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Los medios de cultivo en microbiologa Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias

artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas). Condiciones generales para el cultivo de microorganismos El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. 3- PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXGENO Y OTROS GASES Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias

(tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. 6- TEMPERATURA Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. 7- ESTERILIDAD DEL MEDIO Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante) La evolucin de los medios de cultivo Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agaragar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos.

CLASIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO: Segn su proporcin de agua: MEDIOS SLIDOS: contienen una proporcin de agar por encima del 15%. El agar es una sustancia inerte, polisacrido de algas marinas. Sirve de soporte Ej: agar nutritivo, Triptena soya MEDIOS LIQUIDOS: llamados caldos, contienen nutrientes en solucin tamponada. Ej: caldo nutritivo, caldo tioglicolato MEDIOS SEMISOLIDOS: la concentracin de agar-agar es baja.

Ej: medio de transporte( Stuart; Cary-Blair ) Medio de movilidad SIM MEDIOS BIFASICOS: son los que tienen una fase lquida y una fase slida se utilizan para la recuperacin de microorganismos. Ej: Medio de Ruiz Castaeda para Brucella spp SEGN SU UTILIDAD: Medios de aislamiento: MEDIO ENRIQUECIDO: son aquellos a los que se les adicionan sustancias que los hacen ms ricos en elementos nutrientes, permitiendo el crecimiento de bacterias ms exigentes que no crecen en medios comunes. Ej: agar sangre-agar chocolate MEDIO SELECTIVO: Son medios slidos que contienen sustancias inhibidoras de las bacterias que forman parte de la flora normal, permitiendo el desarrollo solo de las bacterias que nos interesan aislar. La selectividad se debe al agregado de colorantes, sales en altas concentraciones o antimicrobianos. Ej: agar de Thayer- Martin( para N gonorroheae con antimicrobianos); Agar SS para Salmonella y Shigella ( con sales biliares y citrato). MEDIOS DIFERENCIALES: Son medios que contienen sustrato sobre los que actan determinados microorganismos demostrando alguna de sus propiedades metablicas. Se utilizan para la identificacin bacteriana. Ej: Levine o EMB ( eosina azul de metileno) este medio contiene lactosa permitiendo diferenciar las bacterias que fermentan de las que no. Las colonias que fermentan se ven rojas y las que no transparentes o rosas.

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: Son medios lquidos que favorecen el crecimiento de ciertas bacterias presentes en baja densidad en una muestra clnicas que inhiben transitoriamente otras, presentes en las misma que pueden ser no patgenas. Se utilizan frecuentemente para la siembra de materia fecal, manteniendo el desarrollo de bacterias entricas en fase de retardo (inhibiendo) y favoreciendo solo la multiplicacin de bacterias que son enteropatgenas. (Salmonella spp, Shigella spp) Ej: Caldo Selenito MEDIOS DE TRANSPORTE: Son los que permiten preservar la viabilidad del microorganismos hasta que la muestra sea procesada en el laboratorio. Son medios inertes, no tienen factores de crecimiento por lo que las bacterias no se multiplican. Se utilizan cuando el tiempo entre la recoleccin y el cultivo de la muestra supera las dos horas o cuando el m.o a investigar es muy lbil. Ej: Cary- Blair, Stuart; Tab

MEDIOS ESPECIALES:

Son los que se utilizan para aquellas bacterias que tienen requerimientos nutricionales y metablicos especiales para su desarrollo. Ej: Lowestein Jensen ( Mycobacterium tuberculosis) Medio de Loeffler (Corynebacterium diphtheriae CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVOS Control de esterilidad:

Para verificar la esterilidad del medio, incubar en estufa de 35 C durante 24 hs. (agar sangre 24hs en estufa a 35C, 24 hs a T ambiente ) Control de pH:

Controlar el pH de cada lote. Control de profundidad del agar.

De tres a cinco mm ( Mueller Hinton 4 mm ) Cepas patrones para control de calidad:

Agar sangre: Streptococcus pneumoniae ; Streptococcus pyogenes. Agar chocolate: Haemophilus influenzae Cepas patrones para control de calidad:

Agar Mueller Hinton : Enterococcus faecalis ATCC 29212 para controlar los niveles de timina o timidina. Bateria de identificacin de enterobacterias: ( TSI, CITRATO, UREA ,SIM, FA) Escherichia coli, Proteus mirabilis

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