Extraccin y purificacin de ADN

Bioq. Florencia Longo

Laboratorio de Deteccin de OGM Instituto de Biotecnologa INTA

Pasos del Anlisis de OGMs

INFORME

Muestra

Extraccin de ADN

PCR

Preparacin de la muestra para la extraccin de ADN

Cantidad de muestra Grado de homogenizacin Tamao de partcula

Extraccin de ADN
Objetivo
Cantidad Integridad Pureza Ausencia de contaminaciones

PCR

Extraccin de ADN
Tener en cuenta
Tipo de muestra Target a analizar Grado de procesamiento de la muestra Tipo de anlisis requerido Resultados deseados

Extraccin de ADN
Tipo de muestras a analizar Alimentos Harinas Hojas

Semillas Granos

Extraccin de ADN
Granos Alta Alta Medianos Baja Sencillos Baja Caractersticas Calidad Cantidad Tamao frag.ADN Homogenizacin Protocolos extraccin Presencia de inhibidores Alimentos Baja Baja Pequeos Alta Complejos Mediana a alta

Extraccin de ADN de Alimentos

Distintos tratamientos
Fsico Qumico Enzimtico

Distintos y mltiples ingredientes

Cremas Salsas, especias Azcares Sales, etc.

Disminucin en la calidad y cantidad de ADN Presencia de inhibidores de PCR

Pasos de los mtodos de Extraccin de ADN

Pre-tratamiento
Neutralizacin (muestras cidas) Tratamiento con solventes orgnicos (grasas)

Lisis celular
Disrupcin mecnica Agente qumicos

Purificacin de ADN
Precipitacin Matrices (kits comerciales)

Extraccin de ADN Lisis celular

Detergentes SDS, CTAB EDTA Digestin enzimtica proteinasas, RNAsas, amilasas, etc

Purificacin de ADN Mtodos tradicionales

Extraccin para remover contaminantes
Fenol Cloroformo

Precipitacin

Sustancias co-precipitantes (CTAB, PVP)

Precipitacin final con Isopropanol y/o etanol

Purificacin de ADN Mtodos comerciales

Metodo basados en silica
Columnas de silica Agentes caotrpicos Elusin con isopropanol/etanol

ADN
ADN purificado

Eleccin del mtodo de extraccin

Tipo de muestra Target a detectar Grado de pureza requerida Cantidad de ADN Rendimiento Integridad requerida Presencia de inhibidores

Eleccin del mtodo de extraccin

Capacidades del laboratorio Cantidad de muestras a analizar Facilidades de uso Repetibilidad Aplicaciones Tiempo de anlisis Costos

Resultados de la extraccin
Incluir siempre CONTROLES
Negativos
Blanco de reactivos Blanco de muestras

Positivos
Muestras positivas

Chequeo de ausencia de inhibicin

Muestras positivas

Resultados de la extraccin
Resultado esperado
Falsos negativos
ADN degradado resultado del procesamiento ADN degradado resultado de la extraccin Presencia de inhibidores

Falsos positivos
Contaminaciones

Inhibidores de PCR
En los alimentos
Protenas Polisacridos Grasas Sales cidos

Mtodo de extraccin
Detergentes Fenol Residuos orgnicos EDTA Etanol Isopropanol Sales

Evaluacin del ADN extrado

Espectrofotometra (260/280 nm)
Evalo cantidad de ADN No evalo calidad

Electroforesis/ Bromuro de etidio

Evalo cantidad de ADN Evalo calidad (degradacin, presencia de RNA)

Evaluacin del ADN extrado

Fluorometra
Evalo cantidad No evalo calidad

PCR de genes endgenos

Evalo cantidad de ADN Evalo calidad Matrices con poco DNA

Muchas gracias por su atencin

Informacin de contacto
Laboratorio de Deteccin de OGMs Instituto de Biotecnologa INTA Contactos: Dr. Esteban Hopp Bioq. Florencia Longo Telfono: (54-11) 4621-1278/1447 E-mail: ehopp@cicv.inta.gov.ar flongo@cicv.inta.gov.ar