bien. Precipitar el DNA con 2,5 volmenes de etanol fro al 95%. Mantener a -70C durante 20-30min. Centrifugar durante 8min a 19900g. Eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet con 500L de etanol al 70% y volver a centrifugar durante 8min. Descartar el sobrenadante, secar el DNA a vaco (15-30min) y disolver el pellet de DNA en 100-400L de agua estril. Medir la concentracin de DNA en un espectrofotmetro: diluir un alcuota 1:20 (15L en 285L de H2O), y leer a = 260nm. La A260 es igual a la concentracin de DNA en gr/L.

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Esquema del mdulo central del protocolo universal de extraccin de DNA genmico. Mdulo opcional para bacterias grampositivas Cultivar las bacterias en el medio ms adecuado o en 5-10mL de medio de crecimiento. Si se utilizan placas de agar, recoger las colonias con un asa estril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensin. Centrifugar las colonias durante 5min a 3600g a 4C. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1mL de solucin de prelisis (0,25mL de Tris 2M pH 7,0; 3,1mL de lipasa pancretica; 0,3mL de taurocolato sdico; 0,5mL de CaCl2 0,1M; 5,85mL de sacarosa y 0,05gr de lisozima) e incubar a 37C durante 45min. Si se utiliza medio de crecimiento, centrifugar las colonias durante 5min a 3600g a 4C, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensin. Centrifugar durante 5min a 3600g a 4C y eliminar el sobrenadante. Resuspender en 1mL de solucin de prelisis e incubar a 37C durante 45min. 03.2006 www.cultek.com Pgina 4 de 4