ESTUDO DA VIABILIDADE E DO CRESCIMENTO DE LEVEDURAS PRODUTORAS DE ETANOL

Marilha A. Ortiz*, Thiago Neitzel**, Patrcia R.Silva***,Cristiane V. Helm****,Washington Luiz Esteves Magalhes*****,Edson A. de Lima******,Lorena B. B. Tavares*******
*Engenheira Ambiental, Mestranda em Engenharia Ambiental, Universidade Regional de Blumenau (FURB). ortiz.marilha@gmail.com **Estagirio da EMBRAPA FLORESTAS, Estudante de Graduao em Engenharia Qumica, Universidade Regional de Blumenau (FURB). thiago.neitzel@gmail.com ***Engenheira Qumica, Doutora em Engenharia (Embrapa Florestas). patricia.silva@cnpf.embrapa.br ****Qumica Industrial, Doutora em Cincia dos Alimentos (Embrapa Florestas). cristiane@cnpf.embrapa.br *****Engenheiro Qumico, Doutor em Cincia e Engenharia dos Materiais (Embrapa Florestas). wmagalha@cnpf.embrapa.br ******Licenciado em Cincias Agrcolas, Doutor em Produo Vegetal (Embrapa Florestas). edson@cnpf.embrapa.br ********Engenheira Qumica, Doutora em Tecnologia Bioqumico Farmacutica. Departamento de Engenharia Qumica - Universidade Regional de Blumenau (FURB). lorena@furb.br

Resumo Motivado pelo crescente incentivo produo dos biocombustveis no pas e no mundo, este trabalho visa fornecer subsdios para um projeto de pesquisa voltado ao estudo da produo de etanol a partir de biomassa lignocelulsica. No presente artigo so apresentados resultados preliminares de avaliao da etapa de multiplicao de leveduras responsveis pela fermentao de acares em etanol. Duas cepas de Saccharomyces cerevisiae foram avaliadas com relao a seu crescimento em meio YPD lquido em temperatura de 30 C e 150 rpm, durante um perodo de 24 horas. Foram empregadas medidas de densidade tica, para determinao da concentrao celular, e de contagem em cmara de Neubauer, para acompanhamento da viabilidade celular. O meio mostrou-se adequado para cultivo das leveduras e, com base nas informaes cinticas levantadas, foi possvel estimar o tempo adequado para produo do inculo e a cepa mais atrativa para as condies testadas. Foram encontradas velocidades especficas mximas de crescimento entre 0,21 e 0,53 h -1 e tempos de gerao entre 1,3 e 2,3 h.

Abstract Study of viability and growth kinetics of ethanol-producing yeasts Due to the increasing incentive for biofuel production all over the world, this work aims to provide basic information for a research project focused on studying the production of ethanol from lignocellulosic biomass. In this paper we present preliminary results related to growth behavior of yeast strains, in order to be further used for fermentation of sugars into ethanol. Two strains of Saccharomyces cerevisiae were evaluated with regard to their growth in liquid YPD at 30 C and 150 rpm, for 24 hours. Optical density measurements were performed for determining cell mass concentration, while cell viability was monitored using a Neubauer counting chamber. Growth medium proved to be suitable for cultivation of yeasts. Based on kinetic informations, an appropriate time for yeast inoculum preparation could be estimated, as well as the most efficient strain under the tested conditions. Maximum specific growth rates were found to be in the range of 0.21 and 0.53 h -1 and generation times were between 1.3 and 2.3 h.

INTRODUO O avano das pesquisas relacionadas produo de biocombustveis estratgico para o Brasil e ser decisivo para promover o desenvolvimento sustentvel do planeta e garantir a segurana energtica do pas. Neste contexto, o etanol tem sido uma das quatro reas prioritrias de trabalho contempladas pelo Plano Nacional de Agroenergia 2006-2011 (MAPA, 2006). A produo mundial deste biocombustvel baseia-se principalmente no uso de matrias-primas aucaradas (como a cana-de-acar no Brasil) ou amilceas (como o milho nos Estados Unidos), porm

matrias-primas lignocelulsicas tambm podem ser utilizadas e tem sido cada vez mais estudadas para esta finalidade. Independentemente da fonte de monossacardeos que ser empregada, estes acares podem ser convertidos a etanol por meio de um processo de fermentao. Para esta operao biotecnolgica, podem ser utilizados diversos tipos de microorganismos, sendo as leveduras Saccharomyces cerevisiae as mais comumente empregadas (BNDES, 2008). O conhecimento das fases de multiplicao celular fundamental para o sucesso da produo de etanol, j que o microorganismo deve ser adicionado ao meio de fermentao em quantidade e condio de crescimento adequadas. Com base no acompanhamento temporal das concentraes de biomassa produzida e de substrato consumido possvel determinar parmetros cinticos do crescimento, tais como a velocidade especfica de crescimento e o tempo de gerao. O presente estudo faz parte de um projeto de pesquisa conduzido pelas instituies FURB e Embrapa Florestas e que tem como foco principal a produo de etanol a partir de biomassa florestal pr-tratada, no qual esto sendo estudadas as operaes de pr-tratamento, hidrlise enzimtica e fermentao. Este trabalho especfico teve como objetivo conhecer o desempenho de duas cepas de leveduras produtoras de etanol quanto capacidade de multiplicao celular e sua caracterizao com base na viabilidade celular e em parmetros cinticos como a velocidade especfica mxima de crescimento. Estes resultados fornecero subsdios para selecionar cepas mais adequadas e estabelecer o procedimento de preparo e coleta de inculo para estudos futuros de fermentao.

MATERIAIS E MTODOS Leveduras Para a realizao deste estudo comparativo, foram utilizadas duas leveduras distintas. A levedura comercial Pilsen, uma Saccharomyces cerevisiae liofilizada, cedida pela empresa SCHINCHARIOL Cervejaria Eisenbahn (Cepa LEB001), localizada em Blumenau, Santa Catarina e a FERMOL MILLENNIUM DESTILLER I (Cepa LEB002), adquirida da empresa AEB Bioqumica Latino Americana S/A. Estudo cintico O meio de cultivo foi constitudo do meio YPD Lquido (200 mL) composto pelos seguintes componentes em (g/L): 20 g de glicose, 10 g de extrato de levedura e 20 g de peptona bacteriolgica. O meio YPD foi colocado em Erlenmeyer (500 mL) e teve o pH ajustado para 4,94 com soluo HCl 2N, sendo posteriormente esterilizado em autoclave a 121 C durante 15 minutos. Em Cmara de Fluxo Laminar, foram inoculados 1 g/L de leveduras utilizando as seguintes massas: 0,5 g de levedura da cepa LEB001 e 0,2 g de levedura da cepa LEB002. Aps a inoculao, os frascos foram colocados em incubadora com agitao orbital a 30C e 150 rpm, em duplicata, para cada linhagem. Foram retiradas amostras em perodos aleatrios ao longo de 24 horas com volume de 2 mL. Logo aps a coleta as amostras foram analisadas quanto concentrao de clulas viveis em cmara de Neubauer (leveduras/mL) e concentrao celular por espectrofotometria (densidade ptica) com 600 nm. Clculo da massa seca da cepa LEB001 A cepa LEB001 foi cedida na forma de uma massa mida obtida por secagem a vcuo. Portanto, foi realizada a remoo da umidade dessa massa colocando-se exatamente 1,0 g de material mido em vidro de relgio seco, tarado e em triplicata. Os mesmos foram colocados em estufa a 40 C 1C at peso constante. Os dados mostraram que 2,5 g de massa mida equivalem a 1,0 g de levedura seca. Determinao da curva de calibrao de concentrao celular Em balo volumtrico (100 ml) foram adicionados 1g/L de levedura das cepas LEB 001 e 002 individualmente, em soluo NaCl (0,85%). A suspenso das mesmas foi distribuda em tubos de ensaio com

gua (Tabela 1) e realizada a leitura em espectrofotmetro a 600 nm. Com os dados obtidos foi realizada a regresso dos mesmos gerando a equao da curva de calibrao. Tabela 1. Valores das diluies utilizadas para a Curva de Calibrao Table1. Values of the dilutions for the calibration curve standards Tubo de Suspenso gua Concentrao Ensaio (mL) (mL) (mg/L) 1 1,0 9,0 100 2 2,0 8,0 200 3 2,5 7,5 250 4 3,0 7,0 300 5 4,0 6,0 400 6 5,0 5,0 500 7 6,0 4,0 600 8 7,0 3,0 700 9 8,0 2,0 800 10 9,0 1,0 900 11 10,0 0,0 1000 12-branco 0,0 10,0 0,0 Determinao de densidade ptica A leitura da densidade ptica das amostras foi realizada em espectrofotmetro modelo UV-1650pc do fabricante SHIMADZU com feixe de luz ajustado para 600 nm, feita com diluies de 1 mL de amostra de cada tempo de amostragem em diferentes quantidades de gua destilada. As diferentes quantidades de gua so necessrias para que os valores de absorbncia estejam adequados conforme curva de calibrao de cada levedura. Contagem de leveduras viveis Para a contagem das leveduras viveis ao longo das 24 horas de cultivo foi utilizada a cmara de Neubauer em microscpio tico modelo Q720AD do fabricante QUIMIS, acoplado a um computador para captura de imagens feita pelo software Motic Image Plus 2.0. A amostra (meio YPD e leveduras) foi colocada em presena de uma soluo de azul de metileno e posteriormente depositada na cmara para a contagem de clulas viveis no quadrante "C" (figura 1).

Figura 1: Cmara de Neubauer Figure 1: Neubauer Chamber Fonte: Bernardo de Almeida Halfeld Vieira ,2006. Pela figura 1 contata-se que os quadrantes apresentam subdivises, fazendo com que o critrio para escolha do quadrante onde sero contadas as clulas, seja a dimenso destas. Para a contagem de clulas totais de

cada levedura foram considerados os 5 quadrantes c (minsculo) que formam uma diagonal de campus da cmara C (maisculo). A alquota colocada na cmara foi preparada usando 0,1mL de cada amostra e 1mL de azul de metileno. O azul de metileno, alm de ter a finalidade de diluir a amostra, tambm tem a funo de colorir as clulas no viveis. Para determinar o nmero de clulas por mL, foi usado o seguinte clculo (equao 1):

(1)

Onde: (Xv)m = concentrao total de clulas no meio (clulas/mL) Nt = nmero total de clulas nos 5 campos da cmera de Neubauer Nc = nmero de campos contados = 5 Vc = volume de um campo da cmara de Neubauer = 4 x 10-6 mL FD = fator de diluio empregado FD = ((Vsoluo de azul de metileno + Vamostra) /Vamostra)

Medida de pH do meio A leitura do pH das amostras (tempo inicial e final) foi realizada empregando pHmetro digital modelo PG1800 do fabricante GEHAKA. Os valores obtidos foram analisados pelo teste de mdias Tukey com 5% de probabilidade. Determinao do tempo de gerao e da velocidade especfica mxima de crescimento (mx) A deteco da fase de crescimento exponencial se deu pelo grfico ln X versus tempo para diferentes limites iniciais e finais de tempo. O melhor coeficiente de correlao indicou o incio e a durao da fase exponencial de crescimento e o coeficiente angular da melhor correlao forneceu o valor da velocidade especfica mxima de crescimento. Com o dado de velocidade especfica mxima de crescimento ( mx) foi determinado o tempo de gerao das cepas (tg), conforme a equao 2:

mx =

ln( 2) 0,693 = tg tg

(2)

RESULTADOS E DISCUSSES Curva de calibrao de concentrao celular Na figura 2 so apresentados os grficos e equaes da curva de calibrao para as cepas LEB 001 (A) e 002 (B). A. B.

Figura 2. Curva de calibrao para a cepa LEB 001 (A) e LEB 002 (B). Figure 2. Calibration curve for the LEB 001 (A) and LEB 002 (B) strain.

Curva de Crescimento Os valores obtidos das absorbncias das amostras contendo as leveduras das cepas LEB 001 e 002 ao longo de 24h foram utilizados nas respectivas equaes das curvas de calibrao a fim de obter a concentrao celular de cada amostra (tabela 2). Tabela 2. Concentrao celular por espectrofotometria das cepas LEB 001 e 002 ao longo de 24h Table 2. Cell density by spectrophotometric of the LEB 001 and 002 strains over 24 hrs LEB 001 LEB 002 Tempo (h) (g/L) (g/L) 0 1,00 1,99 2 1,58 4 0,98 6 2,25 6,76 8 2,57 8,36 12 3,19 7,90 20 5,45 11,02 22 6,62 9,93 7,73 24 10,57 Com os dados da tabela 2, calculou-se a velocidade mdia de crescimento das cepas. A cepa LEB 001 apresentou velocidade mdia de formao de massa celular de 0,28 g/L.h, enquanto a LEB 002 apresentou velocidade de 0,36 g/L.h, o que representaria 27 % a mais de massa celular dessa cepa ao final do cultivo em relao LEB 001. Tambm verificou-se que a cepa LEB 002 atingiu concentraes de 10 g/L ao final do cultivo, similares a outros estudos com linhagens de leveduras de uso em alambique (STROPPA et al., 2009). Esses dados mostram maior adaptao da LEB 002 ao meio e s condies particulares de cultivo propostos, comparativamente LEB 001, que usual para a produo de cerveja Pilsen. Na figura 3, pode-se observar o perfil cintico da produo de massa celular das cepas LEB 001 e 002 ao longo de 24 horas. Constatou-se que a cepa LEB 001 no apresentou perfil de crescimento segundo as fases do modelo de cultivo em batelada simples (sistema descontnuo), que caracterizada por uma fase de adaptao das leveduras, seguida da fase de inicio de multiplicao, uma fase de crescimento com velocidade mxima e constante com posterior fase de reduo da velocidade e, finalmente a fase estacionria de crescimento, em que o valor da variao da velocidade de multiplicao a mesma da fase de adaptao (SCHMIDELL et al., 2001). Por esse perfil, que tambm foi observado por Muller et al. (2007), o valor da velocidade especfica mxima da cepa LEB001 foi quase a metade do obtido para a cepa LEB 002 como pode ser verificado na tabela 3.

12 10 Conc.celular (g/L) 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 Tempo (horas) 25 30 LEB 001 LEB 002

Figura 3. Perfil da concentrao celular (g/L) das cepas LEB 001 e LEB 002 ao longo do cultivo Figure 3. Profile of cell concentration (g / L) LEB 001 and LEB 002 strains along the cultivation Os dados mx de ambas as cepas foram similares ao obtido por Stroppa et al. (2009), que tambm obtiveram correlaes elevadas (acima de 0,95) mostrando bom ajuste aos dados experimentais. Na tabela 3 tambm apresentado o valor do tempo de gerao. Se o valor de mx da cepa LEB 001 for aceito como verdadeiro, o tempo de gerao foi quase o dobro do valor da LEB 002. Stroppa et al. (2000) tambm estudaram a dinmica populacional de leveduras fermentativas em duas usinas de lcool no estado de So Paulo. Os isolados obtidos pelos autores apresentaram velocidades especficas mximas de crescimento situando-se entre 0,27 e 0,57 h-1. Oliveira et al. (2004) analisaram as caractersticas fermentativas de vrias linhagens dominantes de leveduras isoladas de alambiques e obtiveram valores de max entre 0,38 a 0,67 h-1, utilizando meio sinttico, com 40 g/L de glicose. Tabela 3. Valores de velocidade especfica mxima (max) e tempo de gerao (tg) das cepas LEB 001 e LEB 002 Table 3. Rate maximum specific growth (max) and generation time (tg) of the LEB 001 and 002 strains Cepa max tg LEB 001 LEB 002 (h-1) 0,2139 0,5309 (horas) 2,3 1,3

O menor tempo de gerao da cepa LEB002 tambm pode ser constatado pela inclinao da curva dos dados de perfil do nmero de leveduras obtido em contagem na cmara de Neubauer (Figura 4).

180 150 120 Leveduras/mL 90 60 30 0 0 5 10 15 20 Tempo (horas) LEB001 LEB002 25 30

Figura 4. Perfil do nmero de leveduras viveis (106/mL) das cepas LEB 001 e LEB 002 ao longo do cultivo Figure 4. Profile of the number of yeast cells (106/mL) of LEB 001 and LEB 002 strains along the cultivation Os resultados obtidos para o nmero de leveduras viveis das cepas estudadas foram calculados pela equao 1 empregando a cmara de Neubauer (Figura 5). As condies empregadas para a formao do inculo no proporcionaram a formao de clulas inviveis (colorao azul) ao longo do tempo at prximo das 20h de cultivo, quando menos de 5 leveduras por cmara foram observadas. Esse comportamento era esperado devido s caractersticas qumicas do meio YPD que prprio para multiplicao celular e no para a fermentao alcolica. Segundo Mueller et al. (2007) na fermentao alcolica, o principal responsvel pela diminuio da viabilidade celular o seu prprio produto, o etanol, cuja ao txica reflete-se na desorganizao da membrana citoplasmtica.

[A]

[B]

Figura 5. Imagens da Cmara de Neubauer com as leveduras das cepas LEB 001 (A) e LEB 002 (B) com a presena de uma levedura com indicativo de inviabilidade celular pela colorao azul (crculo vermelho) caracterstica do mtodo empregado. Figure 4. Images of the Neubauer count with the yeast strains LEB 001 (A) and LEB 002 (B) with the presence of a yeast cell indicating inviability of the blue color (red circle) characteristic of the method employed Quanto ao pH dos meios de produo de inoculo (YPD) das cepas LEB 001 e LEB 002 no apresentaram diferenas significativas segundo o teste de mdias Tukey, aps 24h. Tal fato pode ser decorrente do fato de a glicose consumida ser convertida para a fosforilao oxidativa e conseqente gerao de biomassa com baixa formao de cidos. Tabela 4. Valores de pH dos meios de cultivo das cepas LEB 001 e LEB 002. Table 4. pH values of the culture media of LEB 001 and LEB 002 strains.

Cepa LEB 001 LEB 002

pH inicial 4,49a 4,49a

pH final (24h) 4,80a 5,14a

Letras iguais na linha no diferem estatisticamente para p<0,05.

CONCLUSES O meio YPD foi adequado multiplicao celular, pois no inviabilizou as cepas. Os valores obtidos experimentalmente para max situam-se dentro da faixa de valores encontrados na literatura, sendo que a cepa LEB 002 apresentou o valor mais alto. O tempo para produo de inculo da LEB 002 pode ser 15 horas, quando o sistema est prximo de atingir a concentrao mxima. Concluiu-se, portanto, que a cepa LEB 002 a melhor linhagem de levedura em termos de max dentre as duas estudadas, pois seu crescimento foi mais rpido, o que uma caracterstica desejvel na etapa de propagao do fermento comercial. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem as bolsas concedidas pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - Embrapa Florestas (Colombo/PR) e a SCHINCHARIOL Cervejaria Eisenbhan por ceder a levedura para este estudo. REFERNCIAS

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