La manipolazione della cellula vegetale:

le tecniche non convenzionali

Colture in vitro

Ingegneria cellulare
Le conoscenze attuali
sulle colture in vitro
permettono la selezione
di mutanti,
l’ottenimento di linee
aplodiploidi dalla coltura
di gametofiti maschili e
femminili, la produzione
di ibridi somatici
tramite la fusione di
protoplasti, la capacità
di rigenerare piante
dalle cellule manipolate,
la rapida moltiplicazione
clonale delle piante
rigenerate, e l’uso di
cellule e protoplasti per
la tecnologia del DNA
ricombinante e
l’ottenimento di piante
geneticamente
modificate.
 Totipotenza cellulare
Concetto divulgato dal 1858 da VIRCHOW con il
celebre aforisma “omnis cellula ex cellula”

organogenesis La capacità della cellula

vegetale di passare da uno
stato differenziato ad uno
sdifferenziato e viceversa
Laboratory
There are many textbooks describing very sophisticated laboratory systems for plant cell
cultures. However, it is not always necessary to design special laboratories for this
technology, but general microbiology laboratories can be used, although aseptic conditions are
a prerequisite for incubation of plant cells as well as microbial cultures.
The following equipment is required:
Laminar air flow cabinets: The cabinets are commercially available in different sizes. They
are placed in the laboratory where needed. If there is a sterile room, the cabinets are not
always necessary.
Autoclave: Autoclaves in different sizes are commercially available.
Oven for dry sterilization: Although autoclaves can be used for dry sterilization, an oven is
useful for sterilization of scalpels and glass-wares such as petri-dishes, pipets and others.
Equipment for sterilization by filtration: The medium containing carbon sources and growth
regulators are simultaneously sterilized using a autoclave but sometimes aseptic filtration is
favorable to avoid decomposition of unstable chemicals. The equipment is also commercially
available.
Water distillation apparatus or pure water demineralizer: To prepare media, distilled water
or deionized water is generally used although tap water can be used particularly in large-scale
cultivation of plant cells in a large fermentor from an economical point of view.
Culture rooms and/or Cabinets: To cultivate the plant cells, culture rooms under different
temperature or and/or cabinet-type incubators are essential facilities. Temperature and light
intensity as well as a duration of lighting in the room and/or in the cabinet are controlled
under the optimal conditions.
Shelves: Shelves built from rigid wire mesh to allow maximum air movement and minimize
shading should be used in the culture room.
Shakers: A rotary shaker or a reciprocal shaker is necessary for suspension cultures.
 Terreni di coltura per cellule vegetali

Costituenti di base:

•MACROELEMENTI (Solfati, fosfati, cloruri; Calcio, Magnesio, Potassio, Sodio,

Ferro).
•MICROELEMENTI (Boro, Zinco, Molibdeno, Iodio, rame, Na2EDTA).

•COMPOSTI ORGANICI (Zuccheri - saccarosio -; Vitamine - tiamina, piridoxina,

acido nicotinico, biotina, ecc.).

•FITOREGOLATORI O ORMONI DELLA CRESCITA.

 Sam

ACS

Ac. 1 amino ACCox

ciclopropano 1
carbossilico

Ormoni vegetali
Gli ormoni più usati in
coltura in vitro: auxine e
citochinine

++

Vasil and Hildebrandt, 1965: 1 dimostrazione

della totipotenza della cellula vegetale.
 Tecniche di coltura in vitro

callo

protoplasti cellule in
sospensione
 Callo: coltura di cellule
sdifferenziate,
eterogenee, non sincrone
nella crescita

Espianti di tessuto provenienti da varie parti della pianta

vengono indotti a proliferare attraverso una rapida divisione
cellulare in una massa disorganizzata, il callo (fase di
sdifferenziazione). Si mantiene in coltura su un appropriato
terreno di base ricco soprattutto in auxine e/o citochinine.
In certi casi il callo può venire propagato come tale per
lunghi periodi senza perdere totipotenza.
Le colture di callo
costituiscono il materiale da
cui derivano le colture in
sospensione di singole cellule.
A questo scopo un frammento
di callo è trasferito in un
mezzo di coltura liquido
all’interno di una beuta o
fiasca di coltura posta su uno
shaker. Infatti le cellule in
sospensione necessitano di
una continua agitazione che
permette loro una migliore
ossigenazione. I tempi
richiesti per ottenere una
buona sospensione cellulare
variano in dipendenza dalla
specie e dalla composizione
del mezzo di coltura.
Una coltura di cellule in
sospensione consiste di una
miscela di aggregati di cellule,
gruppi di cellule o cellule
singole e il tasso di crescita è
in genere superiore rispetto a
quello che si ottiene coltivando
lo stesso tipo di cellule su un
mezzo solido. Poiché ogni
gruppo di cellule o una singola
cellula è circondata
completamente dal mezzo
nutritivo il materiale che
costituisce una coltura in
sospensione è più uniforme
fisiologicamente.
 Con trasferimenti controllati
su mezzo fresco è possibile
ottenere colture di cellule
cells

sincronizzate nella crescita.

time
Le cellule in sospensione si
preferiscono al callo per
esperimenti biochimici sulla cinetica
d’induzione di determinati enzimi,
per studi di espressione genica, per
studi sul metabolismo di composti
secondari, per la selezione di
mutanti.
Protoplasti: introdotti da Hanstein nel 1880, sono cellule vegetali prive di
parete. Si possono ottenere da cellule parenchimatiche con pareti non lignificate, da
endosperma, da coleottili, da radici primarie, e radici mature, da noduli radicali, da
tuberi, da callo, da petali, da microspore. Ma la sorgente più comune e con maggiore
resa è rappresentata da tessuto fogliare.
Isolamento di protoplasti da tessuto
fogliare (Cocking, 1960).
•Sterilizzazione con detergenti blandi e
ipoclorito commerciale a basse dosi.
•Rimozione dell’epidermide (processo di
peeling) e frammentazione
•Incubazione in un mezzo contenente
enzimi che digeriscono la parete delle
cellule vegetali (drisilasi, pectinasi,
cellulasi)
•Incubazione al buio a 27-28°C per
tutta la notte
•Rimozione della soluzione enzimatica ed
incubazione delle cellule in un mezzo
ricco di sali e zuccheri (mezzo osmotico)
per il rilascio dei protoplasti
•Centrifugazione in gradienti di
saccarosio
•Colture successive dei protoplasti in un
mezzo a concentrazioni decrescenti di
zuccheri per lo sviluppo di colonie a
partire dalla singola cellula. I
protoplasti in questa fase
ricostituiscono la parete cellulare.
USO DEI PROTOPLASTI
La mancanza di una parete rende i protoplasti
un sistema adatto a molti studi sia di base che
applicati.

•Trasformazione genetica

•Clonaggio cellulare e isolamento di mutanti

•Isolamento di organuli citoplasmatici

•Studi di membrana (meccanismi di

trasporto)

•Studio del meccanismo d'azione degli

ormoni

•Studio dei meccanismi d'infezione

batterica, virale e fungina (necessari per la
messa a punto delle tecniche di selezione di
cellule e piante resistenti).
Ibridazione somatica
•Combinazione di geni distanti
•Selezione di geni
citoplasmatici
Implica 5 fasi:

1. Isolamento

2. Fusione

3. Selezione degli ibridi

4. Rigenerazione

5. Analisi delle piante rigenerate

 Fusione: i protoplasti sono
caricati negativamente per
cui devono essere indotti a
fondersi. La fusione avviene
in seguito ad una reazione
di agglutinazione a cui
segue l’adesione tra
membrane e l’instaurarsi di
5’ 7’ ponti intercellulari.

La fusione può essere

indotta con vari metodi
che differiscono in base
10’ 40’ all’agente fusogeno usato.

Agenti fusogeni: nitrato di sodio, condizioni di alto pH, alta

concentrazione di ioni Ca++, uso di gelatine, di poli-
etilenglicole (PEG), di stimolazioni elettriche.
 Stimolazione elettrica

In una camera di perspex della

capacità di 1 ml viene posizionato un
vetrino con i protoplasti delle due
specie, coperto con coprioggetto e
soggetto a stimolazione elettrica:
l’applicazione di impulsi elettrici di 5-
12 µamp per 1-5 msec, provoca uno
shock istantaneo tra le cellule che si
collassano in seguito ad un
cambiamento transitorio nello stato
di membrana e fondono
istantaneamente.
Selezione degli ibridi

Può essere effettuata in base a

complementazione fisiologica di funzione.
 Radici (più auxine)

Rusticae Repandae
Nudicaules
Genuinae

TrigonophyllaeUndulatae Suaveolentes
Paniculatae

Noctiflorae
Thyrsiflorae
PRE-RUSTICA

PRE-PETUNIOIDES Alatae Bigelovianae

PRE-TABACUM PETUNIOID
Tomentosae CESTROID

PRE-NICOTIANA Acuminatae

PRE-CESTRUM PRE-PETUNIA
MODERN MODERN PRE- ANCESTRAl
24-PAIRED 12 PAIRED SUBGENERIC NICOTIANA
LEVEL LEVEL AGGREGATESCOMPLEX PREGENERIC RESERVOIR

Germogli
(più
Bogani et al., 1985 citochinine)
Bogani et al., 1997
 Uso di mutanti
per un carattere

Complementazione genetica

Uso di doppi mutanti

Selezione visiva
fluoresceina isotiocianato

rodamina isotiocianato
 Nella fusione di protoplasti è
possibile ottenere ibridi
interspecifici ed
intraspecifici.

Si possono ottenere ibridi

intergenerici.

Che tipo di ibridi?

ibridi nucleari

ibridi citoplasmatici (Cibridi) ambedue gli eventi

 VANTAGGI DELL’IBRIDAZIONE SOMATICA

•Ottenimento di bridi tra specie non sessualmente

compatibili.
•Ottenimento di ibridi asimmetrici (eterocarion,
unicarion, uniplasmon, eteroplasmon). Con l’ottenimento
dei Cibridi si facilita il trasferimento di elementi
genetici extranucleari.
•Ottenimento di ibridi eterozigoti per geni extranucleari
 Analisi degli ibridi

conferma del carattere ibrido

allo stadio di cellula

metodi biochimici (marcatori isoenzimatici, analisi di

proteine) o molecolari (ad esempio utilizzando marcatori
molecolari (i più usati: microsatelliti, scar).

sulle piante rigenerate

analisi biochimiche e molecolari,

uso di criteri morfologici, o ci si può basare su caratteristiche
vegetative e di sviluppo (fase giovanile, fase adulta, lunghezza
del ciclo vitale, epoca di fioritura e di maturazione dei frutti,
etc.)
 Germoplasma

varietà incroci mutanti

coltura di antere

Rigeneranti

Riproduzione Allevamento dei rigeneranti

come donatori di antere

Allevamento per
valutazione Allevamento degli elementi più validi
in campo per alcuni caratteri agronomici

Valutazione in campo

Prove agronomiche in ambienti diversi

Varietà