SADE

AIDS
o incio da dcada de 80, diversos casos de Sarcoma de Kaposi e pneumonia foram diagnosticados em homossexuais e/ou usurios de drogas injetveis, nos Estados Unidos e na Europa, sem que um agente etiolgico definido fosse identificado. Todos os pacientes apresentavam um quadro de imunodeficincia celular severa, com uma resposta de linfcitos T reduzida. O termo SIDA, ou do ingls AIDS, (Sndrome da Imunodeficincia Adquirida) comeou ento a ser empregado para definir clinicamente as vrias manifestaes dessa doena. A dcada de 80 foi ento intitulada a dcada da AIDS, causando preocupao e temor doena. No entanto, dentro do seu quadro assustador, existia uma ponta de otimismo, de que, com o fim da dcada, terminaria tambm a AIDS. No final de 1982, os casos de AIDS nos Estados Unidos no estavam mais restritos aos homossexuais e usurios de drogas injetveis, mas atingiam tambm hemoflicos, pessoas que haviam realizado transfuses de sangue, crianas nascidas de mes contaminadas, prostitutas e parceiros de membros de grupo de risco. At ento, o causador da doena no havia sido identificado, mas demostrava ser um agente etiolgico transmissvel atravs do sangue e secrees genitais. Somente em 1983, Barr-Sinousi e colaboradores detectaram atividade da enzima transcriptase reversa no linfonodo de uma paciente que apresentava sndrome de linfoadenopatia persistente. Isso sugeriu que a AIDS pudesse ser causada por um retrovrus, o qual foi denominado inicialmente como Lymphoadenopathia Associated Virus. Durante

Universidade Federal do Rio de Janeiro Departamento de Gentica Laboratrio de Virologia Molecular

Elena Caride & Amilcar Tanuri

USO DA BIOTECNOLOGIA PARA O DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA VIVA ATENUADA MAIS SEGURA

todo o ano de 1983, e em parte de 1984, diversos pesquisadores estudaram esse novo vrus e novas classificaes lhe foram atribudas, como, por exemplo, HTLV-III. Mas, esse vrus possua caractersticas bem peculiares e bem diferentes daquelas observadas em retrovrus como o HTLV. Embora infectassem o mesmo tipo celular, linfcitos T CD4+, esse novo vrus mostrava altos nveis de partculas virais no sobrenadante das clulas infectadas e lise destas clulas. Finalmente, em 1986, o nome Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV) foi unificado para definir o vrus causador da AIDS. Mas somente em 1987 esse vrus foi classificado como membro de um subgrupo distinto no grupo dos retrovrus, o subgrupo dos lentivrus, os quais esto associados a infeces com longos perodos de latncia clnica. Assim, a dcada de 80 chegava ao fim e com ela a esperana de uma cura iminente. Onze anos mais tarde, a epidemia de AIDS continua a se expandir por todas as regies do mundo e em 1997 os casos notificados atingiam 30.000.000 de pessoas. Apesar dos esforos da comunidade cientfica e dos avanos j obtidos, a AIDS continua representando um grave problema de sade pblica, principalmente para os pases em desenvolvimento como no caso do Brasil, onde, em 1997, foram notificados 110.845 casos (UNIAIDS 1997). Em meados de 1998, j foram notificados 138.000 casos de AIDS e se estima que existam 550.000 pessoas infectadas com HIV no pas. Essa marcha aterradora do HIV demanda que todos os esforos sejam concentrados na pesquisa de uma vacina eficaz para o combate ao vrus. Essa

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seria uma importante arma para deter o avano da epidemia nos pases pobres. Diversas caractersticas do HIV devem ser levadas em considerao quando desenhamos uma estratgia para o desenvolvimento de uma vacina. Primeiro, sua variabilidade: como outros vrus de RNA, ele muta rapidamente, produzindo viroses antigenicamente heterogneas, mesmo dentro de um nico indivduo. Atualmente, existem identificados cinco subgrupos de vrus distintos e todos podem ser encontrados na frica. Segundo, seu modo de transmisso: o HIV transmitido atravs da mucosa pelo contato sexual, atravs do sangue contaminado e da me para o feto neonato. Embora a transmisso dos vrus na sua forma livre j tenha sido documentada, a forma de contgio mais comum deve ser pelo vrus associado clula do hospedeiro. Anticorpos neutralizantes devem ser suficientes para prevenir contra a infeco pelo HIV livre, mas no ao associado a uma clula, que no deve entrar em contato direto com o soro. Ou seja, o desenvolvimento racional de uma vacina deve ser baseado tanto em uma resposta imune humoral, como na resposta celular. Finalmente, sua clula alvo: infeces de linfcitos T e macrfagos, os alvos primrios do HIV, dependem da ligao das suas protenas do envelope, com as molculas de CD4 expressas nas superfcie dessas clulas. Outro aspecto importante quando se fala em vacinas para o HIV a avaliao de sua eficcia. A fim de se validar a eficcia de uma vacina antiHIV, necessrio que ela seja testada in vivo. Sendo assim, diversos modelos animais vm sendo testados, j que o modelo ideal seria um animal de manuteno barata e que desenvolva uma doena do tipo AIDS, induzida pelo HIV. No entanto, as nicas espcies que podem ser infectadas com o HIV so os grandes macacos, como o chimpanz e o gibo, mas estes no desenvolvem AIDS, alm de terem um custo elevado de manuteno. Nessa busca por um modelo animal, foi isolado e identificado um novo lentivrus que infecta primatas no humanos, o vrus da imunodeficincia simiana (SIV). Este possui uma alta homologia na sua seqncia de DNA com o do HIV, principalmente com o de tipo 2, indicando uma relao evolutiva bem prxima desses dois subgrupos. Esse vrus um agente infeccioso natural de diversos

Figura 1- Manipulao gentica do HIV. O material gentico do HIV constitudo por duas fitas de RNA polaridade positiva que esto associadas na sua extremidade 5 a uma molcula de tRNAlys. Ambas as fitas de RNA possuem 5CAP e poliadenilao. Ao longo do RNA, se encontram associados monmeros das protenas p7/9, que, por sua vez, interagem com as enzimas virais transcriptase reversa, integrase e protease p11. Esse complexo ribonucleoproteico circundado pela protena p24, formadora do capsdeo viral. No espao entre o capsdeo e o envelope, encontra-se a protena p17; esta miristilada no seu N terminal, o que promove sua interao com a protena do envelope gp41. O envelope constitudo por uma bicamada fosfolipdica de origem celular, onde esto inseridas as duas glicoprotenas de origem viral gp120 e gp41. Essas esto associadas no covalentemente, organizando-se em heterotrmeros ou tetrmeros na superfcie do vrion e so as responsveis pela interao com o antgeno de superfcie celular CD4. O genoma do HIV codifica para 3 genes estruturais principais: o gene gag, que codifica uma protena precursora de 55kDa, que, aps a clivagem, vai originar as protenas p17, p24 e p7/9, formadoras da matriz viral, do capsdeo e do nucleocapsdeo; o gene pol, que transcrito e traduzido juntamente com o gene gag em uma protena precursora de 160kDa, aps a clivagem, origina, alm das protena p17, p24 e p7/9, as enzimas virais transcriptase reversa, protease e integrase; o gene env codifica para uma protena precursora de 160kDa que, depois de clivada, origina as protenas gp120 e gp 41, que so as glicoprotenas formadoras do envelope viral. Alm desses genes, o genoma do HIV codifica para alguns genes acessrios e outros regulatrios, responsveis por uma srie de eventos como: transporte do mRNA viral para o citoplasma (REV), transduo de sinais na clula hospedeira (VPR), formao de canais inicos na membrana celular (VPU), ativao da transcrio dos genes estruturais(TAT), destruio dos receptores CD4 das clulas linfocitrias (NEF), etc. Em nossa estratgia de manipulao gentica, metade do gene nef foi substitudo pelo gene gpt da E. coli, que foi amplificado por uma reao de PCR e utilizado para substituir o gene viral deletado. O clone infectivo foi, ento, injetado dentro de clulas humanas e o novo vrus foi montado e exportado para fora da clula. Esse novo vrus foi nomeado de HIV-gpt.

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primatas no humanos africanos, mas, normalmente, ele no patognico nos seus hospedeiros. No entanto, alguns, quando isolados, induzem uma doena do tipo AIDS em certos macacos asiticos, caracterizada por uma depleo de linfcitos CD4, imunodeficincia, infeces com agentes oportunistas e tumores. Sendo assim, o SIV um modelo animal prtico para a pesquisa de uma vacina contra o HIV e algum progresso j tem sido alcanado com diferentes prottipos vacinais. Macacos imunizados com vrus completos inativos ou com vacinas que continham subunidades do vrus resistiram infeco com SIV patognicos. No entanto, em muitas tentativas de vacinas feitas nos ltimos anos, no foi possvel induzir uma imunidade duradoura e nenhuma proteo foi conseguida contra isolados de vrus heterlogos, infeces com altas cargas virais ou ainda vrus que no tivessem sido propagados em linhagens celulares humanas. A fim de superar esses problemas, ultimamente vm sendo conduzidos diversos estudos de vacina utilizando vrus vivos atenuados. Vrus atenuados tem sua patogenia reduzida causada primariamente pela sua baixa capacidade replicativa no seu hospedeiro natural. Idealmente, eles no causam a doena, mas induzem a uma resposta imune potente, protegendo o hospedeiro contra uma infeco subseqente com o vrus selvagem. Foi demonstrado que a deleo do gene nef no SIV reduz sua patogenia. Macacos Rhesus infectados com SIV atenuados por meio de mutaes no gene nef ficaram protegidos contra uma nova infeco utilizando altas doses de SIV selvagem. A protena Nef uma protena miristilada, encontrada somente em lentivrus de primatas. O seu mecanismo de ao ainda
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no bem compreendido, mas diversas evidncias apontam para um papel na modulao da transduo de sinais celulares, via interaes fsicas com protenas quinase da clula hospedeira. Apesar de esse tipo de estratgia de utilizar vrus vivos atenuados haver demonstrado resultados mais expressivos na tentativa de uma vacina contra AIDS, esse modelo ainda muito criticado, j que esses vrus tm uma taxa de mutao, e de recombinao com outros vrus muito alta, podendo levar a alteraes genticas que faam com que um vrus no patognico torne-se patognico. Recentemente foi descoberto na Austrlia um caso de transmisso sangnea de HIV muito interessante: um doador estava infectado com um vrus que continha uma deleo no gene nef e por doao de plasma infectou vrios receptores. Tanto o doador como os receptores no desenvolveram a doena. Esse fato inusitado foi mais uma forte evidncia de que o gene nef tambm est implicado com a patognese no HIV e isso deu um grande nimo aos preconizadores desse tipo de vacina anti-HIV. Nosso grupo vem-se dedicando ao desenvolvimento de uma cepa de HIV atenuada para uma possvel vacina. Alm da atenuao pela retirada do gene nef do genoma do HIV, preocupamo-nos em inserir um gene suicida no genoma viral. A razo de se colocar um gene suicida na amostra vacinal seria para abolir a infeco da amostra vacinal em caso de reverso virulenta. O gene suicida escolhido foi o gpt (guanina fosfo-ribosil transferase) e foi doado do cromossoma da bactria intestinal E.coli. O gene gpt codifica uma enzima que capaz de metabolizar uma droga txica para as clulas humanas. Nesse caso especfico, a 6-

Figura 2- Aborto da infeco de linfcitos humanos pelo HIV-gpt. O vrus HIV-gpt foi utilizado para iniciar uma infeco em uma cultura de linfcitos humanos, na presena e na ausncia de 6-tioxantina. Quando a droga era adicionada cultura, a enzima gpt, expressa nos linfcitos, era metabolizada e as clulas infectadas destrudas e, assim, a infeco abortada.

tioxantina que, normalmente, a clula humana no consegue metabolizar, mas, quando infectada com o novo HIV recombinante, incorpora esse produto txico no cromossoma e inviabiliza a clula infectada. Assim, utilizando-se uma cpia de cDNA do genoma do HIV clonado em um plasmdeo (clone infectivo) foi feita uma manipulao onde se retirou o gene nef e se colocou no lugar o gene gpt da E.coli (vide Fig. 1). Esse novo vrus agora conseguia replicar em linfcitos humanos, mas, na presena de 6-tioxantina, era totalmente eliminado (vide Fig 2). Dessa forma, achamos que esses resultados demonstram a utilidade desses novos vrus para uma vacina anti-HIV mais segura e eficiente, alm de abrir portas para um ensaio em macacos. O mesmo gene suicida est sendo inserido no genoma de SIV para tentarmos essa mesma experincia in vivo.